主要包含GLCNACMAN₃GLCNAC₂糖形式的免疫球蛋白的制作方法

专利名称：：主要包含GLCNACMAN₃GLCNAC₂糖形式的免疫球蛋白的制作方法主要包含GLCNACMAN3GLCNAC2糖形式的免疫球蛋白发明背景(1)发明领域本发明涉及组合物和生产组合物的方法，所述组合物包含具有N-连接的糖基化模式的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，所述N-连接的糖基化模式由作为主要N-聚糖的GlcNAcMan3GlcNAc2组成。所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构对所述免疫球蛋白的特定效应物功能具有调节效果。(2)相关技术的描述糖蛋白在人类和其他哺乳动物中介导许多必需的功能，包括催化、信号转导、细胞-细胞通信，以及分子识别和締合。在真核生物中糖蛋白构成了非胞质蛋白的主要部分(LisandSharon,1993,Eur.J.Biochem.218:1-27)。在最近二十年，许多糖蛋白已经被采用用于治疗目的，天然发生的糖蛋白的重组版本成为生物技术工业的主要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白的实例包括促红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、干扰素i(IFN-y)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒毛膜促性腺激素(hCH)(Cummmge^/.,1991,Glycobiology1:115-130)。随着作为潜在的预防试剂和治疗试剂产生的重组蛋白接近临床，重组生产的糖蛋白的糖基化模式中的变化近来在科学界是大量关注的主题。抗体或免疫球蛋白是在体液免疫反应中起到中心作用的糖蛋白。抗体可以被看作衔接分子，其提供了体液和细胞防御机制之间的连接。抗体的抗原特异性识别引起免疫复合物的形成，其可以活化多种效应机制，引起所述复合物的消除和破坏。在免疫球蛋白(Ig)的一般种类中，五类(同种型)抗体——IgM、IgD、IgG、IgA和IgE——可以生物化学上以及功能上辨别开，而包括在可变区中的更细微的差异是抗原结合的特异性的原因。这五种免疫球蛋白之中，仅存在两种轻链，其被称为lambda(入)和kappa(k)。在具有X或k链的抗体之间没有发现功能差异，两种类型的轻链的比例在物种和物种之间不同。存在五种重链种类或同种型，这些决定了抗体分子的功能活性。每种免疫球蛋白在免疫反应中具有特定的功能，它们的独特功能特征是由重链的羧基末端部分赋予的，在此它不与轻链締合。IgG是血浆中最丰富的免疫球蛋白同种型(参见,例如Immunobiology,Janeway"a/,6thEdition,2004,GarlandPublishing,NewYork)。IgG分子包含具有恒定区和可变区的Fab(抗原结合片段)结构域和Fc(结晶的片段)结构域。每个重链的CH2结构域在天冬酰胺残基上含有将N-聚糖连接到免疫球蛋白分子的N-连接的糖基化的单个位点，通常在天冬酰胺残基297(Asn-297)(Kabat"a/.,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,FifthEd.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)。N-连接的低聚糖(oligosaccharide)的结构和功能方面的分析是生物学感兴趣的，有三个主要原因(1)CH2结构域的糖基化在进化中是保守的，表明了低聚糖的重要作用；(2)免疫球蛋白分子充当了低聚糖异质性分析的模型系统(RademacherandDwek,1984;Rademacher"a/.,1982);以及(3)抗体包含两条重链的二聚締合，其将两个低聚糖单位置于相互直接接触中，从而免疫球蛋白分子包括了特殊的蛋白-碳水化合物和碳水化合物-碳水化合物相互作用。已经显示了免疫球蛋白的不同糖基化模式与不同的生物学性质相关联(JefferisandLund,1997,AntibodyEng.Chem.Immunol.,65:111-128;WrightandMorrison,1997,TrendsBiotechnol.，15:26-32)。然而，仅少数的特定糖形式已知赋予期望的生物学功能。例如，在N-连接的聚糖方面具有降低的海藻糖基化的免疫球蛋白组合物被报道具有对人类FcyRIII的增强的结合以及因而增强的抗体依赖性细胞细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)(Shields"a/.,2002,J.BiolChem,277:26733-26740;ShinkawaWa/.,2003,J.Biol.Chem.278:3466-3473)。并且，在CHO细胞中生成的海藻糖基化的G2(Gal2GlcNAc2-Man3GlcNAc2)IgG的组合物被报道提高了补体依赖性纟田月包毒性(complement-dependentcytotoxicity,CDC)达到比异源4元体的组合物更大的程度(Raju,2004，美国公开的专利申请No.2004/0136986)。还提出的是，针对肺瘤的最佳的抗体将是优先地结合活化Fc受体(FcyRI、FcyRIIa、FcyRIII)以及最低限度地结合抑制性FcYRIIb受体的抗体(ClynesW"/.,2000,Nature,6:443-446)。因此，富集免疫球蛋白糖蛋白的特定糖形式的能力是高度期望的。一般地，糖蛋白上的糖基化结构(低聚糖)将取决于表达宿主和培养条件而变化。在非人类宿主细胞中产生的治疗性蛋白可能含有非人类糖基化，其可能在人类中引发免疫原性反应，例如，酵母中的超甘露糖基化(Ballou,1990,MethodsEnzymol.185:440-470);植物中的ct(1,3)-海藻糖和卩(1,2)-木糖(Cabanes-Macheteau"1999,Glycobiology,9:365-372);中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi"a/.,1995.J.Biochem.117:5-62);以及，小鼠中的Gala-1,3Gal糖基化(Borrebaeck""/.,1993,Immun.Today,14:477-479)。此外，半乳糖基化可以随细胞培养条件而变化，取决于它们的特定半乳糖模式，其可以使得某些免疫球蛋白组合物有免疫原性(Patele"/.，1992.BiochemJ.285:839-845)。非人类哺乳动物产生的糖蛋白的低聚糖结构倾向于与人类糖蛋白的那些更紧密地相关。因而，大多数商业上的免疫球蛋白在哺乳动物细胞中产生。然而，哺乳动物细胞作为蛋白质生产的宿主细胞具有几个重要的缺点。除了费用高之外，在哺乳动物细胞中表达蛋白的过程产生了糖形式的异质性群体，具有低的体积滴度(volumetrictiters),并且需要进行中的(ongoing)病毒防范和大量时间来产生稳定的细胞系。要理解的是，不同的糖形式可以深刻地影响治疗性糖蛋白的性质，包括药物动力学、药效学、受体相互作用和组织特异性靶向(Graddise/《2002,CurrPharmBiotechnol.3:285-297)。特别是，对于免疫球蛋白,低聚糖结构可以影响与蛋白酶抗性有关的性质、FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、与补体复合物CI的结合，其诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，以及与FqR受体的结合，其对调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)途径、吞噬作用和抗体反馈负责。(NoseandWigzell,1983;LeatherbarrowandDwek,1983;Leatherbarrow"a/.,1985;WalkerWa/.,1989;CarterWa/.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289)。由于不同的糖形式与不同的生物学性质相关，富集一种或多种特定糖形式的能力可以用于阐明特定糖形式和特定生物学功能之间的关系。在期望的生物学功能与特定的糖形式模式相关联之后，可以产生对于有益的糖形式结构富集的糖蛋白组合物。因而，生产对于特定糖形式富集的糖蛋白组合物的能力是高度期望的。发明概述本发明提供了包含多种免疫球蛋白或免疫球蛋白片段(apluralityofimmunoglobulinsorimmunoglobulinfragments)的组合物,每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖(atleastoneN-glycanattachedthereto),从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖种类(thepredominantN-glycanspecies)基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。因而，本发明提供了包含免疫球蛋白或片段的组合物，所述免疫球蛋白或片段具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖。在特定实施方式中，所述多种N-聚糖的大于20摩尔百分比基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。在更进一步的实施方式中，所述多种N-聚糖的大于50摩尔百分比基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。在更进一步的实施方式中，所述多种N-聚糖的大于75摩尔百分比基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。在更进一步的实施方式中，所述多种N-聚糖的大于90百分比基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。在其他实施方式中，所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述多种N-聚糖的第二主要N-聚糖结构约5摩尔百分比到约50摩尔百分比。进一步提供的是包含抗CD20抗体的组合物，所述抗CD20抗体具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖。此处的组合物包含的免疫球蛋白或片段展现了对FcyRIIa和/或FcyRIIb受体的降低的结合亲和性以及对FcyRIIIa和/或FcyRIIIb受体的提高的结合亲和性。因而，在一个方面，本发明提供了包含多种免疫球蛋白或片段的组合物，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成，其中所述免疫球蛋白或片段展现了对FcryRIIa和/或FcyRIIb受体的降低的结合亲和性。在另一个方面，本发明提供了包含多种免疫球蛋白或片段的组合物，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成，其中所述免疫球蛋白或片段展现了对FcyRIIIa和/或FcyRIIIb受体的提高的结合亲和性。在进一步的方面，本发明提供了包含多种免疫球蛋白或片段的组合物，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成，其中所述免疫球蛋白或片段预计展现提高的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。在本发明的更进一步的方面中，本发明的上述组合物包含免疫球蛋白或片段，其基本上没有海藻糖或缺乏海藻糖。本发明的组合物还包含药物组合物和药学上可接受的载体。本发明的组合物还包含免疫球蛋白或片段的药物组合物，所述免疫球蛋白或片段被纯化并掺入到诊断试剂盒中。本发明进一步提供了生产包含多种免疫球蛋白或片段的任何一种上述组合物的方法，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。在一个方面，所述方法包括培养宿主细胞、优选的真核生物宿主细胞的步骤，所述宿主细胞被遗传地修饰或选择以表达所述免疫球蛋白或片段。在特定的方面，所述宿主细胞包含编码免疫球蛋白或片段的外源基因。优选的，所述宿主细胞被遗传地修饰或工程化以产生糖蛋白，所述糖蛋白是对于GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖被富集的。因而，在特定的方面，所述宿主细胞包括选自由a-1,2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶II、UDP-GlcNAc转运蛋白和GlcNAc转移酶(GnTl)构成的组的一种或多种外源基因。优选的，上述宿主细胞还对于由0CH1和同源物编码的a-l,6-甘露糖基转移酶活性是缺陷的。在进一步的实施方式中，上述宿主细胞还对于甘露糖基磷酸化活性是缺陷的，并且在更进一步的实施方式中，上述宿主细胞还在(3-甘露糖基化活性方面是缺陷的。因而，本发明提供了生产包含多种免疫球蛋白或片段的组合物的方法，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMari3GlcNAc2组成，包括(a)提供上述真核生物宿主细胞；(b)在培养基中生长所述真核生物宿主细胞一定时间，足以所述真核生物宿主细胞产生所述免疫球蛋白或片段；和，(c)分离所述免疫球蛋白或片段来产生所述组合物。在优选的方面，所述宿主细胞是低等真核生物。低等真核生物细胞包括酵母、真菌、环-鞭毛虫、小孢子虫、alveolates(例如，曱藻)、stramenopiles(例如，褐藻、原生动物)、红藻门(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、莒藓)和其他原生生物。酵母和真菌包括^f旦不卩艮于，尸,'c/z/asp.，例3口尸/c//a/7aWonW、尸/c/n'a力/7/aw力c"、尸/c'/zza((9gflraeaw/ww/^、尸zc/7za/z力d"en')、尸Zc/z/a、尸zc/".a〃化/777o/o/en3/^、尸z.c'/z/'"5^//"an'a、尸/c/z/agwen:www、尸/c/zz"/z)》e〃.、尸/c/z/"^s77/7/^禾口尸/'c/z/"we/7M76>//c";5""cc/"rcw2少c^sp.，例如5^cc/"ram_vcwcerev/w'ae;//(2wseww/a/^(yworp/za、《/w_yverow_ycessp.,例,、y^perg/〃w51、7Wc/zo(ier顧reese/、C7z，aypo〃'ww/wc^ovve附e、Fws"n'wwsp.,例啧口Fm、anwmgra附/wew附、Fwsanwwve/ewWw附、尸/_>^'6'(9/2///^〃"/7"/^附、禾口iVewoy/7ora;cr"kWa。本发明的Y尤选的i氐等真核生物包才舌i^旦不卩艮于尸zc'/7/"paWorw、尸/<^/'"//'"/""(^'￡:"、P/c/zz"尸/c/nawip"s、尸zc/n'awe//ztmo//C(3、尸/c/z/"sp.、Sacc/zarowycescereWw'ae、Sacc/zor謹7ce51sp.、//arae膝/a戶/，o/za、A7wyverowycwsp.、/wc如owerae、Fw5an'應sp.Fwra〃'訓gr謹z力e謂、Fw、ra〃.画vewew^纖和因而，本发明进一步提供了在低等真核生物宿主细胞中生产任一种上述包含多种免疫球蛋白或片段的组合物的方法，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。在特定的方面，所述低等真核生物宿主细胞包含编码免疫球蛋白或片段的外源基因，并且所述宿主细胞被遗传地修饰或工程化以产生糖蛋白，所述糖蛋白是对于GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖被富集的。因而，在特定的方面，所述低等真核生物宿主细胞包括选自由a-l,2-甘露糖苷酶、甘露糖苷酶II、GlcNAc转移酶(GnTl)和UDP-GlcNAc转运蛋白构成的组的一种或多种外源基因。优选的，上述低等真核生物包括前述外源基因的每一种。优选的，上迷低等真核生物宿主细胞还对于由基因OCHlp或其同源物编码的a-l,6-甘露糖基转移酶活性是缺陷的。在进一步的实施方式中，上述低等真核生物宿主细胞还对于甘露糖基磷酸化活性是缺陷的(PNOl和MNN4b基因的删除或破坏)，在更进一步的实施方式中，上述真核生物宿主细胞还在(3-甘露糖基化活性方面是缺陷的(涉及卩-甘露糖基化的一种或多种基因的删除或破坏)。因而，本发明提供了生产包含多种免疫球蛋白或片段的组合物的方法，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成，包括(a)提供上述低等真核生物宿主细胞；(b)在培养基中生长所述低等真核生物宿主细胞一定时间，足以使所述低等真核生物宿主细胞产生所述免疫球蛋白或片段；和，(c)分离所述免疫球蛋白或片段来产生所述组合物。本发明进一步提供了提高免疫球蛋白或片段与FcyRIIIa和/或FcyRIIIb受体的结合以及降低免疫球蛋白与FcyRIIa和/或FcyRIIb受体的结合或提高ADCC的方法，通过在前述宿主细胞之一中产生免疫球蛋白，所述宿主细胞被工程化或选择来表达所述免疫球蛋白，在所述免疫球蛋白中GlcNAcMan3GlcNAc2是主要N-聚糖。除非在此另外定义，与本发明关联使用的科学和技术术语和用语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步的，除非上下文另外需要，单数的术语应当包括复数，复数的术语应当包括单数。一般地，相关使用的命名，以及在此描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域公知和通常使用的。定义除非另有说明，以下术语应当理解为具有以下含义。如在此使用的，术语"抗体"、"免疫球蛋白"和"免疫球蛋白分子"可互换地使用。每种免疫球蛋白分子具有独特的结构，其容许它结合它的特异性抗原，但是所有免疫球蛋白具有在此描述的相同的整体结构。基础的免疫球蛋白结构单位已知包含亚单位的四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链配对组成，每个配对具有一个"轻"链(约25kDa)和一个"重"链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要对抗原识别负责的约100到110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分划定了主要对效应物功能负责的恒定区。轻链被分类为kappa或lambda。重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon,并分另'J定义了抗体的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。轻《连和重《连再分为可变区和恒定区(一4殳参见，FundamentalImmunology(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.,1989),Ch.7。每个轻链/重链配对的可变区形成抗体结合位点。因而，完整的抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点是相同的。链都展现了由三个高变区、也称为互补决定区或CDR连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。每个配对的两条链的CDR通过框架区对准，允许与特定的表位结合。该术语包括天然发生的形式，以及片段和衍生物。包括在该术语的范围内的是免疫球蛋白(Ig)种类，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。还包括在该术语的范围内的是IgG表达亚型，即，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。该术语按照广义使用，包括单一的单克隆抗体(包括激动性和拮抗性抗体)，以及将结合多个表位或抗原的抗体组合物'。该术语特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们含有或被修饰含有免疫球蛋白重链恒定区的CH2结构域的至少一部分，所述部分包含CH2结构域的N-连接的糖基化位点或其变体。包括在该术语内的是仅包含Fc区的分子，例如免疫粘附素(美国公开的专利申请NO.20040136986)、Fc融合物和抗体样分子。做为另一种选择，这些术语可以指代至少Fab区域的抗体片段，其至少含有N-连接的糖基化位点。术语"Fc"片段是指含有CH2和CH3结构域的抗体的"片段结晶的"C-末端区域(附图1)。术语"Fab"片段是指含有VH、CH1、VL和CL结构域的抗体的"片段抗原结合"区域(参见附图1)。此处使用的术语"单克隆抗体(mAb)，，是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突变之外，组成所述群体的各抗体是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个的抗原性位点。此外，与常规的(多克隆的)抗体制品相比，每个mAb针对抗原上的单个决定因子，常规的抗体制品一般地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除它们的特异性之外，单克隆抗体的益处是它们可以通过杂交瘤培养来合成，没有被其他免疫球蛋白污染。术语"单克隆"表明了抗体是从基本上同质的抗体群体获得的特性，不能被看作是需要通过任何特别的方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等(1975),Nature,256:495首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，Cabilly等的美国专利No.4,816,567)。在术语"抗体"或"免疫球蛋白"的范围内的术语"片段"包括通过用各种蛋白酶消化产生的那些，通过化学裂解和/或化学解离产生的那些，以及重组地产生的那些，只要该片段仍然能够特异性结合目标分子。在这些片段中有Fc、Fab、Fab，、Fv、F(ab，)2和单链Fv(scFv)片段。在下文，术语"免疫球蛋白"还包括术语"片段"。免疫球蛋白进一步包括在序列上被修饰但仍然能够特异性结合目标分子的免疫球蛋白或片段，包括种间嵌合的或人源化的抗体；抗体融合物；异聚抗体复合物和抗体融合物，例如双抗体(diabody)(双特异性抗体)、单链双抗体和内抗体(intrabody)(参见，例如，IntracellularAntibodies:ResearchandDiseaseApplications,(Marasco,ed.,Springer-VeriagNewYork,Inc.,1998)。如在此使用的，术语"基本上由......组成"将理解成暗指包含声称的整体或整体的群体(inclusionofastatedintegerorgroupofintegers);而朝卜除了将实质上影响或改变该声称的整体的修饰物或其他整体。对于N-聚糖种类，术语"基本上由"声称的N-聚糖"组成"将理解为包括N-聚糖，不管该N-聚糖是否在与糖蛋白的天冬酰胺残基直接连接的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)处海藻糖基化。如在此使用的，术语"主要地(predominantly)"或变体如"主要"或"主要的是"将被理解为意思是，在糖蛋白用PNGase处理、通过质谱法例如MALDI-TOFMS或HPLC分析释放的聚糖之后，在总的中性N-聚糖中具有最高摩尔百分比(％)的聚糖种类。换句话说，用语"主要地"被定义为单个实体，例如特定的糖形式，其以比任何其他的单独实体更高的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由40摩尔百分比的A种类、35摩尔百分比的B种类和25摩尔百分比的C种类组成，该组合物主要地包含A种类，B种类将是第二主要的种类(thenextmostpredominantN-glycanstructure)。某些宿主细胞可以产生包含中性N-聚糖和带电N-聚糖如甘露糖基磷酸的组合物。因而，糖蛋白的组合物可以包括多种带电和不带电的或者中性的N-聚糖。在本发明中，它处在组合物中全部多种中性N-聚糖的环境内，所述组合物中GlcNAcMan3GlcNAc2是主要N-聚糖。因而，如在此使用的，"主要N-聚糖"是指组合物中全部多种中性N-聚糖的主要N-聚糖，该主要N-聚糖是GlcNAcMan3GlcNAc2。如在此使用的，术语"基本上没有(essentiallyfreeof)"特定糖残基，例如海藻糖或半乳糖等等，被用于表明该糖蛋白组合物基本上缺少含有这种残基的N-聚糖。按照纯度来表示，基本上没有是指含有这种糖残基的N-聚糖结构的数量不超过10%，优选的低于5%,更优选的低于1%,最优选的低于0.5%，其中所述百分比是按照重量或按照摩尔百分比。因而，在根据本发明的糖蛋白组合物中基本上所有的N-聚糖没有海藻糖、或半乳糖、或两者。如在此使用的，当在任何时候没有可检测数量的这些糖残基存在于N-聚糖结构上时，糖蛋白组合物"缺少"或"缺乏"特定的糖残基，例如海藻糖或半乳糖。例如，在本发明的优选的实施方式中，所述糖蛋白组合物通过如以上定义的低等真核生物产生，包括酵母(例如，尸z'c/nasp.;5V/cc/"ra，cessp.;AT/wyverowycessp.;血/erg7.〃w5sp.),并且将"缺乏海藻糖"，因为这些有机体不具有产生海藻糖基化N-聚糖结构所需的酶。因而，术语"基本上没有海藻糖"涵盖术语"缺少海藻糖"。然而，即使组合物曾经含有海藻糖基化N-聚糖结构或含有有限但可检测数量的如上所述的海藻糖基化N-聚糖结构，组合物可以是"基本上没有海藻糖"。抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用以及反应的变化，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)、免疫复合物的清除(吞噬作用)、B细胞的抗体生产以及IgG血清半衰期分别在以下文献中定义Daeron"a/.,1997,Annu.Rev.Immunol.15:203-234;WardandGhetie,1995,TherapeuticImmunol.2:77-94;CoxandGreenberg,2001,Semin.Immunol.13:339-345;Heyman,2003,Immunol.Lett.88:157-161;和Ravetch,1997,Curr.Opin.Immunol.9:121-125。附图的简要说明附图1显示了在每个CH2链的Asn-297处具有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构的免疫球蛋白分子的示意图。附图2A显示了pCR2.1TOPO载体中编码DX-IgGl轻链的pDX343的质粒图。附图2B显示了编码来自pDX343的Kar2(Bip)信号序列和DX-IgGl轻链的pDX344的质粒图。附图2C显示了编码pCR2.1TOPO载体中的DX-IgGl重链的pDX360的质粒图。附图2D显示了编码A0X2启动子的pPICZA载体中编码Kar2SS和来自pDX344的轻链的pDX458的质粒图。附图2E显示了编码Kar2(Bip)信号序列和来自pDX360的DX-IgGl的DX-IgGl重链的pDX468的质粒图。附图2F显示了编码Kar2SS和来自亚克隆到pDX458中的pDX360的DX-IgGl重链的pDX478的质粒图(实施例1)。.附图3显示了分离自菌林YDX554的样品F060708的MALDI-TOF光语(DX-IgGl具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为菌抹YSH37中表达的主要N-聚糖)。附图4显示了比较具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的DX-IgGl(F060708)和RITUXIMAB与FcyRIIb的结合的ELISA结合分析的结果。附图5A显示了比较具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的DX-IgGl(F060708)和RITUXIMAB与FcyRIIIa-LF表型的结合的ELISA结合分析的结果。附图5B显示了比较具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的DX-IgGl(F060708)和RITUXIMAB与FcyRIIIa-LV表型的结合的ELISA结合分析的结果。发明的详细说明本发明提供了包含具有多种N-聚糖的免疫球蛋白或片段的群体的组合物，其中主要的N-聚糖基本上由结构GlcNAcMan3GlcNAcj￡成。GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构可以特别地表示为[(GlcNAc卩1,2-Manal,3)(Manal,6)Man卩1,4-GlcNAc卩1，4-GlcNAc]。本发明在此显示了，免疫球蛋白上的GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖对特定的抗体效应物功能具有影响。例如，如在此显示的，包含主要N-聚糖是GlcNAcMan3GlcNAc2的免疫球蛋白的组合物，该免疫球蛋白具有对FqRIIIa-LF和-LV受体的提高的直接结合活性，和对FqRIIb受体的降低的(或缺乏)直接结合活性。根据上述结合活性，具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白预计介导其他抗体效应物功能，例如提高的ADCC活性或提高的B细胞抗体产生，而引起吞噬活性的降低。因而，包含具有GlcNAcMaii3GlcNAc2作为主要N-聚糖的多种免疫球蛋白的组合物，其中所述免疫球蛋白具有对FcyRIII受体的提高的结合活性和对FqRII受体的降低的结合活性。因而，所述组合物预计引起ADCC活性的提高、提高的B细胞抗体产生、以及降低的吞噬作用。本发明进一步提供了产生包含具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白的组合物的方法。产生具有主要糖形式(glycoform)的免疫球蛋白组合物的益处是，它避免了具有非期望糖形式的免疫球蛋白的产生和/或免疫球蛋白的异质混合物的产生，它们可能诱导非期望的效果和/或稀释更有效的免疫球蛋白糖形式的浓度。因而，预期的是，包含具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白的药物组合物将可能在更低的剂量有效，因而具有更高的效力或潜力。在一个方面，组合物包含的免疫球蛋白分子在Fc区上重链的CH2结构域的天冬酰胺残基编号297(Asn-297)处具有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构，其中末端GlcNAc(N-乙酰-(3-D-葡糖胺)的羟基共价连接到位置297处的天冬酰胺的酰胺基。Fc区域介导免疫球蛋白分子中的抗体效应物功能。优选的，所述GlcNAcMan3GlcNAc2聚糖结构处在二聚的免疫球蛋白的每个CH2区域的每个Asn-297残基上(参见附图1)。因而，提供的是免疫球蛋白的组合物，其中在Asn-297处的主要糖形式是GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构。做为选择，免疫球蛋白分子上存在的一种或多种其他碳水化合物部分可以被删除或添加到所述分子，因而添加或删除所述免疫球蛋白上糖基化位点的数量。进一步的，所述免疫球蛋白分子的CH2区域内的N-连接的糖基化位点的位置可以通过在免疫球蛋白分子内的一个或多个其他位置引入天冬酰胺或其他N-糖基化位点来改变。虽然Asn-297是一般存在于鼠和人类IgG分子中的N-糖基化位点(Kabat"a/.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,1991),Asn-297位点不是免疫球蛋白分子上可以被糖基化的唯一位点，也不必为了功能来维持该位点。使用已知的诱变方法，编码免疫球蛋白的核酸分子可以被修饰，从而编码包含Asn-297的N-糖基化位点的核酸序列被删除或改变成为对于N-糖基化是无功能的，在编码免疫球蛋白分子的核酸内的另一个位置引入编码N-糖基化位点的核酸序列来产生在非天然位置具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白。编码N-糖基化位点的其他核酸序列可以被引入到上述核酸中(或引入编码Asn-297N-糖基化位点的核酸)，来产生在分子内的超过一个位置上具有N-聚糖的免疫球蛋白分子，其中GlcNAcMan3GlcNAc2是主要N-聚糖。然而，优选的是在免疫球蛋白分子的CH2区域内创建所述N-糖基化位点。然而，免疫球蛋白的Fab区域的糖基化已经在30%的血清抗体中描述了-通常在Asn-75发现(Rademacher"/.,1986,Biochem.Soc.Symp.,51:131-148)。因而，在免疫球蛋白分子的Fab区域中的糖基化是可以与Fc区域中的N-糖基化组合的、或单独的其他位点。一般地，所述组合物包含免疫球蛋白，其中主要N-聚糖是GlcNAcMan3GlcNAc2，其以一定水平存在，所述水平超过所述重组免疫球蛋白组合物的第二主要N-聚糖结构至少约5摩尔百分比。在优选的实施方式中，所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组免疫球蛋白组合物的第二主要N-聚糖结构至少约10摩尔百分比到约25摩尔百分比。在更优选的实施方式中，所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组免疫球蛋白组合物的第二主要N-聚糖结构至少约25摩尔百分比到约50摩尔百分比。在更优选的实施方式中，所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组免疫球蛋白组合物的第二主要N-聚糖结构大于约50摩尔百分比。在更优选的实施方式中，所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组免疫球蛋白组合物的第二主要N-聚糖结构大于约75摩尔百分比。在最优选的实施方式中，所述GlcNAcMaii3GlcNAc2N-聚糖结构以一定水平存在，所述水平超过所述重组免疫球蛋白组合物的第二主要N-聚糖结构大于约90摩尔百分比。免疫球蛋白子类已经显示了具有对Fc受体的不同结合亲和性(Huizingae,a/.,1989,J.ofImmunol.,142:2359-2364)。每种子类可以在本发明的不同方面提供特别的优势。因而，提供的是包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或其混合物的组合物，其中主要N-聚糖是GlcNAcMan3GlcNAc2。在进一步的实施方式中，提供了组合物，其中GlcNAcMari3GlcNAc2是主要N-聚糖的免疫球蛋白选自由IgA、IgD、IgE、IgM和IgG构成的组。然而，优选的免疫球蛋白是选自由亚型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4构成的组的人类或人源化IgG。更优选的，优选的是所述免疫球蛋白是IgG1亚型。优选的，所述组合物包含由核酸编码的单克隆免疫球蛋白(抗体)，所述核酸当被导入宿主细胞时产生GlcNAcMan3GlcNAc2是主要N-聚糖的糖蛋白。此处的单克隆抗体包括例如"人源化的抗体"。人源化的抗体可以通过互补决定区(CDR)移植来获得(R.Kontermann&S.Duebel(2001)Recombinantantibodies—LaboratoryManuals.VerlagISBN3—540-41354-5和其中的参考文献)。CDR移植包括用单克隆抗体(例如鼠的)的高变环替换人类抗体的高变环。其他方法包括"重新平整(resurfacing)"(Duebel&Kontermann(2001),Roguska"a/.(1996)AcomparisonoftwomurinemonoclonalantibodieshumanizedbyCDR-graftingandvariabledomainresurfacing.ProtEng.9:895-904)。人源化抗体的再另一种方法包括混洗(shuffling)V-基因和在抗原上选择。V-基因的混洗可以采用噬菌体展示进行，但不局限于此(Duebel&Kontermann(2001),Jespers"a/.(1994)Guidingtheselectionofhumanantibodiesfromphage-displayrepertoirestoasingleepitope.Bio/Technol12:899-903)。因而一种来源的轻链可变区可以与来自不同来源的重链恒定区剪接，或反之，或者可变区或恒定区与异源蛋白质的融合，不考虑来源物种或免疫球蛋白类型或子类名称(参见，例如Cabilly等的美国专利No.4,816,567;MageandLamoyi,inMonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.79-97(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。人源化抗体的最常见的形式是人免疫球蛋白，其中来自人免疫球蛋白的CDR的残基被来自非人物种如小鼠、大鼠、或兔的具有期望特异性、亲和性和接受力(capacity)的CDR的残基替代。一般地，人源化抗体包括基本上所有至少一个，一般地是两个可变结构域，其中，所有的或基本上所有的CDR区相应于非人免疫球蛋白的CDR区，和所有的或基本上所有的框架区(FR)是人免疫球蛋白共有序列的框架区。FR区域是邻近于或侧翼于CDR的抗体的可变区的部分。一般地，这些FR区域具有影响可变区的构象的超过一种结构功能，并且较不直接地对抗原与抗体的特异性结合负责，然而尽管如此，FR区域可以影响相互作用。人源化抗体最理想地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。在有些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不在接受者抗体中、又不在引入的CDR或FR序列中存在的残基。进行这些修饰以进一步改善和最大化抗体性能。进一步的细节参见Jones"a/.,1986,Nature321:522-524;ReichmannWa/.,1988,Nature332:323-327,andPresta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。此处的单克隆抗体进一步包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分相同于或同源于来自第一物种的或属于特定抗体种类或子类的抗体中的序列，而链的其余部分相同于或同源于来自不同种类或属于不同抗体种类或子类的抗体中的序列，以及这样的抗体的片段，只要它们含有或被修饰以含有至少一个CH2。非人类(例如，鼠)抗体的"人源化"形式是特定的重组免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如,Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列),其含有来自人免疫球蛋白的序列。抗体的Fv片段是保持了完整分子的结合特征和特异性的抗体的最小单位。Fv片段是抗体重链和轻链的可变区的非共价締合的异二聚体。FUb)'2片段是含有通过二硫键连接的两条Fab片段的臂的片段。实施例1说明了编码嵌合抗体的表达载体的构建，所述嵌合抗体包含融合到人类IgGl的恒定区的、针对抗原CD20的小鼠IgGl可变区。具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白对FqRIII受体的提高的结合结合FcyRIIIa和/或FcyRIIIb受体的免疫球蛋白的效应物功能，例如ADCC的活化，由免疫球蛋白分子的Fc区域介导。不同的功能由这个区域内的不同结构域介导。附图6A和6B显示了包含具有GlcNAMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的抗CD20抗体的组合物(如实施例3中描述的在重组尸/c&a/7"Www中表达)，与其中抗CD20抗体(例如，RITUXIMAB)不具有GlcNAMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的组合物相比，具有提高的对FcyRIIIa受体的结合。因而，本发明提供了免疫球蛋白分子和组合物，其中所述免疫球蛋白分子上的Fc区域具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖，和其中所述免疫球蛋白分子与缺乏GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白相比在与FcyRIIIa和/或FcyRIIIb受体结合方面具有提高。有趣地，FcyRIIIa基因二态性产生两种同种型FcyRIIIa-158V和FcyRIIIa-158F(Dall，Ozzo""/.,2004,CancerRes.64:4664-4669)。FcYRIIIa-158V的基因型纯合子与对RITUXIMAB的更高临床反应相关(Cartron"a/.,2002,Blood,99:754-758)。然而，大多数群体携带一个FcyRIIIa-158F等位基因。在这个杂合的个体中，RITUXIMAB对于通过Fc丫RIIIa结合的ADCC诱导是较不有效的。然而，当RITUXIMAB样抗CD20抗体在缺乏岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中表达时，这种抗体对于通过FcyRIIIa-158F和FcyRIIIa-158V增强ADCC是相等地有效的(Niwa""/.,2004,Clin.CaneRes.10:6248-6255)。本发明的某些优选的实施方式的抗体在宿主细胞中表达，所述宿主细胞不向N-聚糖添加海藻糖(例如，尸zc/7^/aWw^，一种缺乏添加海藻糖的能力的酵母宿主)。附图5A显示了包含抗CD20抗体的组合物，所述抗CD20抗体具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖并且如实施例3中描述的在重组尸,c'/n'apaeons中表达，与RITUXIMAB相比在结合FcyRIIIa-LF受体方面具有约3到4倍提高，RITUXIMAB不具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖，附图5B显示了该组合物与RITUXIMAB相比在结合FcyRIIIa-LV受体方面具有约10倍提高。因而，预期的是，具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖并且进一步缺乏海藻糖的抗CD20抗体将具有对FcYRIIIa-158F的增强的结合，对于治疗那些具有对RITUXIMAB的降低的临床反应的个体可能是特别有用的。具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白对FcyRIIb受体的降低的结合免疫球蛋白分子的效应物功能还包括与FcyRIIb受体结合。与FcYRIIb结合因而看来引起降低的吞噬作用、B细胞的降低的抗体产生、以及降低的ADCC活性。附图4显示了包含具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的抗CD20抗体的上述组合物的免疫球蛋白与RITUXIMAB相比具有降低的对FcyRIIb受体的结合。因而，本发明提供了免疫球蛋白分子和组合物，其中免疫球蛋白分子的Fc区域具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖并且其具有降低的对FcryRIIb受体的结合。提高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白的FcyRIIIa和/或FqRIIIb结合方面的提高可能还赋予了FcyRIII介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)方面的提高。很好地确定了的是FcyRIII(CD16)受体对ADCC活性负责(Daeron"1997,Annu.Rev.Immunol.15:203-234)。具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白分子或组合物的FcyRIIa和/或FcyRIIb结合方面的降低还可能赋予了ADCC活性方面的提高(参见，Clynes"a/.，2000，上文)。因此，具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白分子或包含所述免疫球蛋白的组合物预计具有提高的ADCC活性。降低的吞噬作用(巨噬细胞对免疫复合物的清除)在又一个实施方式中，具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白的FcyRIIa结合方面的降低赋予了免疫复合物的FqRIIa介导的清除(吞噬作用)方面的降低。已经显示的是，FcyRIIa(CD32)受体对巨噬细胞的免疫复合物清除负责(CoxandGreenberg,2001,Semin.Immunol.13:339-345)。因而，预期的是具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白和包含所述免疫球蛋白的组合物可能展现降低的吞噬作用。B细胞的提高的抗体产生已经显示了抗体通过调节性FcyR途径参与对抗肿瘤(Clynes"a/.,2000,Nature,6:443-446)。特别地，已知的是，当FcyRIIb与含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的受体例如B细胞受体(BCR)、FcyRI、FcyRIII和FcyRI共交耳关时，它抑制ITAM介导的信号(VivierandDaeron,1997，Immunol.Today，18:286-291)。例如，添加FcyRII特异性抗体阻断Fc结合FcyRIIb,引起增加的B细胞增殖(Wagle"a/.,1999,JofImmunol.162:2732-2740)。从而，具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白和包含所述免疫球蛋白的组合物预计介导受体结合方面的降低，引起B细胞的活化，其接着催化浆细胞的抗体产生(Parker,D.C.1993,Annu.Rev.Immunol.11:331-360)。其他免疫学活性对细菌性感染的提高的敏感性(Ohsaka"a/.,1997,Br.J.Haematol.98:108-113)。已经进一步证明了的是，结合FcyRIIIa效应细胞受体的IgG调节肺瘤坏死因子ct的表达(TNF-qi(Blom""/.,2004，ArthritisRheum.,48:1002-1014))。此外，FcyR诱导的TNF-a还提高嗜中性粒细胞结合和吞嗟IgG包被的红血球的能力(CapsoniWa/.,1991,J.Clin.LabImmunol.34:115-124)。因而预期的是，在结合FcyRIIIa受体方面显示了提高的、具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白和包含所述免疫球蛋白的组合物也可能赋予TNF-a表达的增加。FcyRII和FcyRIII受体活性的提高已经显示了提高溶酶体|3-葡糖醛酸酶以及其他溶酶体酶的分泌(Kavai"a/.,1982,Adv.ExpMed.Biol.141:575-582;WardandGhetie,1995,TherapeuticImmunol.,2:77-94)。此外，在免疫受体通过它们的配体参与其中之后的重要的步骤是它们的内在化和向溶酶体的递送(Bonnerot"a/.,1998,EMBOJ.,17:4906-4916)。因而预期的是，在结合FcyRIIIa和/或FcyRIIIb受体方面显示了提高并具有GlcNAcMaii3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白和包含所述免疫球蛋白的组合物也可能赋予溶酶体酶分泌的提高。更成熟的骨髓细胞(例如，单核吞噬细胞、粒细胞和嗜中性粒细胞)经由与FcyRIIa结合的活化引起提高的过氧化物产生。此外，嗜中性粒细胞的过氧化物基团的产生是身体防御系统的重要因素(Hmzinga,Wa/.:1989,JImmunol.,142:2365-2369)。因而预期的是，在结合FcyRIIa受体方面显示了降低并具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白和包含所述免疫球蛋白的组合物还可能赋予过氧化物产生方面的降低。专有地在嗜中性粒细胞上存在的FcyRIIIb在免疫复合物的组装中起到主要作用，它的聚集活化了引起调理的病原体的破坏的吞噬作用、脱粒作用和呼吸'性脉沖。嗜中性粒细胞的活化引起与其两个细胞外结构域相应的受体的蛋白水解裂解可溶形式的分泌。可溶的FqRmb通过FcyR依赖性效应物功能的竟争性抑制以及经由与补体受体CR3的结合发挥调节功能，引起炎症性介体的产生(Sautes-Fridman"2003,ASHIQuarterly,148-151)。因而预期的是，在与FcryRIIIb受体结合方面显示了提高的、具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白和包含所述免疫球蛋白的组合物还可能促进免疫复合物的组装。包含具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白分子的组合物的产生所述免疫球蛋白在宿主细胞中产生，所述宿主细胞已经被遗传工程化来产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白的组合物。一般地，用编码特异于特定目标抗原的免疫球蛋白的重链和轻链的一种或多种核酸转化、优选地稳定转化重组宿主细胞。在一个实施方式中，编码免疫球蛋白的重链和轻链的核酸使用重叠寡核苷酸各自单独地合成，并各自单独地克隆到表达载体中(参见实施例1)用于在宿主细胞中表达。在特定的实施方式中，由所述核酸编码的重组免疫球蛋白是人源化的免疫球蛋白。优选的，所迷重组宿主细胞将所述免疫球蛋白分泌到用于培养所述重组细胞的培养基中。重组宿主细胞然后在适合于生产所述免疫球蛋白的条件下孵育，所述免疫球蛋白将具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖。所述免疫球蛋白然后从培养基的其他成分中分离，并重悬浮在适合的媒介物(vehicle)中来产生组合物。虽然对于许多重组免疫球蛋白，GlcNAcMan3GlcNAc2将与Asn-297的酰胺基的氮连接，但在特定的实施方式中，N-聚糖连接的位点可以是处在免疫球蛋白分子内不同位点处的天冬酰胺(除了Asn-297),或与Fab区域中的N-糖基化位点组合。重组宿主细胞可以是真核或原核宿主细胞，例如，动物、植物、昆虫、细菌细胞等等，其已经被工程化或选择来产生主要具有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构的免疫球蛋白组合物。在优选的实施方式中，其中GlcNAcMari3GlcNAc2是主要N-聚糖的所述免疫球蛋白组合物在低等真核生物中产生。低等真核宿主细胞通常不产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白，然而，低等真核生物可以被遗传地修饰以产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白。遗传地修饰以产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白的重组低等真核生物细胞优选的是那些哺乳动物细胞，其天然地但以低产量产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白。使用例如在此描述的重组低等真核生物宿主细胞的另一个优点是，免疫球蛋白的组合物可以可重复地具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖。再进一步的益处是，低等真核细胞可以在规定的培养基中生长，其避免了动物产物例如小牛血清的使用。优选的，本发明的重组宿主细胞是低等真核宿主细胞，其已经如WO02/00879,WO04/074498,WO04/074499,ChoiW《2003,PNAS,100:5022-5027;Hamilton"2003,Nature,301:1244-1246andBobrowicz"a/.,2004,Glycobiology,14:757-766,andDavidsona/,2004Glycobiology.14(5):399-407中描述的被遗传工程化或修饰。低等真核生物细胞包括酵母、真菌、环-鞭毛虫、小孢子虫、alveolates(例如，曱藻)、stramenopiles(例如，褐藻、原生动物)、红藻门(例如，红藻)、植物(例如，绿藻、植物细胞、莒藓)和其他原生生物。酵母禾口真菌包4舌i"旦不限于,尸/c/n'asp.,例如尸/c/n'a/flWor^、尸/c/n'a力力/oT7(i/cG、wz'w/a((9g"/^ea附z力w/^、尸/c/z/a/z力(i"en')、尸/c/zz'"o/w/7〃'ae、尸/cA/"W^/7s、and尸zc/u'awe/7wo/z'ca;5"acc/zarom少cessp.,4列^口Sacc/^romycescereWw'ae;//a/xye"w/a/o(ymor//w、A7w少verowycessp.，例^口f/wyi^ramyces/a"w;a/Z^'caws、A/ew'〃wsm't/w/a朋、A/erg/〃wsw扭r、Fi^an.wwsp.,如J长口F仏ran'wwgra/n'"eww、Fwanw附vewewa/iwz、/Vz>vvc'o/m/7*e〃"/"/e似和A^wnxv/oracra^a。本发明的4尤选的"f氐等真核生4勿包^^旦不卩艮于尸/c/n'ajP(2Wo〃、'、尸/c'/n.a力力/"m/z'ca、尸/c/z/"/ye/za/o//n7a、尸/c/h'(2^oc/amae、尸zc'/^a附em6rawae^2"'e/m、尸z.c/z/a、尸/.c/n.aW^7/7's、尸z'c/n'〃we/^cmo/z'ca、尸z'c/^asp.、Sacc/zaromycescerev/sz'ae、5"acc/^謂少cessp.、//a朋eww/a戶/，o/7/z"、AT/w"ero附;/c"sp.、/wc々wowe/7A、e、Fwsan'w附sp.Fwsan'w/rgrawiweww、Fwsar/w附vewe/7"fw附禾口A^wnxv/oracYxsvfa。特另ll优选的物种是尸/c/^a/"Wo〃's。产生具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白的一个实施方式在实施例2中示出。在实施例2中，编码嵌合免疫球蛋白的载体被导入重组酵母尸,c/,a/ostw^YSH37菌抹(Hamilton""/.,2003,Science,301:1244-1246),所述嵌合免疫球蛋白包含与人类IgGl的重链和轻链恒定区连接的、特异于CD20的小鼠IgGl的重链和轻链可变区。YSH37重组酵母菌林缺乏内源的a-l,6-甘露糖基转移酶活性(Ochlp)并且含有三个异源基因编码a-l,2-甘露糖苷酶(MnsIA)的基因，其定位到内质网，和编码UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)转运蛋白卩-l，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(GlcNAc转移酶1或GnTl),和甘露糖普酶II(MnsII)的基因，都定位到高尔基体。一般地，异源基因包含真菌II型膜蛋白和来自尸zc/n"/a^ora以外的有机体的催化结构域之间的合成融合物。由于在重组酵母菌林中产生的糖蛋白主要具有GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖结构，在重组酵母菌抹中产生的免疫球蛋白例如实施例2的免疫球蛋白将具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖。实施例3显示了在YSH37重组酵母菌抹中产生的抗CD20免疫球蛋白具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖。约20%的糖形式由GlcNAcMan3GlcNAc2组成，具有较小数量的多种其他糖形式。在进一步的实施方式中，上述重组酵母菌抹包括PNOl和MNN4b基因的删除或破坏，其引起甘露糖基磷酸化的消除(参见，例如，美国公开的专利申请No.20060160179)。甘露糖基磷酸化引起带电的N-聚糖的产生。这种进一步的遗传修饰提供了能够产生GlcNAcMan3GlcNAc2是主要N-聚糖的免疫球蛋白组合物的重组酵母菌林，并且其中所述免疫球蛋白没有甘露糖基磷酸(并因而净负电荷)，这可能在人类中产生异常的免疫原性活性。在其他实施方式中，上述重组酵母菌林包括涉及卩-甘露糖基化的一种或多种基因的删除或破坏(参见WO2005106010和相关的美国专利申请No.11/118,008)。这些进一步的遗传修饰提供了能够产生GlcNAcMari3GlcNAc2是主要N-聚糖的免疫球蛋白组合物的重组酵母菌抹，并且其中所述免疫球蛋白没有p-甘露糖基化，这可能在人类中产生异常的免疫原性活性。在再进一步的实施方式中，上述重组酵母菌林包括PNO1和MNN4b基因以及涉及p-甘露糖基化的一种或多种基因的删除和破坏。这些进一步的遗传学修饰提供了能够产生GlcNAcMan3GlcNAc2是主要N-聚糖的免疫球蛋白组合物，并且其中所述免疫球蛋白没有甘露糖基磷酸化和卩-甘露糖基化。虽然已经描述了重组酵母细胞用于产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白，其他蛋白表达宿主系统包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等等可以用于产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白。这些蛋白表达宿主系统可以被遗传工程化或修饰或选择来表达具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白，或可以天然地产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖结构的糖蛋白。产生具有主要糖形式的糖蛋白的工程化蛋白表达宿主系统的实例包括基因敲除体/突变体(ShieldsW2002,JBC,277:26733-26740);中国仓鼠卵巢细胞中的遗传工程化(Umafiae"/.,1999,NatureBiotech.,17:176-180)，或两者的结合。做为选择,某些细胞天然地表达主要糖形式，例如鸡、人类和牛(Rajue,a/.,2000,Glycobiology,10:477-486)。这些细胞可以被修饰以产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白。因而，具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为选择多种表达宿主系统的至少一种来获得。进一步的表达宿主系统包括CHO细胞W09922764A1和WO03035835A1;杂交瘤细胞TrebakWa/.,1999,J.Immunol.Methods,230:59-70;昆虫细月包HsuWa/.，1997,JBC,272:9062-970和植物细胞WO04074499A2。免疫球蛋白的纯化纯化和分离免疫球蛋白的方法是已知的(参见，例如，Kohler&Milstein,(1975)Nature256:495;Brodeur"a/.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,(1987);.Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-04(AcademicPress,1986);andJakobovits,1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯:2551-255,andJakobovits"a/.,1993,Nature362:255-258)。在进一步的实施方式中，使用McCafferty"a/.(1990)Nature,348:552-554(1990)中描述的技术、使用感兴趣的抗原来选择适合的抗体或抗体片段，可以从抗体噬菌体库分离抗体或抗体片段。实施例3提供了分离在遗传修饰的酵母细胞中产生的、具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白分子的方法，所述酵母细胞被遗传地修饰来产生具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白。对分离的免疫球蛋白分子的聚糖分析和分布可以通过本领域技术人员已知的几种质谱方法来测定，包括但不限于，HPLC、NMR、LCMS和MALDI-TOFMS。在优选的实施方式中，如实施例5中公开的，聚糖分布通过MALDI-TOFMS分析来测定。药物组合物具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白可以掺入到其中免疫球蛋白是活性治疗试剂的药物组合物中(参见Remington'sPharmaceuticalScience(15thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania,1980)。优选的组合物取决于施用和治疗应用的预期方式。取决于期望的制剂，组合物也可以包括药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂从而不影响组合的生物学活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理学磷酸盐緩冲盐水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其他载体、佐剂，或无毒的、非治疗性、非免疫原性的稳定剂，等等。用于肠胃外施用的药物组合物是无菌的、基本上等渗的、无热原的、无菌的，并根据美国食品和药品管理局或类似机构的的GMP来制备。所述组合物可以作为在生理学地可接受的稀释剂中物质的溶液或悬浮液的可注射剂量来施用，具有可以是无菌液体例如水、油、盐水、甘油或乙醇的药物载体。另外，辅助剂物质，例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH值緩沖剂等等可以存在于组合物中。药物组合物的其他部分是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如，花生油、豆油和矿物油。一般地，乙二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于26可注射溶液。组合物可以以储库注射或植入物制品的形式施用，其可以以允许活性成分的持续释放的方式来配制。一般地，这种组合物被制备为可注射的，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备为在注射之前适合于溶解于或悬浮于液体媒介物的固体形式。制品还可以乳化或密封在脂质体或微粒中，例如聚交酯、聚乙交酯或共聚物，用于增强的佐剂效果，如以上讨论的(参见Langer,Science249，1527(1990)和Hanes,AdvancedDrugDeliveryReviews28,97-119(1997)。诊断产品具有GlcNAcMansGlcNAc2作为主要N-聚糖的免疫球蛋白分子也可以掺入到各种诊断试剂盒和其他诊断产品如阵列中。通常预先结合到固相来提供免疫球蛋白，例如结合到微滴度平皿的孔。试剂盒还常常含有用于检测免疫球蛋白结合的试剂，和提供试剂盒的使用说明的标签。免疫计或夹心分析是诊断试剂盒的优选的形式(参见美国专利Nos.4,376，110、4,486,530、5,914,241和5,965,375)。例如在美国专利NO.5,922,615、5,458,852、6,019,944和6,143,576中描述了抗体阵列。具有GlcNAcMari3GlcNAc2作为主要N-聚糖的本发明的免疫球蛋白分子对于适应症有许多治疗应用，例如癌症、炎症性疾病、感染、免疫疾病、自体免疫疾病，包括特发性血小板减少性紫癜、关节炎、全身性红斑狼疮和自身免疫性溶血性贫血。感兴趣的耙点包括生长因子受体(例如，FGFR、PDGFR、EGFR、NGFR和VEGF)和它们的配体。其他靶点有G蛋白受体，包括物质K受体、血管紧张素受体、a-和P-肾上腺素能受体、血清紧张素受体和PAF受体。(参见，例如Gilman,Ann.Rev.Biochem.56:625-649(1987)。其他耙点包括离子通道(例如，4丐、钠、钾通道)、毒蕈碱受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸受体和多巴胺受体(参见Harpold,U.S.5,401,629和U.S.5,436,128)。其他靶点有粘附蛋白，例如整联蛋白、选择素和免疫球蛋白超家族成员(参见Springer,Nature346:425-433(1990).Osborn,Cell62:3(1990);Hynes,Cell69:11(1992))。其他耙点有细胞因子，例如白细胞介素IL-1到IL-13、肿瘤坏死因子a和p、干扰素a、卩和y、肿瘤生长因子卩(TGF-卩)集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GMCSF)。参见HumanCytokines:HandbookforBasic&ClinicalResearch(Aggmwale/1a/.eds.,BlackwellScientific,Boston,MA1991)。其他把点有激素、酶以及细胞内和细胞间信使，例如腺苷酸环化酶、脒基环化酶和磷脂酶C。感兴趣的其他靶点有白细胞抗原，例如CD20和CD33。药物也可能是感兴趣的靶点。靶点分子可以是人类、哺乳动物或细菌的。其他靶点是抗原，例如来自微生物病原体包括病毒和细菌以及胂瘤的蛋白、糖蛋白、碳水化合物。在U.S.4,366,241中描述了再其他的靶点。根据本领域公知的常规方法以及如各种一般的和更具体的参考文献的描述一般地进行本发明的方法和技术，除非另有陈述这些参考文献在本说明书中被引证和讨论。参见，例如SambrookWa/.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);Ausubel"a/.,CurrentProtocolsinMolecuLrBiology,GreenePublishingAssociates(1992,andSupplementsto2002);HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990);TaylorandDrickamer,IntroductiontoGlycobiology,OxfordUniv.Press(2003);WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJ;HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolI，CRCPress(1976);HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolII,CRCPress(1976);EssentialsofGlycobiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999);Immunobiology,Janeway"a/,6thEdition,2004,GarlandPublishing,NewYork)。在此提及的所有公开物、专利和其他参考文献通过引用将它们完整地合并。以下实施例意图促进本发明的进一步理解。实施例1构建编码嵌合抗CD20单克隆抗体的载体用于在重组尸;c/z;apaworw中产生具有GlcNAcMansGlcNAc2作为主要N-聚糖的人源化抗CD20单克隆抗体，所述嵌合抗CD20单克隆抗体由具有融合到人类轻链恒定区的小鼠轻链可变区的轻链(L)融合蛋白以及由融合到人类重链恒定区的小鼠可变重链区域组成的重链(H)融合蛋白组成，所述重组尸,'c'/napaWons被遗传地修饰来产生具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白。用于在尸,c/zz'a/as勿ra、中表达的、编码嵌合抗CD20单克隆抗体DX-IgGl的核酸的克隆基本上如下。DX-IgGl嵌合抗体的轻链和重链由小鼠可变区和人类恒定区组成。编码小鼠/人类嵌合轻链的核苷酸序列在SEQIDNO:1中示出，编码小鼠/人类嵌合重链的核苷酸序列在SEQIDNO:2中示出。使用购自IntegratedDNATechnologies(IDT)的重叠寡核苷酸来合成重链和轻链编码核酸。为了合成编码轻链可变区的核酸，购买15个重叠寡核苷酸(SEQID位点的编码轻链可变区的核酸。这种轻链可变区:码核酸然后通过重叠PCR使用5，Mlyl引物CD20L/up(SEQIDNO:20)、3'可变区/5'恒定区引物LfusionRTVAAPS/up(SEQIDNO:21)、3'恒定区引物LfusionRTVAAPS/lp(SEQIDNO:22)和3，CD20L/lp(SEQIDNO:23)按读码框接入编码轻链恒定区的核酸(SEQIDNO:3)(GeneArt,Toronto,Canada)。编码嵌合的小鼠-人类轻链片段的最后的Mlyl核酸(其包括5,AG碱基对)然后插入pCR2.1TOPO载体(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)产生pDX343(附图2A)。对于重链，相应于编码小鼠重链可变区的核酸序列的17个重叠寡核苷酸(SEQIDNO:24-40)购自IDT，并使用EXTAQ退火。这个编码小鼠重链可变区片段的核酸然后通过重叠PCR使用5'Mlyl引物CD20H/up(SEQIDNO:41)、5，可变区/恒定区引物HchainASTKGPS/up(SEQIDNO:42)、3'可变区/恒定区引物HchainASTKGPS/lp(SEQIDNO:43)和3，恒定区引物HFckpnl/lp(SEQIDNO:44)按读码框接入编码人类重链恒定区的核酸(SEQIDNO:4)(GeneArt)。编码嵌合的小鼠-人类重链片段的最后的Mlyl核酸(其包括5'AG碱基对)插入pCR2.1TOPO载体产生pDX360(附图2C)。编码全长嵌合轻链和全长嵌合重链的核酸从相应的TOPO载体中作为Mlyl-Notl核酸片段分离。这些轻链和重链编码核酸片段然后各自连接到Kar2(Bip)信号序列(SEQIDNO:45),使用4个重叠寡核苦酸一P.BiPss/UPl-EcoRI、P.BiPss/LPl、P.BiPss/UP2和P.BiP/LP2(分别为SEQIDNO:46-49),然后连接到pPICZA的EcoRI-Notl位点，产生携带Kar2-轻链和AOX1转录终止序列(AOX1终止子或TT)的pDX344(附图2B)以及携带kar2-重链的pDX468(附图2E)。来自pDX344的BglII-BamHI片段然后亚克隆到含有AOX2启动子基因的pBK85中用于染色体整合，产生pDX458(附图2D)。来自携带重链的pDX468的BglII-BamHI片段然后亚克隆到pDX458中，产生pDX478(附图2F),其编码处在A0X1启动子控制下的抗CD20单克隆抗体的全长的嵌合重链和嵌合轻链。pDX478编码的嵌合抗体被称为DX-IgGl。然后在转化之前用Spel将质粒pDX478线性化，用于利用Zeocin抗性选择的转化体的AOX2基因座中(参见实施例2)。RITUXIMAB/RITUXAN是购自Biogen-IDEC/Genentech,SanFrancisco,CA的抗CD20小鼠/人类嵌合IgGl。PCR扩增。EppendorfMastercycler(Westbury,NY)被用于所有PCR反应。PCR反应含有模板DNA、125dNTPs、0.2laM每种正向和反向引物、EXTAQ聚合酶緩沖液(TakaraBioInc.,Shiga,Japan)和EXTAQ聚合酶或pFUTurbo聚合酶緩沖液(Stratagene)和pFUTurbo聚合酶。使用97°C15秒、55°C15秒、72°C卯秒的30个循环，在97。C两分钟的起始变性步骤以及在72。C七分钟的最终延伸步骤，扩增DNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR样品，使用来自Qiagen的凝胶提取试剂盒提取并纯化DNA条带。所有的DNA纯化在10mMTris、pH8.0中洗脱，处理最后的PCR(重叠所有三个片段)之外，其在去离子H20中洗脱。实施例2这个实施例显示了在重组酵母细胞中生产由pDX478或pJC140编码的具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的嵌合人源化抗CD20单克隆抗体的方法。IgG载体向尸zc/napaWorw菌林YSH37(Hamilton"a/.,2003)的转化基本上如下。通过添加醋酸钠到0.3M的终浓度来制备pDX478的载体DNA。百分之百的冰冷乙醇然后添加DNA样品中到70%的终浓度。通过离心将DNA团化(12000gxl0分钟)，用70%水冷乙醇洗涤两次。干燥DNA,重悬浮在50|Lil的10mMTris、pH8.0中。要转化的酵母细胞通过在BMGY(緩沖的最小甘油100mM磷酸钾、pH6.0;1.34%酵母氮基；4x105%生物素；1%甘油)中扩展较小的培养物到约2到6的O.D.来制备。酵母细胞然后通过在1M山梨醇中洗涤3次重悬浮在约1到2mL1M山梨醇中来变得导电。载体DNA(1到2pg)与100的感受态的酵母混合，并在冰上孵育IO分钟。然后使用BTXElectrocellManipulator600使用以下参数将酵母细胞电穿孔1.5kV、129ohms和25iuF。一毫升的YPDS(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1M山梨醇)添加到电穿孔的细胞。转化的酵母随后平铺在含有zeocin的选择性琼脂平板上。在尸/c/na/^Wons中IgGl生产的培养条件基本上如下。如上所述用pDX478转化的YSH37菌抹的单个集落接种到50mlFalcon离心管的10mLBMGY培养基中(由1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸钾緩沖液(pH6.0)、1.34%酵母氮碱基、4xl05。/。生物素和1%甘油组成)。孵育培养物在24°C/170-190rpm摇动48小时直到培养物饱和。然后将100mL的BMGY添加到500ml挡板烧瓶中。种子培养物然后转移到含有100mLBMGY培养基的挡板烧瓶中。孵育这种培养物，在24。C以170到190rmp摇动24小时。烧瓶的内含物倾倒入两个50mLFalcon离心管中，在3000rpm离心10分钟。用没有甘油的20mLBMGY洗涤细胞团粒一次，随后用20mlBMMY柔和地重悬浮(BMGY具有1。/。MeOH代替1%甘油)。悬浮的细胞转移到250mL挡板烧瓶中。孵育这个培养物，在24。C以170到190rpm摇动24小时。然后，烧瓶的内含物倾倒入两个50mLFalcon离心管中，在3000卬m离心10分钟。在如实施例6描述的蛋白质分离之前，通过ELISA分析培养物上清液来测定近似的抗体滴度。培养物上清液中抗体的定量通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来进行。高结合微量滴定板(Costar)用10mLPBS、pH7.4中的24pg山羊抗人Fab(Biocarta，Inc，SanDiego,CA)包被，在4。C孵育过夜。除去緩沖液，添加封闭緩沖液(PBS中的3%BSA)，然后在室温下孵育一小时。除去封闭緩沖液，用PBS洗涤平板3次。在最后一次洗涤之后，添加抗体培养物上清液的递增体积数量(0.4、0.8、1.5、3.2、6.25、12.5、25和50pL)，在室温下孵育平板一'J、时。然后用含有0.05%Tween20的PBS洗涤平板。在最后一次洗涤之后，添加抗人类Fc-HRP到1:2000PBS溶液中，然后在室温下孵育1小时。然后用PBS-Tween20洗涤平板4次。根据厂家的说明书使用TMB底物试剂盒(PierceBiotechnology)分析平板。根据以上显示的方法产生酵母菌林DX554，用于将pDX478转化入重组酵母菌林YSH37中。实施例3实施例2中产生的嵌合抗CD20单克隆抗体的纯化基本上如下。用pDX478转化的酵母细胞产生的抗体被称为DX-IgGl。4吏用STREAMLINE蛋白A4主(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)从培养物上清液捕获抗体。在Tris-GlycinepH3.5中洗脱抗体，使用1MTrispH8.0中和。使用疏水性相互作用层析(HIC)进行进一步纯化。HIC柱的特定类型取决于抗体。对于DX-IgG1，与20mMTris(7.0)、1M(NH4)2S04緩冲液一同使用苯基SEPHAROSE柱(也可以使用辛基SEPHAROSE)，用1M(NH4)2804开始并降低到0M(NH4)2S04的线性梯度緩沖液洗脱。来自苯基SEPHAROSE柱的抗体级分被集中并且交换到50mMNaOAc/TrispH5.2緩冲液中用于最后通过阳离子交换(SPSEPHAROSEFastFlow)(GEHealthcare)柱纯化。使用50mMTris、1MNaCl(pH7.0)用线性梯度洗脱抗体。DX-IgGl抗体从根据实施例2生长的DX554的培养物的培养基中分离。层析级分中的蛋白浓度使用白蛋白作为标准(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)、使用Bradford分析(Bradford,M.1976,Anal.Biochem.(1976)72,248-254)来测定。实施例4通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯化抗体的检测如下。根据厂家的说明书(NuPAGEbis-TrisElectrophoresisSystem;InvitrogenCorporation)使用预制的凝胶剂将纯化的DX-IgGl抗体与合适体积的样品加载緩沖液混合并经历十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。用考马斯亮蓝染料(BIO-RAD,Hercules,CA)来染色凝胶蛋白。实施例5飞行质谱法的基质辅助的激光脱附电离时间(MALDI-TOFMS)被用于分析实施例2中产生的具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要中性N-聚糖的DX-IgGl抗体上的Asn连接的低聚糖。使用来自Papac等(Glycobiology8,445-454(1998)的修改的步骤来从抗体释放N-连接的聚糖。简要地，使抗体样品变性并施加到96孔PVDF膜平板上。然后用二硫苏糖醇还原样品并用碘乙酸来羧曱基化。然后用聚乙烯基吡啶封闭反应孔。抗体样品然后通过在3010mMNH4HC03(pH8.3)中与1mU的N-聚糖酶(EMDBiosciences,LaJolla，CA)在37。C孵育16小时来脱糖基化。含有释放的聚糖的溶液然后通过离心穿过PVDF膜来除去并蒸干。从每个反应孔干燥的聚糖溶于15)nL水中，将0.5|uL点样到不锈钢MALDI样品平板上，与0.5|tiL的S-DHB底物(1:1水/乙腈/0.1%三氟乙酸中的9mg/mL二羟基苯甲酸/lmg/mL的5-甲氧基-水杨酸)混合并容许干燥。通过4-ns脉冲时间的脉沖氮激光器(337nm)的照射产生离子。以125ns延迟和20kV的加速电压以延迟提取方式允许仪器。栅极电压是93.00%,导波线电压是0.1%,内压力是低于5xl(f托(1托=133Pa),低分子量门限是850Da。从总共100-200个激光脉冲产生光谱，用500-MHz数字转换器获得。Man5GlcNAc2(Mr1257[M+Na]+)低聚糖被用作外部分子量标准。使用仪器以阳离子模式产生全部光谱。附图3显示了来自包含DX-IgGl抗体的发酵物No.F060708的组合物的MALDI-TOFMS光语，所述发酵物根据实施例2中的方案通过YDX554细胞产生。附图3显示了组合物中的主要N-聚糖结构是GlcNAcMan3GlcNAc2。然而，如在附图3中显示的，该组合物也包括其他N-聚糖结构。这些N-聚糖包括GlcNAcMan4GlcNAc2、Man6GlcNAc2;GlcNAcMan5GlcNAc2、Man7GlcNAc2、GlcNAcMan6GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2和ManlOGlcNAc2。为了测定各种中性N-聚糖结构的相对数量，进行HPLC,根据相对与保留时间的HPLC扫描测量强度测定与每种上述N-聚糖结构相应的峰下的面积。HPLC是使用PREVAILCarbohydrateES5|im250mmx4.6mm(Cat#—35101;AlltechAssociates,Avondale,PA)的快速氨基-硅聚糖分离。样品体积是45pL,溶剂是乙腈和LSS(50mMNH4FormatepH4.4)。流速是1.0mL/分钟，柱温度是3(TC。梯度如下时间0,80%乙腈20%LSS;时间50,40%乙腈，60%LSS,时间55,30%乙腈，70%LSS;时间60,80%乙腈，20%LSS;以及时间70,80%乙腈，20%LSS。HPLC的结果在表1中示出。HPLC分析显示，发现主要N-聚糖结构GlcNAcMan3GlcNAc2包含总的中性N-聚糖结构的约20%。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实施例6根据如Shields2001,J.Biol.Chem,276:6591-6604中描述的方案进行对FcyRIIb、FcyRIIIa和FcyRIllb的Fc受体结合分析。对于FqRIIb结合分析，在PBS、pH7.4中1吗/mL的FcryRIIb融合蛋白包被在ELISA平板(Nalge-Nunc,Naperville,IL)上在4°C48小时。在25。C用PBS中的3%牛血清白蛋白(BSA)封闭平板一小时。通过在25。C混合2:l摩尔数量的DX-IgGl或RITUXIMAB和HRP结合的F(Ab')2抗F(Ab，)2—小时在PBS中在1%BSA中制备DX-IgGl或RITUXIMAB二聚体复合物。二聚复合物然后在1%BSA/PBS中以1:2连续稀释，并在25。C包被在平板上一小时。使用的底物是3,3，,5,5，-四曱基联笨胺(TMB)(VectorLaboratories,Inc.,Burlingame,CA)。根据厂家的说明(VectorLaboratories,Inc.)在450nm读取吸光度。对于FcyRIIIa-LF和FcyRIIIa-LV结合分析，在PBS、pH7.4中分别0.8昭/mL和0.4pg/mL的FcyRIIIa陽LF或FcyRIIIa-LV融合蛋白在4°C包被在ELISA平板(Nalge-Nunc,Naperville,IL)上48小时。在25。C用PBS中的3%BSA封闭平板一小时。通过在25。C混合2:1摩尔数量的DX-IgGl或RITUXIMAB和HRP结合的F(Ab，)2抗F(Ab，)2—小时在PBS中在1%BSA中制备DX-IgGl或RITUXIMAB二聚体复合物。二聚复合物然后在1%BSA/PBS中以1:2连续稀释，并在25。C包被在平板上一小时。使用的底物是3，3，,5,5，-四甲基联苯胺(TMB)(VectorLaboratories,Inc.)。才艮才居厂家的i兌明(VectorLaboratories,Inc.)在450nm读取吸光度.使用产自YDX554(表达DX-IgGl的菌林YSH37)的糖蛋白，根据上述方法对于FqRIIb和FcYRIIIa-LF和FcyRIIIa-LV获得的结合结果分别在附图5、6A和6B中示出。附图4显示了包含具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的抗的结合。、；一？、、、'附图5A显示了包含具有GlcNAcMan;GlcNAc2作为主要N-聚糖的、如实施例3中描述的在重组尸/c/zw/mWo,'"中表达的抗CD20抗体的组合物与RITUXIMAB相比在结合FcyRIIIa-LF受体方面具有约304倍提高，所述RITUXIMAB不具有具有GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖。附图5B显示了所述组合物与RITUXIMAB相比在结合FcyRIIIa-LV受体方面具有约10倍的提高。因此，从细胞系产生的抗体组合物具有对FcyRIIb降低的结合和对FcyRIIIa提高的结合，所述细胞系被遗传地工程化以产生包含GlcNAcMan3GlcNAc2作为主要N-聚糖的糖蛋白。序列的说明SEQIDNOSEGIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO:1编码DX-IgGl轻链的核苦酸序列。2编码DX-IgGl重链的核苦酸序列。3编码IgGl轻链的人类恒定区的核苷酸序列。4编码IgGl重链的人类恒定区的核苷酸序列。5到19编码用于通过聚合酶链式反应(PCR)合成DX-IgGl的鼠轻链可变区的15个重叠寡核苷酸。SEQIDNO:20到23编码用于连接DX-IgGl鼠轻链可变区到人类轻链恒定区的四个寡核香酸引物。SEQIDNO:24到40编码用于通过聚合酶链式反应(PCR)合成DX-IgGl的鼠重链可变区的17个重叠寡核香酸。36SEQIDNO:41到44编码用于连接DX-IgGl鼠重链可变区到人类重链恒定区的四个寡核苷酸引物。SEQIDNO:45编码具有N-末端EcoRI位点的核苦酸序列，所述核苷酸序列编码Kar2(Bip)信号序列。SEQIDNO:46-49编码用于连接Kar2信号序列到DX-IgGl的轻链和重链的四个寡核苷酸引物。虽然在此参考说明性实施方式描述了本发明，要理解的是本发明不限于此。具有本领域的普通技术并且接受此处的教导的人员将认识到其他修改和实施方式处于其范围内。因而，本发明仅由此处附随的权利要求限制。权利要求1.包含多种免疫球蛋白或片段的组合物，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。2.权利要求1的组合物，其中所述多种N-聚糖的大于50摩尔百分比基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。3.权利要求1的组合物，其中所述多种N-聚糖的大于75摩尔百分比基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成。4.权利要求1的组合物，其中所述多种N-聚糖的大于90摩尔百分比基本上由GlcNAcMari3GlcNAc2组成。5.权利要求1的组合物，其中所述GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖以一定水平存在，所述水平超过所述多种N-聚糖的第二主要N-聚糖结构约5摩尔百分比到约50摩尔百分比。6.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段展现对FcyRII受体的降低的结合亲和性。7.权利要求6的组合物，其中所述FcyRII受体是FcYRIIa受体。8.权利要求7的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段展现降低的吞噬作用(巨噬细胞的免疫复合物清除)。9.权利要求6的组合物，其中所述FcyRII受体是FcYRIIb受体。10.权利要求9的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段活化B细胞。11.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段展现对FqRIII受体的提高的结合亲和性。12.权利要求11的组合物，其中所述FcyRIII受体是FcyRIIIa受体。13.权利要求11的组合物，其中所述FcyRIII受体是F(ryRIIIb受体。14.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段展现提高的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)活性。15.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段基本上没有海藻糖。16.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段缺少海藻糖。17.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段结合选自由生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-a和TNF-卩构成的组的抗原。18.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白或片段包含选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4Fc区域构成的组的Fc区域。19.包含权利要求1的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。20.权利要求19的药物组合物，其中所述免疫球蛋白或片段基本上没有海藻糖。21.权利要求19的药物组合物，其中所述免疫球蛋白或片段缺少海藻糖。22.权利要求19的药物组合物，其中所述免疫球蛋白或片段包含结合选自由生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-a和TNF-|3构成的组的抗原的抗体。23.权利要求19的药物组合物，其中所述免疫球蛋白或片段包含选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4Fc区域构成的组的Fc区域。24.包含权利要求1的组合物的试剂盒。25.包含编码免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主细胞，其中所述真核宿主细胞被遗传地修饰或选择来表达权利要求1的免疫球蛋白组合物。26.权利要求25的宿主细胞，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。27.生产包含多种免疫球蛋白或片段的组合物的方法，每种免疫球蛋白或片段包含与之连接的至少一种N-聚糖，从而其中所述组合物包含多种N-聚糖，其中主要N-聚糖基本上由GlcNAcMan3GlcNAc2组成，包括(a)提供权利要求25的真核生物宿主细胞；(b)在培养基中生长所述真核生物宿主细胞一定时间，足以使所述真核生物宿主细胞产生所述免疫球蛋白或片段；以及，(c)分离所述免疫球蛋白或片段来产生所述组合物。28.权利要求27的方法，其中所述宿主细胞是低等真核宿主细胞。全文摘要公开了组合物和生产组合物的方法，所述组合物包含具有N-连接的糖基化模式的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，所述N-连接的糖基化模式主要由GlcNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖结构组成。GlCNAcMan₃GlcNAc₂N-聚糖结构引起结合FcγRIII受体方面的提高和结合FcγRII受体方面的降低。文档编号C12N5/10GK101252950SQ200680031862公开日2008年8月27日申请日期2006年9月1日优先权日2005年9月2日发明者H·李,S·威尔德特,T·U·格恩格罗斯申请人:格利科菲公司