用于癌症治疗的调节smyd3转移酶的化合物的鉴定的制作方法

专利名称：用于癌症治疗的调节smyd3转移酶的化合物的鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及转录调节，更具体涉及甲基转移酶活性调节剂的鉴定，例如 视网膜母细胞瘤曱基化调节剂SMYD3 (也称为ZNFN3A1 )的鉴定。由于在 一些癌症类型中SMYD3上调，因此如此鉴定的SMYD3调节剂可能有用于 癌症的治疗，包括例如结肠直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌和乳腺癌的治疗。
背景技术：
近年来的分子研究显示细胞周期失调控是多种人类癌发生的基础(Sherr， C. J., Science 274, 1672-7 (1996))。大多数人类癌症涉及p53、朋7或p76基 因的基因变化，其中细胞周期失调控导致失控的细胞增殖(Hanahan, D. & Weinberg, R. A, Cell 100, 57-70 (2000); Sherr, C. J. & McCormick, F. Cancer Cell 2, 103-12(2002))。在细胞周期中，G"S交界期(G"S boundary)——在 此期间细胞周期中止，检查基因组的完整性，修复DNA损伤——对于维持 正常的细胞和基因性质是极为重要的。两个关键的信号途径，即p53和RBl， 通过调控多个下游基因参与Gl/S交界期的调节。通过反式激活蓄积的野生 型p53蛋白诱导p21Cipl，从而使含有DNA损伤的细胞中止在Gl/S交界期 (Sherr, C. J. & Roberts, J. M. Genes Dev 13, 1501-12 (1999))。 RBI基因是作为 家族性视网膜母细胞瘤的病源基因被分离的(Friend, S. H. et al. Nature 323， 643-6 (1986).; Fung, Y. K. et al. Science 236, 1657-61 (1987).; Lee, W. H. et al. Science 235, 1394-9 (1987)),它通过控制细胞周期的行进起肿瘤抑制剂的作 用。当细胞周期从G1期过渡到S期时，RBI由细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs)催化磷酸化而失活。磷酸化不足的RBI抑制激活物E2Fs——对DNA复制和细胞周期行进所需基因的表达进行调节的转录因子(Dannenberg, J. H.， et al., Genes Dev 14， 3051-64 (2000).; Sage, J. et al. Genes Dev 14, 3037-50(2000) ),上述抑制通过下述方式实现与它们的激活域直接相互作用，改变 与HDACs复合的染色质结构，以及将阻抑物复合物募集到位于应答基因启 动子区中的E2F结合位点(Weintraub, S. J.， et al" Nature 358， 259-61 (1992).; Sellers, W. R.， et al" Proc Natl Acad Sd U S A 92, 11544-8 (1995》。RBI被 CDK/细胞周期蛋白复合物如CDK4/细胞周期蛋白D磷酸化后使E2Fs解离， 后者反式激活下游基因，包括细胞周期蛋白E， c-Myb, CDK2和BCL2。此前本发明人报道，SMYD3对于组蛋白H3中的第4位赖氨酸(H3-K4) 具有二重和三重曱基转移酶活性，SMYD3的高表达对结肠直肠癌(CRC)和 肝细胞癌(HCC)细胞的增殖起关键作用(Hamamoto, R. et al" Nat Cell Biol 6, 731-40(2004)),这是因为SMYD3的过表达促进NIH3T3细胞生长以及在几 种癌细胞中内源性的SMYD3表达的敲低导致这些细胞的生长抑制和凋亡。 然而SMYD3过度表达促进细胞生长的明确机制尚不清楚。组蛋白的乙酰化、 磷酸化和/或曱基化修饰调节染色质结构，通过募集不同的分子而导致靶基因 的转录激活或失活。关于组蛋白赖氨酸的曱基化，H3-K4, H3-K36和H3-K79 修饰与通过从异染色质至常染色质的构象变化进行的转录激活有关(Im, H. et al.， J Biol Chem 278, 18346-52 (2003).; Bannister, A. J. et al" J Biol Chem 280: 17732-6 (2005).; Schneider, R. et al., Nat Cell Biol 6, 73-7 (2004))，而H3-K9, H3-K27和H4-K20的甲基化通过异染色质结构而导致转录抑制(Schotta， G. et al.， Genes Dev 18, 1251-62 (2004).; Nakayama, J. et al., Science 292, 110-3(2001) .; Kirmizis， A. et al. Genes Dev 18, 1592-605 (2004)).发明概述本发明至少部分基于一种新的RBI调节机制的发现，该机制是通过 SMYD3对第824位赖氨酸的曱基化。SMYD3 (又以其基因名称之为 "ZNFN3A1")是在大多数结肠直肠癌和肝细胞癌(参见例如WO 2003/027413),以及膀胱癌和乳腺癌中上调的组蛋白H3曱基转移酶。RBI的C末端区域与SMYD3的SET结构域相互作用。另外，在体内 和体外，SMYD3的表达增加提高CDK2/细胞周期蛋白E或CDK6/细胞周期 蛋白D3复合物对RBI的821/826和807/811位的磷酸化，后者进而提高HEK293细胞中E2F的转录活性。这些凄t据表明，在癌细胞中，SMYD3的 表达提高通过RB1修饰以及随后的E2F转录激活而促进细胞周期进行。本 文的发现提示了 RB1的调节背后的新机制。此外，本文的发现有助于对癌 发生的更好了解，尤其是对结肠直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌和乳腺癌的癌发 生的了解，从而促进针对这些肿瘤的新治疗策略的开发。因此，本发明的一个目的在于提供鉴定调节SMYD3对视网膜母细胞瘤 的曱基化的作用因子的方法，所述的方法包括(a) 在存在作用因子以及适合视网膜母细胞瘤肽曱基化的条件下，使具有 曱基转移酶活性的SMYD3多肽与待曱基化的视网膜母细胞瘤肽和辅因子接 触；(b) 检测视网膜母细胞瘤肽的曱基化水平；以及 水平进4于比净交，其中曱基化水平相比于对照水平的提高或降低提示所述作用因子调节 SMYD3对^L网膜母细胞瘤的曱基化。本发明的另 一个目的在于提供用于检测待测化合物调节视网膜母细胞 瘤曱基化的能力的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分(a)具有曱基转移酶活 性的SMYD3多肽；(b)能被SMYD3多肽曱基化的视网膜母细胞瘤肽，以及 (c)用于视网膜母细胞瘤肽曱基化的辅因子。在一个实施方式中，该试剂盒还 可选地包括S-腺苦高半胱氨酸水解酶(SAHH)。本发明还提供了用于筛选治疗癌症的化合物的方法，所述的癌症选自结 肠直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌和乳腺癌，该方法包含下列步骤(a)根据上述 方法鉴定调节曱基化的待测化合物，以及(b)选出与不存在待测化合物时的 对照曱基化水平相比，降低待曱基化底物的曱基化水平的待测化合物。本发明还提供了用于减轻癌症症状的组合物，所述的癌症选自直肠癌、 肝细胞癌、膀胱癌和乳腺癌，所述组合物包含药学有效量的以上鉴定的化合 物以及药学可接受的载体。本发明的另一个目的是提供用于减轻癌症症状的方法，所述的癌症选自 直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌和乳腺癌，包括使药学有效量的以上方法鉴定的 化合物与癌细胞接触的步骤结合附图、实施例和随附的权利要求来阅读下面的详述，将能更为充分 地明了本发明的这些和其它目标、特征和优点。除非有其它定义，本发明中的所有的技术和科学术语具有与本发明所属 领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。此外，除非有其它特别说明，文中所用的词语"a，，，"an，，和"the，，意味着"至少一种(个)，，。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实施和检验，对合适的方法和材料在此处下文中进行了描述。本申请引证本文中提及的所有的出版物、专利申请书、专利申请书和其它参考数据的全部内容。 一旦出现沖突，将以包括定义在内的本说明书为准。 材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不意图起限制作用。附图筒述

图1描述SMYD3对重组RB1蛋白的曱基转移酶活性。a部分描述曱基 转移酶体外活性的测定结果，所用的底物为重组组蛋白H3、 p53或RBl的 C末端区。将等量的底物与免疫沉淀的带Flag标签的SMYD3和曱基供体3H 标记的SAM孵育。用SDS-PAGE进行蛋白质分离。以焚光图i著4企测甲基化 底物。利用特异性抗体，对底物的总量用免疫印迹分析进行测定。b部分描 述重组SMYD3对于组蛋白H3和RB1蛋白C末端的剂量依赖的曱基转移酶 活性。c部分描述SMYD3对于RB1的C末端和RB1全长序列的甲基转移 酶活性(分别见泳道2和4)。含有保守氨基酸缺失的SMYD3突变体 (SMYD3AEEL)的甲基转移酶活性明显下降(见泳道3 )。图2体内SMYD3和RB1的締合。a部分描述免疫测定结果。具体地， 将以抗SMYD3抗体对HepG2或HCT116细胞的裂解物进行免疫沉淀而得到 的免疫沉淀物用RB1抗体进行免疫印迹。b部分描述HEK293细胞中野生型 和缺失型RB1(RB1A1和RB1A2)与SMYD3的相互作用。RB1的保守区域和 表达构建体如上图面所示。c部分描述负责与RB1相互作用的SMYD3区域。 SMYD3的保守区域和表达构建体如上图面所示。d部分描述在有/没有重组 RB1时SMYD3对组蛋白H3的体外曱基转移酶活性。组蛋白H3的曱基化 不被RB1影响(上图面)。使用等量的重组人组蛋白H3蛋白作为底物(下图 面)。e部分描述组蛋白H4-K20曱基化的体外分析。将免疫沉淀的SMYD3 蛋白或重组的SMYD3蛋白与作为底物的重组人组蛋白H4共同孵育。用免疫沉淀的Suv4-20h2蛋白作为阳性对照。用抗三甲基H4-K20抗体检测曱基 化的H4-K20。图3描述RB1的C末端区域中K824的曱基化。a部分为RB1保守域以 及C末端RB1蛋白的野生型和突变形式(K824A, K889A和K896A)的示意图。 b部分描述用放射自显影法检测SDS-PAGE分离的曱基化的C末端RB1。 c 部分描述用液体闪烁计数器测量的曱基转移酶活性。d部分描述重组野生型 和突变型形式的RB1蛋白的体外甲基化，所述的突变包括K791A， K814A, K824A, K791/K824A和K814/K824A。在3H标记的SAM存在时，将RBI 与重组SMYD3蛋白共同孵育。以SDS-PAGE分离曱基化的RB1，并用荧光 图加以检测。e部分描述以液体闪烁计数器检测的甲基化的RB1。 f部分描 述SMYD3对RB1第824位赖氨酸的二重和三重曱基化。在SMYD3存在或 缺如的条件下的甲基化野生型RB1蛋白以3H-BAS成像系统进行检测(上图 面)。使用抗二曱基化赖氨酸824抗体(第二图面)或抗三曱基化赖氨酸824抗 体(第三图面)对RB1蛋白进行Western印迹分析。利用抗RB1抗体确定RB1 的总量(第四图面)。图4描述SMYD3对RB1的体内曱基化作用。a部分描述SMYD3在 HEK-SMYD3 (HEK-SMYD3-1和HEK-SMYD3-2)细胞以及HEK-模拟(HEK-模拟-1和HEK-模拟-2)细胞(上图面)中的表达。b部分描述使用来自 HEK-SMYD3细胞和HEK-模拟细胞的抗RB1抗体免疫沉淀物，通过放射显 影法体内检测曱基化RB1 (上图面)。被免疫沉淀的RB1量没有变化。在蛋 白合成抑制剂存在条件下，以SH标记的SAM处理细胞。被免疫沉淀的RB1 量没有变化(下图面)。c部分描述利用抗泛曱基赖氨酸、抗二甲基赖氨酸824 和抗三曱基赖氨酸824的抗体，对被免疫沉淀的RB1蛋白的曱基化进行 Western印迹分析的结果。d-k部分描述用抗二曱基赖氨酸824(d)或抗三曱基 赖氨酸824(h)抗体对HEK293-SMYD3细胞的免疫细胞化学染色结果。e和i 部分描述以抗SMYD3抗体检测的SMYD3的表达。f和j部分描述以DAPI 进行核染色的结果。g和k部分构成d-f(g)或h-j(k)的合并图像。大量表达 SMYD3的细胞显示体内RB1的第824位赖氨酸的二曱基化和三曱基化水平 提南。图5 SMYD3对RB1磷酸化的提高。a部分描述在SMYD3存在或缺如 的条件下，CDK2/细胞周期蛋白E对C末端RB1的体外磷酸化。单独的SMYD3不能提高磷酸化。b部分描述在SMYD3存在或缺如的条件下，CDK6/ 细胞周期蛋白D3对C末端RB1的体外磷酸化。使用K824A取代的RB1抑 制了 SMYD3对RB1磷酸化的提高。c部分描述以野生型(Wt)和K824A突变 体(K824A)为底物，CDK2/细胞周期蛋白E对C末端RB1的体外磷酸化的比 较。d部分描述以Wt和K824A为底物，CDK6/细胞周期蛋白D3对C末端 RB1的体外磷酸化的比较。e部分描述在SMYD3存在条件下，CDK2/细胞 周期蛋白E或CDK6/细胞周期蛋白D3复合物增加Ser807/811和Thr821/826 的磷酸化。f部分描述在HEK-SMYD3细胞中Ser807/811和Thr821/826的磷 酸化比在HEK-模拟细胞中提高。表达外源性SMYD3的HEK293细胞的免 疫细胞化学染色。g部分描述应用抗磷酸RBl(Thr 821/826)抗体对细胞中的 磷酸化的RB1染色的结果。h部分描述SMYD3在细胞中的表达。i部分描 述用DAPI进行的核染色结果。j部分构成了 g-i的合并图像。表达SMYD3 的细胞在体内显示Thr821/826磷酸化^:高。图6描述SMYD3对RB1的曱基化以及对RB1磷酸化的提高。在a部 分中，从转染了野生型(p3xFlag-SMYD3)或突变型SMYD3质粒 (p3xFlag-SMYD3八EEL和p3xFlag-SMYD3ANHSC)的SNU475细胞中免疫沉 淀RB1蛋白。使用抗二甲基化赖氨酸824(最上图面)、抗三曱基化赖氨酸 824(第二图面)、抗磷酸丝氨酸807/811(第三图面)或抗磷酸苏氨酸821/824 (第 四图面)抗体对沉淀物进行Western印迹分析。以RB1抗体进行免疫印迹分 析作为数量对照(最下图面)。B部分描述在两种乳腺癌组织中赖氨酸824的 二曱基化和三曱基化以及Ser807/811和Thr821/826的磷酸化。使用抗二曱基 化赖氨酸824，抗三曱基化赖氨酸824,抗磷酸RB (Ser807/811)，或抗磷酸 RB(Thr821/824)抗体进行了 Western印迹分析。图7描述在HEK-SMYD3细胞中E2F的转录活性增加。用E2F-焚光素 酶载体转染HEK-SMYD3和HEK-模拟细胞24小时后测量荧光素酶的活性。 表达外源性SMYD3的HEK293细胞的免疫细胞化学染色。用抗磷酸RB1 (Thr 821/826)抗体对细胞中磷酸化的RB1进行染色。h部分描述SMYD3在 细胞中的表达。i部分描述用DAPI进行的核染色结果。j部分构成了a-c的 合并图像。表达SMYD3的细胞在体内显示Thr821/826磷酸化水平提高。图8 SMYD3蛋白的表达图式。a部分描述SMYD3蛋白在人类癌细胞系和组织中的表达。用抗SMYD3抗体进行了 Western印迹分析。以(3-肌动蛋 白的表达作为定量对照。b部分描述带HA标签的SMYD3 (左图面)和带Flag 标签的SMYD3 (右图面)的免疫印迹分析。分别使用抗HA抗体或抗FLAG 抗体对来自表达带HA标签的SMYD3 N末端区域或带Flag标签的SMYD3 C 末端区域的细胞的提取物进行了 Western印迹分析。c部分为SMYD3的缺 失形式的示意图。表达系列带FLAG标签的SMYD3N末端区域的质粒转染 不表达外源性SMYD3的HEK293细胞。d部分描述使用抗SMYD3抗体(上 图面)或抗FLAG抗体(下图面)进行细胞提耳又物的Western印迹分析。箭头表 示全长SMYD3蛋白，星号对应于SMYD3的被切割形式。图9 SMYD3切割位点和含SET的蛋白中SET-N区的保守氨基酸序列的 确定。A部分描述用 一种其N末端具有34个氨基酸缺失的SMYD3蛋白所 测得的Edman氨基酸序列。b部分描述组蛋白曱基转移酶中SET-N的氨基 酸序列的比对。黑色方格表示高度保守性氨基酸，阴影方格表示中度保守性 氨基酸。图10与野生型蛋白比较，切割型SMYD3的组蛋白曱基转移酶活性升 高。a部分描述用抗FLAG抗体(上图面)和抗SMYD3抗体(中图面)对野生型 或缺失型(AN34和AN44) SMYD3蛋白进行Western印迹分析。从表达带 FLAG标签的SMYD3蛋白的细胞提取蛋白质。用免疫沉淀的SMYD3蛋白 进行组蛋白曱基转移酶测定。b部分描述全长和经切割的SMYD3蛋白的组 蛋白甲基转移酶活性的剂量反应性上升。添加SAHH (S-腺苷高半胱氨酸水 解酶)提高了组蛋白曱基转移酶的活性。用液体闪烁计数器测定3H-放射性。图11 SET-N区中导致组蛋白曱基转移酶活性抑制的区域的确定。a部分 为具有SET-N区保守氨基酸取代的突变的SMYD3构建体的示意图。b部分 描述用抗SMYD3(上图面)或抗FLAG (下图面)抗体对带FLAG标签的野生型 或突变型(AN34,SETNml,SETNm2,和SETNm3) SMYD3蛋白进行的免疫印 迹分析。用抗FLAG抗体从表达带FLAG标签的SMYD3的HEK293F细胞 获得免疫沉淀蛋白，用该蛋白作为组蛋白曱基转移酶活性测定的酶来源。c 部分描述野生型、缺失型SMYD3的组蛋白曱基转移酶活性。用液体闪烁计 数器测定&放射性。图12 N末端区域缺失的SMYD3的组蛋白曱基转移酶活性提高。A部分是N末端区域缺失型SMYD3的图解。制备了表达一系列GST融合的 SMYD3蛋白的质粒。b部分描述用抗GST抗体对重组SMYD3蛋白进行免 疫印迹分析。在细菌中表达与GST融合的野生型和突变型重组SMYD3蛋白， 并从细菌中纯化出来。c部分描述这些蛋白质的体外组蛋白甲基转移酶活性。 用液体闪烁计数器测定3H》文射性。发明详述SM7D3 cDNA由1622个核香酸组成，其中包含SEQ. ID. NO.:l所示的 由1284个核苷酸组成的开放阅读框。该开放阅读框编码如SEQ. ID. NO.:2 所示的具有428个氨基酸残基、包含一个锌指基序和一个SET域的蛋白质， 该锌指结构域(MYND)由第49延伸至第87位氨基酸，该SET (Su 3-9， Enhancer-of-zeste,Trihorrax)域由第117至第246位氨基酸组成。SMYD3蛋白的亚细胞定位随着细胞周期的进展和培养细胞的密度而变 化。当细胞周期位于中至晚S期或以稀疏的状态培养细胞时，SMYD3蛋白 聚集于细胞核中。然而，当细胞周期位于其他时相或以密集的状态培养细胞 时，SMYD3蛋白分布在细胞质和细胞核中。因此本发明提供一种筛选调节SMYD3曱基转移酶活性的作用因子的方 法，该方法如下实施使SMYD3多肽或其具有曱基转移酶活性的功能性等 价物与视网膜母细胞瘤蛋白接触，然后测定接触的SMYD3或其功能性等价 物的曱基转移酶活性。从而鉴定调节SMYD3或其功能性等价物的曱基转移 酶活性的作用因子。本发明中的术语"功能性等价物"意思是主题蛋白质或多肽与SMYD3具 有相同或基本相同的曱基转移酶活性。特别是，该蛋白催化视网膜母细胞瘤 蛋白或包含赖氨酸824的视网膜母细胞瘤蛋白片段的曱基化。主题蛋白质是 否具有靶活性可由本发明中按常规方法确定。也就是说，该曱基转移酶活性 可以通过如下步骤检测(a)在适合曱基化的条件下，使多肽与底物(如视网 膜母细胞瘤蛋白或包含赖氨酸824的片段)和辅因子(如S-腺苷-L-曱硫氨酸) 接触，和(b)测定底物的曱基化水平。此处术语"视网膜母细胞瘤肽"指的是全长视网膜母细胞瘤蛋白(如SEQ ID NO: 4)及其突变体和片段。功能性片段的例子包括但不限于C末端片段，例如由SEQ ID NO: 4第769至921位氨基酸组成的片段。优选的片段包括 第824位的赖氨酸残基。功能性突变体的例子包括但不限于下列保留了全长 视网膜母细胞瘤蛋白的曱基化能力的RB1突变体K889A, K896A， K791A, K814A， K791A/K824A和K814A/K824A。制备给定蛋白质的功能性等价物蛋白质的方法是本领域技术人员公知 的，包括将突变导入蛋白质的常规方法，例如，本领域技术人员可以使用例 如定点诱变将合适的突变导入人SMYD3蛋白的氨基酸序列，而获得与人 SMYD3蛋白功能性等价的蛋白(Hashimoto-Gotoh, T. et a.(1995), Gene 152, 271-275; Zoller, MJ，和Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984)， Nucleic Adds Res. 12， 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ. (1987) Methods. Enzymol. 154， 350-367; Kunkel, TA (1985)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492)。氨基酸突变也可自然发生。本发明背景下有用 的SMYD3多肽包括那些具有人SMYD3蛋白中发生一个或多个氨基酸突变 的氨基酸序列的蛋白质，只要所得的突变蛋白质是人SMYD3蛋白的功能性 等价物，更具体的是保留了人SMYD3蛋白的曱基转移酶活性。此类突变体 中要加以突变的氨基酸数量通常为20个氨基酸或更少，典型地为10个氨基 酸或更少，优选6个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少。为了保持曱 基转移酶活性，SET域"NHSCXXN"和"GEELXXXY"最好保留在突变蛋白质 的氨基S14列中("X，，指任意氨基酸)。众所周知，突变或修饰的蛋白质，即通过一个或多个氨基酸残基的缺失、 添加和/或取代而修饰了氨基酸序列的蛋白质将保留原来蛋白质的生物学活 性(Mark， D. R et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M.， Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang， A. et al" Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarl和，G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。最好将待突变的氨基酸残基突变成可保留氨基酸侧链的性质的不同氨 基酸(该过程称为保守氨基酸取代)。氨基酸侧链的性质的例子包括疏水性氨 基酸(A, I, L, M, F， P, W， Y, V)、亲水性氨基酸(R, D， N， C， E， Q, G, H, K, S, T)、 和共有下列官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G A, V, L, I， P);含有羟基的 侧链(S,T,Y);含;5克原子的侧链(C,M);含有羧酸和酰胺的侧链(D, N, E， Q); 含有碱的侧链(R,K,H);和含有芳香族的侧链(H,F,Y, W)。注意，字母指的是氨基酸的单字母代码。人SMYD3蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)添加一个或多个氨基酸残 基而成的蛋白质的一个例子是含有人SMYD3蛋白的融合蛋白。融合蛋白包 括人SMYD3蛋白和其它肽或蛋白质的融合物，且在本发明中有使用。融合 蛋白可用本领域技术人员已知的技术获得，例如将编码本发明的人SMYD3 蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA连接，使得阅读框一致，将融 合DNA插入表达载体，然后在宿主中表达。对于与本发明的蛋白质相融合 的肽或蛋白质没有限制。可用作与SMYD3蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG (Hopp, T. P. et al" Biotechnology (1988) 6， 1204-1210),含有六个His (组氨酸)残基的 6xHis, 10xHis，流感凝集素(HA),人c-myc片段，VSP-GP片段，pl8HIV 片段，T7-标签，HSV-标签，E-标签，SV40T抗原片段，lck标签，a-微管蛋 白片段，B-标签，蛋白C片段等等。可以和本发明的蛋白质相融合的蛋白 质的例子包括GST (谷胱甘肽-S-转移酶)，流感凝集素(HA),免疫球蛋白恒 定区，(3-半乳糖苷酶，MBP(麦芽糖结合蛋白)，及诸如此类。可以如下所述制备融合蛋白质用市售的编码上面讨论的肽或蛋白质的 DNA与编码本发明的蛋白质的DNA融合，然后表达所制备的融合DNA。本领域已知的一种分离功能性等价蛋白质的替代方法使用杂交技术来 鉴定同源性序列(Sambrook， J. et al.， Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)。本领域技术人员可以容易地分离与编码人 SMYD3蛋白的全部或部分DNA序歹J(例如SEQ ID NO: l)具有高同 源性的DNA，且可以容易地从分离到的DNA分离与人SlVtYD3蛋白功能性 等价的蛋白质。用于本发明的蛋白质包括这些蛋白质它们由与编码人 SMYD3蛋白的DNA序列的全部或部分杂交的DNA所编码，并且是人 SMYD3蛋白的功能性等价物。这些蛋白质包括与源自人或小鼠的蛋白质对 应的哺乳动物同源物(如猴、大鼠、兔和牛的基因编码的蛋白质)。为了从动 物中分离与编码人SMYD3蛋白的DNA具有高度同源性的cDNA,所采用 的动物组织特别优选地来源于骨骼肌、睾丸、HCC或结肠直肠肿瘤。用于分离编码人SMYD3蛋白功能性等价物的DNA的杂交条件可以由 本领域技术人员常规地选择。例如，杂交可以如下进行用Rapid-hyb buffer，，(Amersham LIFE SCIENCE)在68°C条件下进行30分钟或更长时间的预杂交，加入标记探针，然后在68°C条件下保温1小时或更长时间。后面的洗涤步骤可以例如在低严紧条件下进行。低严紧条件是例如42。C， 2X SSC, 0.1%SDS,或优选50。C， 2XSSC, 0.1% SDS。更优选的是使用高严 紧条件。在本发明的背景下，高严紧条件包括，例如，在2XSSC、 0.01% SDS 中于室温条件下洗涤3次，每次20分钟，然后在lxSSC、0.1%SDS中于37°C 条件下洗涤3次，每次20分钟，以及在lx SSC、 0.1%SDS中于50。C条件 下洗涤2次，每次20分钟。但是，若干因素，如温度和盐浓度，可影响杂 交的严紧度，本领域的技术人员可对这些因素加以合适地选择，以获得需要 的严紧度。可以采用基因扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)方法代替杂交，用 于分离编码与人SMYD3蛋白功能性等价的蛋白质的DNA,所用的引物是 根据编码人SMYD3蛋白(SEQ ID NO: 2)的DNA(SEQ ID NO: l)的序列信息 合成的。一般而言，通过上述杂交技术或基因扩增技术分离得到的DNA所编码 的人SMYD3蛋白功能性等价物蛋白与人SMYD3蛋白的氨基酸序列具有高 同源性。"高同源性"(也称作"高同一性")特指两个最优比对的序列(多肽或多 核苷酸序列)之间的同一性程度。典型地，高同源性或同一性是指40%或更 高，优选60%或更高，更优选80%或更高，进一步优选85%、 90%、 95%、 98%和99%或更高的同源性。两种多肽或多核香酸序列之间的同源性或同一 性的程度可根据"Wilbur, W. J. and Lipman， D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730，，中记载的算法进行确定。:取决于用来产生它的细胞或宿主或纯化方法，本发明中的蛋白质在以下 方面存在不同氨基酸序列、分子量、等电点，糖链的有无或形式。尽管如 此，只要是人SMYD3蛋白(SEQIDNO:2)的功能性等价物即可用于本发明。用本领域技术人员熟知的技术，本发明背景下有用的蛋白可以作为重组 蛋白或天然蛋白制备。重组蛋白可通过下列步骤制备将编码本发明蛋白质 的DNA (如包含SEQ ID NO: 1所示的核苷S吏序列的DNA)插入合适的表达 载体，将该载体导入适合的宿主细胞，获得提取物，用色谱法处理该提取物 纯化蛋白质，色谱法的例子有离子交换色谱法、反相色谱法、凝胶过滤法、 或使用固定有针对本发明蛋白质的抗体的柱子的亲和色谱法、或将多于一种 的上述柱子加以组合。此外，若本发明背景下有用的蛋白质在宿主细胞(如动物细胞和大肠杆 菌(五.co/z'))中表达为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白形成的融合蛋白或添加了多个 组氨酸的重组蛋白，该表达的蛋白质可用谷胱甘肽柱或镍柱进行纯化。融合蛋白纯化后，还可能用按需要用凝血酶或因子Xa切割以去除目的蛋白之外的区域。天然蛋白也可采用本领域技术人员已知的方法加以分离，例如通过使其中结合有如下所述的结合SMYD3蛋白的抗体的亲和柱接触表达本发明蛋白 质的细胞或组织的提取物。所述的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。在本发明中，可用本领域已知的方法确定SMYD3多肽的曱基转移酶活 性。例如，可以在合适的测定条件下，将SMYD3多肽和视网膜母细胞瘤肽 底物与标记的曱基供体共同孵育。甲基供体的例子包括但不限于S-腺苷-[曱 基-"C]-L-甲硫氨酸，和优选地S-腺苦-[曱基JH]-L-甲硫氨酸。放射标记向视 网膜母细胞瘤肽的转移可以用例如SDS-PAGE电泳法和荧光自显影进行检 测。或者，在反应后，可以用过滤将视网膜母细胞瘤肽从曱基供体中分离， 并用闪烁计数法对保留在滤器上的放射标记量进行定量。可以在曱基供体上 连接其他合适的标记，如生色标记和荧光标记，用于检测这些标记向视网膜 母细胞瘤肽的转移的方法也是本领域已知的。或者，SMYD3的曱基转移酶活性可以使用非标记曱基供体(如S-腺苷-L-甲硫氨酸)和选择性识别曱基化视网膜母细胞瘤肽的试剂进行检测。例如， 在适合底物甲基化的条件下，将SMYD3、待曱基化的底物和甲基供体进行 共同孵育，然后可以用常规的免疫学方法检测曱基化的底物。任何使用抗体 来识别甲基化底物的免疫学方法均可以用于检测。另夕卜，确认了在第824位赖氨酸曱基化的RB1中，RB1的Ser 807和 Ser811位点处的磷酸化被提高。因此，在另一个实施方式中，RB1的曱基化 水平可通过RB1的磷酸化进行估计。激酶如CDK2或CDK6对于RB1的磷 酸化可能也是必须的。RB1的磷酸化可以使用放射标记的磷酸供体进行检 测。或者，可以使用识别RB1磷酸化位点的抗体估计RB1的磷酸化水平。有多种低通量和高通量酶测定程式是本领域已知的，可以容易地适用于 检测或测量SMYD3的曱基转移酶活性。在高通量测定中，可以方便地将视 网膜母细胞瘤底物固定在固体支持物例如多孔板、载玻片或芯片上。反应后， 可以在固体支持物上用上述方法才企测曱基化产物。或者，可以在溶液中进行甲基转移酶反应，然后可以将视网膜母细胞瘤肽固定在固体支持物上，并检 测曱基化产物。为了使这样的测定易于进行，可用链霉抗生物素蛋白包被固 体支持物，并用生物素标记视网膜细胞瘤，或用抗-见网膜细胞瘤抗体包被固 体支持物。本领域的技术人员可根据期望的筛选通量能力确定适合的测定程 式。本发明还涵盖本发明的蛋白质的部分肽的用途。部分肽含有SMYD3蛋 白特异性氨基酸序列，并由少于约400个氨基酸，通常少于约200个氨基酸 并往往少于约100个氨基酸，且至少为约7个氨基酸，优选约8个或更多氨 基酸，更优选约9个或更多氨基酸组成。部分肽可用于例如筛选与SMYD3 蛋白结合的作用因子或化合物，以及筛选SMYD3与其辅因子如SAM之间 结合的抑制剂。优选将含有SET域的部分肽用于此类筛选。本发明背景下有用的部分肽可以通过基因工程方法、肽合成的已知方 法，或通过合适肽酶消化本发明蛋白质来制备。对于肽合成，例如，可以使 用固相合成或液相合成。具有SET域突变的SMYD3突变体显示对细胞增殖的抑制作用。因此， SMYD3的部分肽优选地包含SET域"NHSCXXN"和/或"GEELXXXY"。可以使用任何测试剂。例子包括但不限于细胞提取物、细胞培养上清 夜、微生物发酵产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化蛋白或粗蛋白、 肽类、非肽类化合物、合成小分子化合物和天然化合物。SMYD3特异性结合的抗体，或者缺乏曱基转移酶活性的部分SMYD3肽。 例如，可以测试抗体(如单克隆抗体)对SMYD3与其视网膜母细胞瘤底物 的结合的阻断能力。通过本发明的筛选方法分离出的作用因子或化合物是候选的抑制 SMYD3曱基转移酶活性的药物，因此可应用于治疗或预防肝细胞癌、结肠 直肠癌、乳腺癌和/或膀胱癌。的作用因子或化合物其中抑制SMYD3曱基转移酶活性的作用因子或化合 物的结构的一部分通过添加、缺失和/或置换而被变换。如上所述，抑制SMYD3甲基转移酶抑制活性的作用因子或化合物可以 是缺乏SMYD3的曱基转移酶活性的部分肽，或者可以是针对SMYD3的抗体。术语"抗体"用于本文中指的是具有特定结构的免疫球蛋白分子，该免疫球蛋 白分子只与用于合成该抗体的抗原或与其紧密相近的抗原相互作用(即结合)。另外，抗体可以是抗体片段或修饰抗体，只要它与SMYD3基因编码的 蛋白质结合。例如，抗体片段可以是Fab, F(ab，)2, Fv，或单链Fv (scFv)， 其中来自重链和轻链Fv的片段通过合适的接头得以连接(Huston J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883 (1988》。更具体地，可用酶如木瓜 蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将该基因插入表达载体，然后在适合的宿主细胞中表达(参见，例 如，Co M. S. et al.丄Immunol. 152:2968-2976 (994); Better M. and Horwitz A. H. Methods Enzymol. 178:476-496 (1989); Pluckthun A. and Skerra A. Methods Enzymol. 178:497-515 (1989); Lamoyi E. Methods Enzymol. 121:652-663 (1986); Rousseaux J. et al. Methods Enzymol. 121:663-669 (1986); Bird R. E. and Walker B. W. Trends Biotechnol. 9:132-137 (1991))。可以通过与多种分子如聚乙二醇(PEG)偶联来对抗体进行修饰。本文提 供了这样的修饰抗体。修饰抗体可通过对抗体进行化学修饰而获得。这样的 修饰方法在本领域中是常规的。或者，该抗体可以是嵌合抗体，具有衍生自 非人源抗体的可变区和衍生自人源抗体的恒定区；或者是人源化抗体，包含 衍生自非人源抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人源抗体的框架区(FR), 以及恒定区。这样的抗体可通过已知技术获得。人源化过程包括用啮齿动物 的CDR或CDR序列替换人源抗体的相应序歹'K参见Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)等)。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中显著 少于完整的人源可变域已经被来自非人物种的相应序列取代。还可以使用完全人源抗体，它们除了人源框架区和恒定区之外还包含人 源可变区。这些抗体可通过本领域已知的多种技术来生产。例如，可以使用 涉及利用噬菌体展示人源抗体片段重组文库的体外方法(Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991))。类似地，可以将人免疫球蛋白基因座位 导入内源性免疫球蛋白基因已经部分或全部失活的转基因动物(如小鼠)， 从而获得人抗体。该方法描述于例如美国专利6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016。当施用通过本发明方法分离得到的作用因子或化合物作为人和其它哺 乳动物，包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩的药物时，该分离的作用因子或化合物可以直接施用，也可用熟知 的药物制剂方法制成剂型。例如，根据需要，药物可以作为糖衣片、胶嚢、 酏剂口服，和微胶嚢，或以无菌注射液或与水或其它药学可接受的液体所成 的悬液的形式非口服摄取。例如，这些作用因子或化合物可与药学可接受的 载体或基质混合成适于公认药物实施所需的单位剂型，其中药学可接受的载 体或基质具体地说有无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活 性剂、稳定剂、增味剂、赋形剂、溶i某、防腐剂、粘合剂，等等。这些制剂 中活性成份构成可得的标称范围内的合适剂量。可以混合于片剂和胶嚢剂的添加剂的例子有粘合剂如明胶、玉米淀粉、 西黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和海 藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；和增味剂如薄荷、 红珠树(Gaultheriaadenothrix)油和樱桃。当单位剂型是胶嚢剂时，上述成 分中还可以进一步包括液体载体如油类液体。可以根据常规药物实施方法使 用注射用蒸馏水等溶媒配制注射用无菌组合物。生理盐水、葡萄糖和其它含有辅料的等渗液可以用作注射用水溶液，所 述的辅料包括D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠。它们可以与合 适的增溶剂结合使用，增溶剂有例如醇(特别是乙醇)、多元醇如丙二醇和 聚乙二醇、非离子表面活性剂如Polysorbate 80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以用作油状液体，可以与作为增溶剂的苯曱酸苯曱醇 酯或苯曱醇结合使用，并且可以与下列物质一起配制緩冲剂，例如磷酸盐 緩沖剂和乙酸钠緩沖剂；止痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯曱醇和苯 酚；和抗氧化剂。制成的注射剂可以充入合适的安瓿中。可以使用本领域技术人员知道的方法对患者施用本发明的药物组合物， 例如作为动脉内、静脉内或经皮注射，和作为鼻内、肌肉内或口服施用。施 用剂量和方法根据病人的体重和年龄和施用方法而变化，但本领域的技术人 员可常规地选择合适的施用方法。此外，若目标作用因子或化合物是^DNA 编码的，则可将该DNA插入基因治疗用载体，然后将该载体施用于病人进行 治疗。施用剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状而变化，但本领域的技 术人员能够合适地选择它们。例如，尽管与SMYD3结合并调节其活性的作用因子或化合物的剂量取 决于症状，当口服地施用于正常成人(体重60kg)时，典型的剂量范围为每 天约0.1至约100mg，优选每天约1.0至约50mg,更优选每天约1.0至约20 mg。 当通过肠胃外途径以注射剂形式施用于正常成人(体重60kg)时，尽管 根据病人、靶器官、症状和施用方法而有一些不同，但方便的是静脉内注射 每天约0.01至约30 mg,优选每天约0.1至约20 mg,更优选每天约0.1至约10 mg的剂量。而且，就其它动物来说也是如此，可施用换算为60kg体重的量。 本发明进一步提供了 一种治疗受试者中的癌症例如肝细胞癌、结肠直 肠癌、膀胱癌和乳腺癌的方法。可以对有风险患上(或易感于)或具有 SMYD3甲基转移酶异常活性相关的病症的受试者预防性或治疗性地施用。 方法包括减弱合适的癌细胞中SMYD3的功能。施用以本发明的筛选方法 获得的作用因子或化合物可以抑制该功能。另 一方面，本发明包括包含本文描述的 一种或多种治疗剂或化合物的 药物组合物或治疗组合物。或者，本发明也提供了本文描述的一种或多种 治疗剂或化合物在制备用于治疗和/或预防癌症，更特别是肝细胞癌、结肠 直肠癌、膀胱癌和乳腺癌的药物组合物或治疗组合物中的用途。药物制剂 可以包括那些适合口服、直肠、鼻腔、局部(包括含服和舌下)、阴道或 肠胃外(包括肌肉内、皮下和静脉内)施用，或通过吸入或吹入法施用的 制剂。在合适的情形，这些药物制剂可方便地以不连续的剂量单位形式提 供，并可用任何药学领域熟知的方法制备。所有以上药学方法包括根据 需要使活性化合物与液体载体或/和细碎的固体载体组合，然后，如果必要， 将组合产物成型得到所需的剂型的步骤。适于口服施用的药物制剂可以方便地提供为不连续的单位例如含有预 定量活性成份的胶囊、扁嚢剂或片剂；粉剂或颗粒剂；或溶液剂、混悬剂 或乳剂。该活性成份可以糖丸(bolus electuary)或糊剂提供，并可以是纯 的即不含载体的形式。口服片剂和胶嚢剂可含有常规的赋形剂，例如粘合 剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可用挤压或模压制备，可选 地和一种或多种制剂成分一起制备。挤压片剂的制备可按如下方式进行 将活性成份以自由流动的形式如粉末或颗粒的形式，任选地与粘合剂、润 滑剂(lubricant)、惰性稀释剂、润滑(lubricating)剂、表面活性剂或分散剂混 合，在适合的机器中进行挤压。模压片剂的制备可按如下方式进行将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物在适合的机器中模压成型。 片剂可用本领域熟知的方法进行包衣。口服流体制剂的形式可为，例如， 含水的或油性的混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂，或可提供为一种 干燥的产品，该产品在使用前可用水或其它适合的溶媒进行配制。以上液 体制剂可含有常规的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非含水性溶J^某(可包括 食用油)或防腐剂。片剂可任选地配制为提供其中活性成份的緩释或控释。 通过肠胃外途径使用的制剂包括含水的或非含水的无菌注射液，其可 含有抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂和溶质，该溶质可使注射剂与目标受用者的血液达到等渗；和含水的或非含水的无菌混悬剂，其可包括悬浮剂和增稠剂。这些制剂可以在单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中提供，并可 以在冻干的(冷冻干燥的)条件下保存，只需要在即将使用前加入无菌液体 载体，例如，盐水和注射用水。或者，这些制剂也可供连续性输注。可用前 述各种无菌粉末、颗粒剂和片剂制备临时配制的注射溶液和悬浮液。通过直肠施用的制剂为可以为含有常用载体例如可可脂或聚乙二醇的 栓剂。通过口内局部例如口含或舌下施用的制剂，包括含有包含在调味基质例如蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中的活性成份的锭剂(lozenge),和含有包 含在基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成份的软锭剂 (pastille)。为了鼻内施用，本发明获得的化合物可以作为液体喷雾剂、分 散粉末，或以滴剂的形式使用。滴剂可用含水性或非含水性基质配制，所述 基质也含有一种或多种分散剂、增溶剂和悬浮剂。液体喷雾剂可方便地从加 压包装中施用。为了吸入施用，这些化合物可以方便地从吹入器、喷雾器、加压包装或 其它用于气溶胶喷雾剂给药的便利装置中给用。加压包装可以含有适合的推 进剂例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适 的气体。在加压气溶胶的情形下，可通过提供阀门来确定剂量单位以进行计 量给药。或者，为了通过吸入或吹入施用，这些化合物可采用干粉组合物的形式， 例如，含有该化合物和适合的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。该粉末 组合物可以单位剂型提供，例如提供在胶嚢、药筒、明胶或或浮泡包装中， 在吸入器或吹入器的辅助下可从其中施用该粉末。必要时，也可釆用适于提供活性成份持续释放的上述制剂。这些药物组 合物也可含有其它活性成份例如抗微生物剂、免疫抑制剂或防腐剂。应该理 解的是，除了以上特别提到的成分以外，本发明的制剂可以包括其它本领域 常规的与所考虑的制剂类型相关的作用因子，例如，适合口服的制剂可包括 调味剂。优选的单位剂量制剂是含有下述有效剂量或其合适部分的活性成份的 单位剂量制剂。对于每种上述提及的状况，可口服或通过注射施用所述组合物，剂量为约O.l至约250mg/kg/天。成人剂量范围通常为约5mg至约17.5 g/天，优选 约5 mg至约10 g/天，最优选约100 mg至约3 g/天。4是供为不连续单位的片 剂或其它单位剂型可方便地含有在该剂量条件下或在多个该剂量条件下有 效的量，例如，含有约5至约500 mg,通常为约100至约500 mg的单位。药物组合物是优选通过口服或通过注射(静脉内或皮下)给药，施用给 受试者的精确量将由当值医师负责。然而，应用剂量将取决于多种因素，包 括受试者的年龄和性别、所治疗的确切病症及其严重性。用药途径也可根据 以上状态和严重性而变化。下述实施例仅仅是说明性的，意图不在于限制本发明的范围。尽管下述 实施例描述了本发明的几个方面，本领域的技术人员将承认，与此处描述相 似或等同的方法和材料可用于实施或检^r本发明。实施例材料和方法 试剂抗RB(IF8)、抗磷酸RB (Ser 807/811, sc-16670)和抗磷酸RB (Thr 821/826) 抗体，购自Santa Cmz Biotechnology,抗Flag抗体来自SIGMA,抗泛曱基 赖氨酸抗体(ab7315)来自Abeam Ltd。将重组SMYD3蛋白或含有二曱基化或 三曱基化的赖氨酸824的合成RB1肽(第820至828位残基)接种入家兔 (SIGMA-ALDRICH， St. Louis, MO)，然后从免疫家兔的血清中纯化出多克隆 抗体。重组C末端GST-RB1和全长GST-p53蛋白来自Santa Cruz Biotechnology, His偶联的C末端RB1、 CDK2/细胞周期蛋白E和CDK6/细胞周期蛋白D3蛋白来自Upstate Biotechnology,全长重组RB蛋白(3108)来 自QED Bioscience。 S-(5，-腺苷)-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)获自SIGMA。体外曱基转移酶和激酶测定用表达带Flag标签的野生型SMYD3的质粒(p3XFLAG-CMV-SMYD3)、 表达带Flag标签的突变型SMYD3的质粒(p3XFLAG-CMV-SMYD3AEEL)转 染293T细胞，并通过抗Flag抗体免疫沉淀而纯化带标签的SMYD3蛋白。 用杆状病毒系统(Clontech)在Sf9细胞中制备重组SMYD3蛋白。如别处描述 (Strahl， B. D., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14967-72 (1999))并稍加改 变，进行体外组蛋白甲基转移酶活性测定。简要地说，在2pCi的作为曱基 供体的[曱基」H]-标记的S-腺苷-L-曱硫氨酸(SAM, Amersham Biosciences)存 在时，将免疫沉淀的SMYD3蛋白或重组的SMYD3蛋白在曱基转移酶緩冲 液(50 mM Tris-HCl pH 8.5， 100 mM NaCl， 10 mM DTT)中与1 (ag的重组组蛋 白H3、RB1或p53蛋白混合。将反应混合物在30 。C孵育1小时，以SDS-PAGE 分离蛋白质，用荧光自显影检测标记的蛋白质。CDK2/细胞周期蛋白E和 CDK6/细胞周期蛋白D3的体外激酶活性测定根据生产商的方案进行(Upstate Biotechnology)。非曱基化的RB1和曱基化的RBl(#12-439， Upstate Biotechnology)都用作反应底物。体内曱基化作用测定为了体内测量曱基化的RB1,依据Liu和Dreyfuss (Liu, Q. & Dreyfuss, G. Mol Cell Biol 15, 2800-8 (1995))所用的方法并稍加改动，用[曱基」H]-标记的 S-腺苷-L-曱硫氨酸在培养的细胞中对RBI进行体内标记。将HEK293细胞 与100 pg/ml的环己酰亚胺和40 jag/ml的氯霉素在37。C孵育30分钟，此时 将培养基更换为含有10 ^Ci/ml L-[曱基」H]曱硫氨酸和蛋白合成抑制剂而不 含无未标记曱硫氨酸的培养基，再保持3小时。用抗RB抗体(IF8; Santa Cruz Biotechnology)对全细胞溶解物进行免疫沉淀。以SDS-PAGE分离免疫沉淀 的RB1蛋白，随后将其转移至硝基纤维素膜上，对所述膜用BAS成像系统 (BAS-TR2040, FUJI)进行分析或进行免疫印迹分析。免疫细胞化学染色用含有4%多聚曱醛的PBS将腔式载玻片上培养的细胞固定15分钟， 然后在室温下用含有0.1% Triton X-100的PBS处理2.5分钟使其可渗透。用含2%牛血清白蛋白(BSA )的PBS在4°C覆盖细胞24小时以封闭非特异杂 交，然后与作为第一抗体的抗SMYD3抗体、抗RB [IF8]抗体和抗磷酸RB (Thr 821/826)抗体孵育。使用焚光底物偶联的抗兔或抗小鼠IgG (Molecular probes)作为第二抗体；然后用4，， 6-二连脒-2-P引哚苯二盐酸盐(DAPI)将细胞 核进行对比染色。用TCS-SP2共聚焦显微镜(Leica)获得荧光图像。荧光素酶测定根据生产生产商的指示(Promega),用双荧光素酶报道基因检测系统 (Dual-Luciferase Reporter Assay System )进4亍了焚光素酵测定。细胞系和组织标本人胚肾293(HEK293)、 HEK293T和HEK293F细胞购自IWAKI。人肝 癌细胞系HepG2、和HCT116以及SW480人结肠癌细胞系来源于美国典型 培养物保藏中心(ATCC)。人HCC细胞系SNU423为韩国细胞系银行(Korea cell-line bank )所赠。T47D和MCF7乳腺癌细胞系由日本癌症研究基金会癌 症研究所(cancer institute of the Japanese foundation for cancer research )友情 提供。所有的细胞系在合适的培养基中单层培养。原发性乳腺癌组织来源于 知情并征得同意的病人(Hamamoto, R. et al. Cancer Sd 97， 113-118 (2006).)。质粒的制备C末端带FLAG标签的SMYD3的制备在先前有描述(Hamamoto， R. et al. Nat Cell Biol 6, 731-740 (2004).)。此外，我们将含有野生型或缺失型SMYD3 cDNA的各种PCR产物克隆至pCMV-HA(Clontech)或p3XFLAG-CMV14 (Sigma)载体的合适位点中，制备了表达N末端带HA标签的或N末端带 3xFLAG标签的SMYD3的质粒。用于野生型质粒的引物为 5，-AAGCTTGCGGCCGCGATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3， (SEQ ID NO: 5)，和5'-GGTACCTCTAGATTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTC-3， (SEQIDNO:6)，用于突变型(FLAG画SMYD3-AN44,-AN99,-AN244,和-A34) 的引物分别为5，-GGGGTACCTTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTC-3， (SEQ ID NO: 7)和5'-CGGAATTCTGGCGCGATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAA AG-3， (SEQ ID NO: 8), 5，隱CGGAATTCTGACTCCGTTCGACTTCTTGGC AG-3' (SEQ ID NO: 9)， 5，- CGGAATTCTCGGAAGCAGCTGAGGGACCA GTACTGC-3， (SEQ ID NO: 10)，或5'-CGGAATTCACCCTTGGCGTACACGGTGTGCAAGG-3 ， (SEQ ID NO: 11)。冲艮据提供者的方案(Stratagene， California, USA),用QuikChange II XL定点诱变试剂盒制备了表达15、 17 或27位甘氨酸:f又代的突变型质粒。Western印迹分析如别处描述，用大肠杆菌中产生的重组带His标签的SMYD3蛋白免疫 家兔，从免疫的家兔的血清中纯化出SMYD3多克隆抗体。用10%SDS-PAGE 分离出蛋白质并用抗SMYD3 、抗HA(Sigma)、抗FLAG(Sigma)、抗 GST(Pharmingen)或抗(3-肌动蛋白(Sigma)抗体进行免疫印迹。使用HRP偶联 的4元兔IgG、 #元小鼠IgG (Amersham Biosciences)或4元山羊IgG (Santa Cruz) 抗体作为第二抗体用于ECL检测系统(Amersham)。切割位点的确定在293F细胞中外源性地表达C末端带FLAG标签的SMYD3。将用抗 FLAG抗体从细胞中免疫沉淀的SMYD3蛋白在一式二份的SDS-PAGE凝胶 上进行分离，再转移至硝基纤维素膜和序列级(sequence grade ) PVDF膜上。 用该硝基纤维素膜进行免疫印迹分析，以抗FLAG抗体4企测两种形式的 SMYD3蛋白。对于该PVDF膜用不含乙酸的CBB溶液(0.025% CBB的40% 曱醇溶液)染色后，我们切下与短形式的SMYD3相应的条带，并对其进行 了氨基酸序列测定。通过埃德曼氨基酸序列测定法(Edman amino acid sequence method) (Shimadzu Biotechnologies, Tokyo, Japan)确定了 "i亥蛋白质 的氨基酸序列。体外组蛋白曱基转移酶(fflWra化)测定用抗FLAG抗体进行免疫沉淀从表达野生型(p3XFLAG-CMV-SMYD3) 或突变型SMYD3 (p3XFLAQ-AN34, -AN44, -SETNml, -3￡丁>^12和-8￡顶1113) 的293T细胞中纯化出带FLAG标签的SMYD3 。 乂人表达野生型 (GST-SMYD3-wt)或突变型SMYD3构建体(GST-SMYD3-AN9， -AN19, -AN29， -AN44, -AN74)的细菌细胞中纯化出GST融合的SMYD3蛋白。按别处的描 述(Hamamoto, R. et al. Nat Cell Biol 6, 731-740 (2004).)进行体外组蛋白曱基 转移酶活性测定。用液体闪烁计数器测量3H放射性。实施例1: RBI作为SMYD3的底物由于最近两个报道显示组蛋白H3-K4曱基转移酶SET7/9催化TAF10和 p53作为底物(Chuikov， S. et al., Nature 432， 353-60 (2004))，本发明人寻找了 除组蛋白H3以外的SMYD3的其它底物(GenBank Accession NO. AB057595; SEQ ID NO; 1， 2)。首先以p53和RBI (GenBank Accession NO. NM—000321; SEQ ID NO; 3, 4)为候选底物进行了测试，因为它们是众所周知的细胞周期行 进调节剂。在研究过程中，在SH标记的曱基供体SAM存在时，将重组组蛋 白H3、野生型p53和RBI的C末端区域(第769至921位密码子)与从293T 细胞免疫沉淀的SMYD3蛋白共同孵育。随后的PAGE和放射自显影显示与 曱基化的组蛋白H3对应的条带，这与SMYD3甲基化组蛋白H3的发现相 一致。有趣的是，也检测出了对应于曱基化的RBI的条带；而没有4企出对 应于甲基化的p53的条带(图la)。进一步用重组SMYD3蛋白测定对组蛋白 H3和C末端RB1的曱基转移酶(MTase)活性。结果显示对两种底物的曱基 转移酶活性都呈剂量依赖性上升(图lb)。值得注意的是，对C末端RB1的 曱基转移酶活性高于对组蛋白H3的曱基转移酶活性。进一步发现了 SET7/9 对RB1也具有曱基转移酶活性(数据未显示)。此外，SMYD3曱基化了全长 RB1(图lc),这提示RB1在体外^皮SMYD3和SET7/9这两种组蛋白H3-K4 曱基转移酶甲基化。实施例2:SMYD3对RB1蛋白的曱基转移酶活性为了研究SMYD3和RB1蛋白之间的可能的締合，用抗SMYD3抗体将 从HepG2或HCT116细胞提取的蛋白进行了免疫沉淀。正如预期，用抗RB1 抗体进行免疫印迹分析，观察到了与RB1蛋白的相应条带(图2a)。为了确定 RB1的负责締合的区域，将带FLAG标签的野生型或突变型RB1蛋白与带 HA标签的SMYD3共同在HEK293细胞中进行表达，并用抗FLAG抗体进 行了免疫沉淀。与C末端RB1蛋白的曱基化一致，C末端底物域(第772至 928位密码子)与SMYD3相互作用(图2b)。为了确定SMYD3负责与RB1 结合的区域，采用了表达野生型和各种形式的突变型SMYD3的质粒。尽管 野生型和Al-(第45至428位密码子)和A2-(第1至250位密码子)形式的突变 型SMYD3与带FLAG标签的RB1相互作用，但缺乏SET域(第1至100 位密码子)的A3-型与RB1之间没有相互作用，提示SET域对上述締合起着 关4建作用(图2c)。更早的报道显示组蛋白H3-K9甲基转移酶SUV39H1与RB和HP1締合，且该复合物在细胞周期蛋白E的转录抑制中起作用(Nielsen, S. J. et al. Nature 412， 561-565 (2001).)。此外，最近的研究显示，通过与RBI 相互作用使得组蛋白H4-K20曱基转移酶Suv4-20hl和Suv4-20h2的活性明 显提高(Gonzalo, S. et al. Nat Cell Biol 7， 420-428 (2005).)。因此本发明人测试 了 RBI是否提高SMYD3的H3-K4曱基转移酶活性。结果，RBI对组蛋白 H3的SMYD3介导的曱基化作用无影响(图2d)。值得注意的是，SMYD3对 H3-K910或H4-K20未显示曱基转移酶活性(图2e)。这些数据支持了 SMYD3 的H3-K4特异性HMT(组蛋白曱基转移酶)活性，并提示RB1以HMT依赖 的方式在组蛋白修饰中起作用。实施例3: RB1甲基化底物域的鉴定为了确定负责RB1底物域曱基化的残基，比较了 SET7/9甲基转移酶的 底物中的保守性氨基酸序列。由于丝氨酸或苏氨酸位于曱基化的赖氨酸之 前，本发明人集中于赖氨酸824、赖氨酸889和赖氨酸896作为候选。制备 了野生型和三种形式的突变型RB1底物域的重组蛋白(图3a)。与野生型蛋 白相比，SMYD3对K889A和K896A突变体的曱基化水平相似(图3b， c); 然而，K824A曱基化水平明显下降(图3b, c)。此外，由于K824A取代没有 完全消除RB1蛋白的曱基化，测定了赖氨酸791和赖氨酸814的曱基化水 平，此二者前面均为酪氨酸。两种突变型RB1蛋白，即K791A和K814A, 显示与野生型RB1相似的曱基化水平(图3d, e)。而且，两种形式的双重突 变型RB1,即K791A/K824A和K814A/K824A,显示了与K824A蛋白相当 的曱基化水平。因此，本发明人得出了赖氨酸824是曱基化的主要靶残基的 结论。为了证实赖氨酸824的曱基化，制备了识别二曱基化或三曱基化赖氨 酸824的曱基化RB1特异性抗体。与野生型RB1蛋白的曱基化相一致，在 免疫印迹分析(图3f)中用抗体^r测到RB1蛋白的二曱基化和三甲基化作用， 与SMYD3对组蛋白H3的赖氨酸4进行的二曱基化和三曱基化相似 (Hamamoto, R. et al. Nat Cell Biol 6， 731-740 (2004).)。尽管在包括H3-K4、 TAF10和p53在内的SET7/9的底物中曱基化赖氨酸之前是两个保守性肽， 即位于赖氨酸-2位的R/K和-1位的S/T，但赖氨酸824的-2位为P, -1位为 T。由于RB1被SMYD3也被SET7/9曱基化，-2位的R/K可能不重要，但 是-1位的S/T对于SMYD3或SET7/9曱基化是必不可少的。实施例4:体内甲基化测定为了进一步考察体内SMYD3对RB1的曱基化作用，利用不表达SMYD3 的HEK293细胞进行了体内曱基化测定(Liu, Q. & DreyfUss， G. Mol Cell Biol 15, 2800-8 (1995》。建立了表达SMYD3的HEK293细胞系(HEK-SMYD3-1 和-2)(图4a)，在蛋白合成抑制剂存在下，将这些细胞与L-[曱基」H]甲硫氨 酸共同孵育。然后用抗RB1单克隆抗体免疫纯化细胞提取物，用SDS-PAGE 法和随后的放射自显影法分析免疫沉淀的蛋白质。与模拟转染的HEK293细 月包(HEK-模拟-l和-2)相比，HEK-SMYD3 (HEK-SMYD3-1和-2)细胞的提取 物显示出明显更强的对应于曱基化RB1的条带。细胞系之间免疫沉淀的RB1 量没有变化(图4b)。与此一致的是，使用抗泛曱基赖氨酸抗体、抗二甲基 化RB1赖氨酸824抗体或抗三曱基化RB1赖氨酸824的抗体进行Western 印迹分析(图4c)观察到HEK-SMYD3细胞中的曱基化RB1比HEK模拟细胞 中增多。对HEK-SMYD细胞进行免疫细胞化学染色显示，与SMYD3表达 量较小的细胞相比，表达充足量的SMYD3的HEK-SMYD3细胞被抗二曱基 化或抗三曱基化RB1赖氨酸824抗体较强地染色(分别见图4d-g和4h-k)。 这些数据确证了体内SMYD3对RB1的赖氨酸824的曱基化。实施例5:体内磷酸化测定RB1的赖氨酸824位于苏氨酸82151和8261}1之间，苏氨酸821"和826th 是被CDK/细胞周期蛋白复合物磷酸化的残基，并通过中心口袋结构域 (central pocket domain)的构象变化而调节RB1和E2F之间的相互作用。 为了考察RB1的甲基化对这些周围苏氨酸的磷酸化的影响，用曱基化的或 未曱基化的RB1蛋白进行了体内磷s交化测定。在SMYD3存在或不存在的条 件下，将重组C末端RB1与^标记的SAM共同孵育，然后与"P-yATP以 及与之组合的重组CDK2/细胞周期蛋白E或CDK6/细胞周期蛋白D3混合。 用液体闪烁计数器同时测定重组RB1的曱基化和磷酸化。与不存在SMYD3 时相比，在存在SMYD3时，C末端RBl掺入的3H-标记的曱基供体的量要 高4 - 6倍(数据未显示)。重要的是，SMYD3以剂量依赖性方式提高了 CDK2/ 细胞周期蛋白E复合物对RB1的磷酸化，而单独的SMYD3没有增加该磷 酸化(图5a)。此外，与不存在SMYD3时相比，发现在SMYD3存在时，CDK6/ 细胞周期蛋白D3增强了 RB1的磷酸化(图5b)。然而，与野生型RB1相比， CDK2/细胞周期蛋白E或CDK6/细胞周期蛋白D3对K824A突变型RB1的磷酸化明显受到抑制(分别见图5c， d)。这些数据提示，RB1的磷酸化通过SMYD3对赖氨酸824曱基化而得以提高。用抗磷酸化的RB1抗体进行的另 外的免疫印迹分析揭示，SMYD3诱导了苏氨酸821/826的磷酸化。有趣的 是，SMYD3也提高了丝氨酸807/811的磷酸化(图5e)。因此，赖氨酸824 的曱基化增加丝氨酸807/811的磷酸化，或者其它曱基化的残基可能提高该 磷酸化。为了研究体内RB1磷酸化的提高，使用抗磷酸化RB1抗体对来自 HEK-SMYD3和HEK模拟细胞的提取物进行了 Western印迹分析。与体外 RB1蛋白的磷酸化的提高的结果一致的是，与对照细胞相比，在HEK-SMYD 细胞中检测到丝氨酸807/811和苏氨酸821/826的磷酸化均提高(图5f)。使用 抗磷酸化苏氨酸821/826抗体和抗SMYD3抗体进行免疫细胞化学染色显示， 与不表达SMYD3的细胞相比，抗磷酸化苏氨酸821/826抗体对表达SMYD3 的细胞的染色更强(图5g-j)。此外，与缺乏曱基转移酶活性的突变型SMYD3 (SMYD3-AEEL或SMYD3-ANHSC)比较，野生型SMYD3的外源性表达增加 了 RB1的赖氨酸824在SNU475细胞中的二甲基化和三曱基化(Hamamoto, R. et al. Nat Cell Biol 6， 731-40 (2004).)。与RB1的赖氨酸824的曱基化相关的 是，我们观察到在这些细胞中的苏氨酸821/826和丝氨酸807/811的磷酸化 分别呈明显的和中度的上升(图6a)。重要的是，Western印迹分析显示，与 相应的非癌乳腺组织相比，在SMYD3表达增加的乳腺癌组织中RBI的赖氨 酸824的曱基化以及丝氨酸807/811和苏氨酸821/826的磷酸化均有所提高 (图6b)。这些数据扼要地反映了体内SMYD3对丝氨酸807/811和苏氨酸 821/826磷酸化的提高。鉴于RB1的磷酸化调制了 口袋结构域而导致E2F与 RB1解离，使用MercuryTM细胞周期概况分析系统比较了在HEK-SMYD3 细胞中E2F介导的转录的报道物活性。与HEK模拟细胞相比，HEK-SMYD3 细胞中的E2F转录活性显示提高(图7)。这些数据表明SMYD3通过曱基化 赖氨酸824而提高RB1的磷酸化，从而导致E2F转录活性的提高。实施例6:人癌细胞中的SMYD3蛋白的一种被切割的形式我们更早的研究显示SMYD3蛋白在人肝细胞癌(HCC)、结肠直肠癌 (CRC)和乳腺癌中的表达水平提高(Hamamoto, R. et al. Nat Cell Biol 6, 731-740 (2004)" Hamamoto, R. et al. Cancer Sci 97, 113-118 (2006).)。有趣的是，用抗SMYD3抗体进行Western印迹分析，所有受检的乳腺癌组织都显 示了分子量为45-kDa和42-kDa的两个条带，但在正常乳腺中这两个条带均 未检测到。45-kDa和42-kDa两个条带均在HCC、 CRC和乳腺癌细胞系(图 8a)以及正常睾丸(数据未显示)中观察到。SMYD3的预测分子量为45kDa, 在我们的RT-PCR分析中我们没有发现任何SMYD3转录物的变化型。因此， 我们假定42-kDa条带可能来自于全长SMYD3蛋白的切割。为了检测 SMYD3的切割，我们制备了表达N末端带HA标签的SMYD3或C末端带 FLAG标签的SMYD3的质粒。使用表达带HA标签的或带FLAG标签的 SMYD3蛋白的HEK293细胞的提取物，分别以抗HA抗体或抗FLAG抗体 进行免疫印迹分析。结果，我们用抗HA抗体获得了对应于N末端带HA标 签的蛋白的46-kDa的条带。而我们用抗FLAG抗体发现了 46-kDa和43-kDa 蛋白两个条带(图8b)。这个结果提示全长SMYD3蛋白在其N末端区域中发 生了切割。为了研究切割位点，我们在不表达内源性SMYD3的HEK293细 胞中外源性地表达了含有N末端带3XFLAG标签的野生型和缺失突变型 SMYD3(图8c)。与图8b的数据一致的是，在表达野生型SMYD3的细胞中， 用抗FLAG抗体进行Western印迹分析仅显示了 一个对应于48-kDa带FLAG 标签的全长蛋白的条带。然而，用抗SMYD3抗体对同一提取物的分析检测 到对应于48-kDa带FLAG标签的SMYD3和42-kDa蛋白的两个条带。用抗 SMYD3抗体使用表达N末端缺失型SMYD3 (FLAG-SMYD3-AN44， -AN99, 和-△N244)的细胞的提取物进行Western印迹分析，显示单一条带。这些数 据提示SMYD3的切割位点位于第1至第45位密码子之间。实施例7: SMYD3蛋白切割位点的确定为了尝试确定SMYD3确切的切割位点，我们从转移有免疫沉淀的带 FLAG标签的SMYD3蛋白的PVDF膜纯化出42-kDa的蛋白质(图8b)，并测 定了它的氨基酸序列。结果，鉴定出缺失了 N末端34个氨基酸的缺失型 SMYD3蛋白，其显示在第34位(天冬氨酸)和35位(脯氨酸)密码子之 间存在一个切割位点(图9a)。 SMYD3含有一个称为SET-N区域的氨基酸序 列，其位于第5和第27位密码子之间，该序列在SET域蛋白中是保守的 (Marmorstein, R. Trends in Biochem. Sci.， Vol.8 no.2, (2003); Kouzarides, T. Curr. Opin. Genet. Dev. 12， 198-209 (2002); Lachner， M and Jenuwein, T. Curr.Opin. Cell biol. 14， 286-298 (2002》。SET-N区域的氨基酉踏列的比对显示在 SMYD3和其它曱基转移酶中该区域高度相似(图9b),提示这一区域的重要 性。实施例8:经切割的SMYD3的组蛋白曱基转移活性比野生型蛋白的组 蛋白甲基转移活性提高为了研究经切割的SMYD3蛋白的曱基转移酶活性，我们在HEK293细 胞中外源性地表达了带3xFLAG标签的野生型SMYD3或缺失了 34或44个 氨基酸的缺失型SMYD3，并对这些蛋白质进行了免疫沉淀(图10a)。我们以 这些蛋白质作为酶源进行组蛋白曱基转移酶(HMTase)活性测定，显示了野生 型SMYD3的组蛋白甲基转移酶活性呈剂量依赖方式上升(图10b)。在曱基 供体S-腺苷曱硫氨酸(SAM)存在时进行的曱基化反应伴随有S-腺苷高半胱 氨酸(SAH)的产生，该SAH可能以竟争性的方式抑制曱基转移酶反应。因此 我们向反应混合物中加入了 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)将SAH水解为 高半胱氨酸和腺苷。正如我们所预料的，我们观察到与不存在SAHH时相比， 存在SAHH时的组蛋白曱基转移酶活性显著上升(图10b)。这个发现对于筛 选SMYD3的曱基转移酶抑制剂是有用的。令人惊奇的是，经切割的SMYD3 蛋白的组蛋白曱基转移酶活性明显高于全长SMYD3蛋白(图10b)。这个结 果提示在人细胞中翻译后切割机制参与了 SMYD3组蛋白甲基转移酶活性的 调节，而且N末端SET-N区域可能对组蛋白曱基转移酶活性具有抑制作用。实施例9: SET-N区域中的甘氨酸15和17对组蛋白甲基转移酶活性是 重要的为了确定SET-N区域中保守氨基ll/f列对受抑制的酶活性的重要性，我粒，其中所述突变型SMYD3蛋白为SMYD3-SETNml， -SETNm2，或 -SETNm3(图lla),分别含有以下取代Glyl5Ala和Glyl7Ala、 Glyl5Ala、 或Gly27Ala。表达这些突变型蛋白的HEK293细胞的溶解物的Western印迹 显示以上取代对SMYD3蛋白的切割无影响(图lib,上图面)。我们用免疫沉 淀的SMYD3蛋白进行了组蛋白曱基转移酶测定。结果显示，含有Glyl5Ala 或Gly27Ala的突变型蛋白质(SMYD3-SETNm2或SETNm3)的组蛋白曱基转 移酶活性与野生型蛋白相似(图llc)。而含有Glyl5Ala和Glyl7Ala两个取代的突变型蛋白质(SMYD3-SETNm 1)的组蛋白曱基转移酶活性明显高于野生 型蛋白(图llc)。这些数据提示甘氨酸15和17可能对调节SMYD3的组蛋白 曱基转移酶活性有重要作用。
实施例10: N末端10个氨基酸的缺失对提高组蛋白甲基转移酶活性起 关键作用
既然SMYD3的N末端区域提高了其酶活性，我们假定了两种可能的机 制N末端区域可能与未确定的酶活性负调控因子(negative regulatory factor) 締合，或者该缺失可能导致蛋白质的构象改变从而导致酶活性提高。为了确 定是否另外的负调控因子对酶活性可能起作用，我们制备了野生型和N末端 缺失的SMYD3的重组蛋白，并研究了它们的体外组蛋白曱基转移酶活性。 如图12所示，与野生型蛋白相比，所有的缺失型突变体(SMYD3-AN9，-AN19, -△N29, -AN44, -AN74)均显示曱基转移酶活性提高了 4至5倍(图12)。这个 结果提示另外的因素不太可能介入切割型SMYD3的活性^:高，N末端的10 个氨基酸可能对曱基转移酶活性的抑制具有关键作用。
讨论
本文公开了下列发现SMYD3对RB1的第824位赖氨酸具有体外和体 内甲基转移酶活性，并且曱基化的RB1比未曱基化的RB1更易于被CDK7 细胞周期蛋白复合物磷酸化。因此，表达SMYD3的HEK293-SMYD3细胞 比HEK293模拟细胞显示出提高的E2F转录活性，这与SMYD3的促生长效 应很一致，因为E2F-1的过度表达可以通过调节一系列基因而促进细胞周期 从G1期到S期过渡，这些基因的产物对细胞增殖是必需的。Harbour等人 提供了在Gl-S行进期中的RB1磷酸化模型，其中RB1的磷酸化引发了在C 末端区域和口袋结构域之间的顺序的分子内相互作用(Harbour, J. W. et al., D. C. Cell 98, 859-69 (1999))。在G1期中，CDK4/6细胞周期蛋白D对RB1的 C末端区域的磷酸化触发与中心口袋结构域之间的分子内相互作用，该作用 抑制HDAC结合，从而阻断活性转录阻抑。该相互作用^f足进CDK2/细胞周 期蛋白E与RB1的第567位丝氨酸接近，进而导致sA/B界面(A/B interface ) 的破坏并阻止RB1与E2F之间的相互作用。在此才莫型中，CDK4/6细胞周 期蛋白D复合物和CDK2/细胞周期蛋白E复合物对RB1的连续的磷酸化作 用是E2F解离必需的(Lundberg, A. S. & Weinberg, R, A. Mol Cell Biol 18,753-61 (1998))。根据报道，RB1中Thr821和Thr826的磷酸化阻止了 A/B 口 袋结构域与包括E2Fs和HDACs在内的含有LXCXE基序的蛋白质之间的 相互作用，而Ser807和Ser811的磷酸化使C末端域失活。以上数据与本文 表达SMYD3的细胞具有较高的E2F转录活性的发现一致，由于SMYD3对 RB1的曱基化增进了 CDK2/细胞周期蛋白E或CDK6/细胞周期蛋白D复合 物引起的磷酸化，Thr821/826的磷酸化水平提高。或者，赖氨酸824的曱基 化可能直接改变C末端区域的构象，从而抑制口袋结构域与E2F的締合， 因为组蛋白和p53的赖氨酸甲基化均引起它们的构象变化(Tsuge， M. et al. Nat Genet 37， 1104-7 (2005))。由于SMYD3增加E2F的转录活性，升高的 SMYD3可能作为一种正反馈机制提高E2F的活性。因此SMYD3介导的RB1 失活可能对人癌发生起着决定性作用。
值得注意的是，RB1通过几种机制在转录阻抑中起作用RB1与转录因 子相互作用并直接抑制它们的活性；RB1被募集到启动子区域中阻断前引发 复合物的组装；它也与I类HDAC(HDAC-l,-2,和3)締合，引起组蛋白的去 乙酰化，导致构象变化为异染色质状态；它与DNMT1形成一种复合物而导 致靶基因启动子区域内的DNA曱基化(Harbour， J. W. & Dean, D. C. Genes Dev 14, 2393-409 (2000); Robertson, K. D. et al. Nat Genet 25, 338-42 (2000))。 除了以上机制外，最近的关于组蛋白曱基化的研究披露了 RBI也与组蛋白 曱基转移酶締合，所述组蛋白曱基转移酶包括SUV39H和Suv4-20hl或 Suv4-20hl,它们分别与H3-K9和H4-K20的曱基化有关(Gonzalo, S. et al. Nat Cell Biol 7, 420-8 (2005); Nielsen, S. J. et aL Nature 412， 561-5 (2001))。与这些 曱基转移酶结合后，RBI通过募集HP1或CBX进入复合物而稳定异染色质 形成。本文的发现为组蛋白H3-K4曱基转移酶的转录激活的调节引入了新的 见解。在赖氨酸824曱基化的RBI提高RBI的磷酸化，随后可能通过从中 心口袋结构域释放E2F1而提高E2F1的反式激活。此外，曱基化的RBl可 能改变它的构象而使HDACs、异染色质蛋白1 (HPl)和/或chromobox蛋白 (CBXs)]从曱基转移酶SUV39H和/或Suv4-20hl的复合物解离，从而引起 H3-K9和H4-K20的曱基化减少。尽管进一步的研究是有理由的，这些数据 已经凸现出RB1的曱基化在调节负责E2F的基因中的重要性。由于RB1与 不同的曱基转移酶结合，RB1曱基化的位置和程度可由于不同的曱基转移酶而不同。考虑到RB1也在不同的残基上被磷酸化，这些数据提示RB1的多 种修饰的组合可能决定了它的生物学性质，这使人想起组蛋白和p53的修饰。
RB1突变不仅与散发性和家族性视网膜母细胞瘤有关(Weinberg， R. A. Science 254， 1138-46 (1991))，也与人类其它癌症有关(Classon, M. & Harlow， E. Nat Rev Cancer 2, 910-7 (2002))。在某些类型的癌症中，数种癌基因病毒 蛋白如&泉病毒El A, HPV-E7和猿猴空泡病毒40(SV40)大T抗原(large T antigen )与RBI締合，其抑制RBI和E2F之间的相互作用，引起E2F的解 离(Chellappan, S. R, et al. Cell 65, 1053-61 (1991); Bagchi, S" et al. Cell 65, 1063-72(1991))。在癌细胞中，p16， 一种细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂， 经常由于其启动子的曱基化而被失活，致使CDK/细胞周期蛋白复合物对 RBI的磷酸化提高(N丽o， G, J., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96， 12754-9 (1999))。已报道这些缺陷涉及部分结肠直肠癌和肝细胞癌(Chaubert， P. et al. Hepatology 25, 1376-81 (1997); Toyota, M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 8681-6(1999))，这些缺陷可能不能解释这些类型的肿瘤的所有病例。本文披 露了一种RBI失活的新机制，即由RBI的曱基化和随后的RBI磷酸化水平 的提高导致的失活。由于在大多数结肠直肠癌和肝细胞癌中SMYD3的表达 水平提高，SMYD3可能通过消除RB1肿瘤阻抑物功能而反式激活E2F,从 而在癌细胞增殖中起关键作用。有趣的是，本发明人最近发现E2F-1通过与 SMYD3启动子区域的E2F-1结合元件(E2F-1 binding element)相互作用而 调节SMYD3的表达，该结合元件包含E2F-1结合基序(E2F-1 binding motif) 的两个或三个串联重复序列(tandem repeats )。在日本结肠直肠癌(11=350)、 肝癌(r^360)和乳腺癌(n-334)患者中，所述三重复序列的等位基因频率明显 高于来自日本普通人群的健康对照组(『730)。以上数据提示一旦SMYD3被 激活，它就通过修饰RB1而提高E2F的转录活性，从而通过正反馈而上调 SMYD3。因此，含有E2F-1结合元件的三重复序列的人群比含有二重复序 列的人群更容易发生SMYD3引起的RB1的失活。此外，抑制SMYD3似乎 是一个有希望的结肠直肠癌和肝细胞癌以及膀胱癌和乳腺癌的治疗策略，因 为它将阻断正反馈环路，因此通过RB1的磷酸化而高效地抑制E2F-1介导 的促有丝分裂活性。
本文还揭示了 SMYD3对RB1的曱基化可能通过增强CDK/细胞周期蛋 白复合物对RB1的磷酸化而加速细胞周期从G1期向S期行进。该数据表明赖氨酸的甲基化不但对于组蛋白而且对于其它非组蛋白蛋白质例如p53和
RB1都是重要的。此外，我们的发现有助于理解参与人类癌发生的RBI调 节的新机制。
已证明表观遗传调控(epigenetic regulation)的紊乱与人类癌发生有关。 除了在调节细胞周期、DNA修复和细胞黏附的基因的启动子区域中的异常 DNA曱基化外，最近的研究披露了组蛋白甲基化在人癌发生中也被消除。 组蛋白曱基化在通过染色质结构改变的基因表达调节中起着重要作用。我们 报道过，SMYD3这种组蛋白H3的第4位赖氨酸特异性的曱基转移酶，在 包括HCC、 CRC和乳腺癌在内的数种人类癌症中过度表达(Hamamoto, R. et al. Nat Cell Biol 6， 731-740 (2004).: Hamamoto, R. et al. Cancer Sci 97, 113-118 (2006).)。在我们先前的文章中，我们显示它的表达被E2F1的转录激活所提 高，E2F1是在多种人类癌症中经常被提高的转录因子。
蛋白质的功能不仅在转录后水平受调节，而且受翻译后修饰的调节，翻 译后修饰包括蛋白质的切割和其它广为人知的修饰如乙酰化、磷酸化、曱基
化、糖基化和遍在蛋白化(ubiquitination)。这些修饰与蛋白质的稳定性、蛋 白质的构象和/或蛋白质-蛋白质相互作用相关，导致该蛋白质激活或失活。 我们已经发现对SMYD3的切割增进它的组蛋白曱基转移酶活性，这使人想 起一些关键酶如胃蛋白酶、胰岛素、胱天蛋白酶、PARP和MMPs的调节作 用，因为对这些蛋白质的切割增进了它们的酶活性。这一发现还提示，某种 尚未确定的SMYD3切割机制可能在组蛋白甲基转移酶活性的调节中起作 用。因此负责该切割的蛋白酶的鉴定和调节机制的阐明将有助于开发抑制 SMYD3活性的新的治疗途径。而且，与全长蛋白质相比，SMYD3的切割形 式在筛选SMYD3抑制剂中可能更有用。
活性，提示该缺失可能使SMYD3的构象改变而引起其酶活性提高。有趣的 是，HSP90与SMYD3的N末端区域结合，导致SMYD3的组蛋白曱基转移 酶活性升高。这一数据与组蛋白曱基转移酶活性改变涉及其构象改变的观点 十分符合，因为HSP90发挥了分子伴侣样功能(chaperone-like fonction)， 该功能有助于稳定正常的蛋白质结构。我们的发现也强调保守性SET-N区域 在组蛋白曱基转移酶活性调节中的重要性。该保守性区域可能也作为在其它含有SET域的蛋白质中的组蛋白曱基转移酶的负性调节剂。进一步的研究将
揭示在含有SET域的蛋白质中的组蛋白甲基转移酶活性调节的机制。
我们在此处已经显示SMYD3蛋白的N末端切割形式在癌细胞中表达， 并且相比于全长蛋白，该切割蛋白的组蛋白曱基转移酶活性显著提高。这些 数据暗示，某种翻i奪后调节系统通过可能的蛋白质构象变化而调节该蛋白质 的组蛋白曱基转移酶活性。而且，我们已发现添加SAHH提高SMYD3的曱 基转移酶活性。我们的发现将有利于更好地理解SMYD3活性的调节机制， 且可能有助于确定抑制组蛋白曱基转移酶活性的新治疗策略。
工业应用性
本发明中描述的方法可用于鉴定其它用于预防、诊断和治疗各种癌症 的分子靶标，所述的癌症包括结肠直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌和膀胱癌。 而且，此处报道的数据增加了对癌症的全面了解，促进了新的诊断策略的开 发，并为癌症的治疗和预防药物的分子靶标的鉴定提供了线索。这些信息 有助于更深入地了解肿瘤发生，并为开发新的诊断、治疗和最终预防癌症 的方案提供了指标。虽然本发明已经参考它的具体的实施方式得到了详细 描述，需要了解的是上述说明的本质是示范性和解释性的，意图在于举例说 明本发明及其优选的实施方式。通过常规的实验，本领域的技术人员可容易 地认识到在不脱离本发明精神和范围的条件下的各种变化和修改。因此，本 发明意图不是被说明书，而是被下述权利要求和它们的等同物所限定。
权利要求
1. 一种鉴定作用因子的方法，所述作用因子调节SMYD3对视网膜母细胞瘤的甲基化，所述方法包括a.在存在作用因子以及适合视网膜母细胞瘤肽甲基化的条件下，使具有甲基转移酶活性的SMYD3多肽与待甲基化的视网膜母细胞瘤肽和辅因子接触，其中所述SMYD3多肽选自i.包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽；ii.包含SEQ ID NO2中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成之多肽等价的甲基转移酶活性；iii.包含与SEQ ID NO2具有至少约80％同源性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成之多肽等价的甲基转移酶活性；vi.由在严紧条件下与由SEQ ID NO1所示核苷酸序列组成之多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成之多肽等价的甲基转移酶活性；和v.包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第117至246位的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO2所示氨基酸序列组成之多肽等价的甲基转移酶活性；b.检测视网膜母细胞瘤肽的甲基化水平；以及c.将步骤(b)的甲基化水平与不存在所述作用因子时检测的对照水平进行比较，其中甲基化水平相比于对照水平的提高或降低提示所述作用因子调节SMYD3对视网膜母细胞瘤的甲基化。
2. 权利要求1的方法，其中视网膜母细胞瘤肽是包含SEQ ID NO: 4所 示氨基S^f列的多肽，或它的功能性突变体或片段。
3. 权利要求1的方法，其中所述辅因子是S-腺苷高半胱氨酸水解酶 (SAHH)。
4. 用于检测待测化合物调节视网膜母细胞瘤曱基化能力的试剂盒，所述 试剂盒包括以下组分a.选自下组的具有曱基转移酶活性的SMYD3多肽i. 包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽；ii. 包含如SEQ ID NO: 2中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入的氨 基酸序列的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列组成 之多肽等价的曱基转移酶活性；iii. 包含与SEQIDNO:2具有至少80%同源性的氨基酸序列的多肽， 其中该多肽具有与由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列组成之多肽等价的曱基 转移酶活性；iv. 由在严紧条件下与由SEQIDNO: 1所示香酸序列组成之多核芬酸 杂交的多核普酸所编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO: 2所示氨 基酸序列组成之多肽等价的曱基转移酶活性；和v. 包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列第117至246位的氨基g吏序列的 多肽，其中该多肽具有与由SEQIDNO: 2所示氨基酸序列组成之多肽等价 的曱基转移酶活性；b. 能够被(a)所述多肽曱基化的视网膜母细胞瘤肽，以及c. 用于视网膜母细胞瘤肽曱基化的辅因子。
5. 权利要求4的试剂盒,其中所述视网膜母细胞瘤肽是包含SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的多肽，或者它的功能性突变体或片段。
6. 权利要求4的试剂盒，还包括下述成分 a. S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)。
7. 用于筛选治疗癌症的化合物的方法，所述癌症选自结肠直肠癌、肝细 胞癌、膀胱癌和乳腺癌，该方法包含下列步骤a. 利用权利要求1的方法鉴定调节曱基化的待测化合物，以及b. 选择如下所述的待测化合物其与不存在待测化合物时检测的对照曱 基化水平相比降低待曱基化的底物的曱基化水平。
8. 用于减轻癌症症状的组合物，所述癌症选自结肠直肠癌、肝细胞癌、 膀胱癌和乳腺癌，所述组合物包含药学有效量的权利要求7的方法所鉴定的 化合物和药学可接受的载体。
9. 用于减轻癌症症状的方法，所述癌症选自结肠直肠癌、肝细胞癌、膀 胱癌和乳腺癌，所述方法包括使癌细胞与药学有效量的权利要求7的方法所 鉴定的化合物接触。
10. 权利要求1的方法，其中部分(iii)中定义的多肽包含与SEQ ID NO: 2有至少大约95%同源性的氨基酸序列。
11. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽含有包括最多达20 个保守氨基酸取代的SEQ ID NO: 2所示氨基l拼列。
12. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽包含SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列中第1至250位的氨基S吏序列。
13. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽包含SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列中第45至428位的氨基S臾序列。
14. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽包含缺失了第1至30 位氨基酸的SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
15. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽包含缺失了第1至44 位氨基酸的SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
16. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽包含缺失了第1至20 位氨基酸的SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
17. 权利要求1的方法，其中部分(ii)中定义的多肽包含缺失了第1至10 位氨基酸的SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。
18. 权利要求1的方法，其中部分(iv)中定义的多肽在高严紧条件下特异 性地与由SEQ ID NO: 1所示核苦酸序列组成的多核苷酸杂交。
19. 权利要求2的方法，其中所述功能性视网膜母细胞瘤片段包含C末 端片段。
20. 权利要求2的方法，其中功能性视网膜母细胞瘤片段由SEQ ID NO: 4所示氨基S吏序列中第769至921位的氨基酸序列组成。
21. 权利要求2的方法，其中功能性视网膜母细胞瘤突变体包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，该序列包括一个或多个下述突变K889A、 K896A、 K791A、 K814A、 K791A/K824A和K814A/K824A。
全文摘要
本发明涉及利用测定多肽的甲基转移酶活性以及筛选甲基转移酶活性调节剂，更具体为SMYD3对视网膜母细胞瘤的甲基化的调节剂的方法。本发明进一步提供了利用如此鉴定的调节剂预防或治疗癌症的方法或药物组合物，所述癌症包括结肠直肠癌、肝细胞癌、膀胱癌和/或乳腺癌。SMYD3(又称ZNFN3A1)具有更高的甲基化活性。Lys824是RB1蛋白上优选的SMYD3甲基化位点。
文档编号C12Q1/48GK101273142SQ20068003227
公开日2008年9月24日 申请日期2006年6月23日 优先权日2005年7月1日
发明者中村佑辅, 中鹤修一, 古川洋一, 浜本隆二 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司