专利名称：：分析靶核酸序列的方法与试剂盒的制作方法分析靶核酸序列的方法与试剂盒发明领域本发明总体上涉及分析靶核酸序列的方法。更具体地说，本发明涉及用寡核苷酸测定是否存在靶核酸序列的分析方法，所述寡核苷酸与核酸处理反应配合从而产生可检测信号。在一些实施方式中，这些方法有助于定量测定靶核酸序列。本发明还涉及可用于实施本发明方法的试剂盒。发明背景可用能检测与其它短核酸分子杂交的系统分析核酸分子，所述短核酸分子通常是指探针、引物或寡核苷酸。因为可通过核酸分子的序列和一些子序列来区分核酸分子，也因为核酸分子能与诸如寡核苷酸等互补的序列特异性结合，这是可能的。聚合酶链式反应(PCR)是最灵敏的核酸分析系统之一。寡核苷酸与互补靶核酸序列之间的杂交形成了DNA聚合酶启动聚合的位点，然后DNA聚合酶从该位点拷贝靶核酸序列模板进而产生与该靶核酸互补的新DNA链。通过连续拷贝新链以及原始链来扩增DNA。将PCR引物寡核苷酸掺入扩增的产物DNA中，然后鉴定扩增的产物DNA。通过凝胶电泳分离并用化学物质染色PCR产物后，通常能对其进行目测观察。或者，不用凝胶电泳时，可通过染料与双链PCR产物的优先结合来定量或半定量检测PCR产物。还存在其它几种核酸分析方法，包括连接酶链式反应、寡核苷酸连接试验、连接依赖性PCR(UgationdependentPCR)、链置换扩增、分支DNA扩增、滚环扩增、转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增和杂交信号扩增。尽管有许多核酸分析方法，然而已开发的方法很少能同时区分两种或多种核酸耙标或定量测定两种或多种核酸靶标。设计用于同时分析许多不同核酸靶标的方法通常不可靠且不灵敏。因此，能同时分析多种核酸靶标(即多重)的核酸分析方法极少常规用于当前的医学、兽医学或农业诊断中(Yang等，2004，Lancet.InfectiousDiseases4:337-48;Broude等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98:206-2U;Chamberlain等，1988，NucleicAcidsRes.16:11141-11156;Edwards等，1994，PCRMethodsAppl.3:S65-S75;Hacia等，1998，GenomeRes.8:1245-1258;Li等，1996，NucleicAddsRes.24:538-539;Stuven等，996，Pharmacogenetics6:417-421;雨Orsouw等，1998，Genomics52:27-36)。因此，极其需要开发不仅能分析一种靶核酸序列，还能同时分析多种靶核酸序列(即多重分析)的灵敏方法。发明概述因此，一方面，本发明提供分析试样中靶核酸的序列方法。这些方法通常包括-在一反应容器中合并(1)不与靶核酸序列杂交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游离于溶液中)；(2)提供可检测信号并与捕捉寡核苷酸杂交的信号寡核苷酸(signalingoligonucleotide);(3)至少一种嵌合型寡核苷酸，其包含(a)与靶核酸序列的子序列杂交的第一靶向序列；和(b)与选自以下的序列杂交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信号寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一种协作性寡核苷酸，所述第二靶向序列与选自以下的序列杂交(a)靶核酸序列中与所述第一靶向序列杂交的子序列不同的子序列；或(b)靶核酸序列的互补链的子序列，或(C)至少一种嵌合型寡核苷酸；和(5)包含核酸的试样；-使该反应容器中的内含物进行核酸处理反应以形成反应产物(如果试样中存在靶核酸序列的话)，其中如此形成的反应产物包含第一链以及第二链，第一链包含至少一种嵌合型寡核苷酸或其延伸产物，第二链包含至少一种协作性寡核苷酸或其延伸产物，从而阻断了嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，进而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交；和-检测信号寡核苷酸的可检测信号，该信号表明试样中靶核酸的存在或含量。在一些实施方式中，核酸处理反应是聚合依赖性核酸处理反应，其说明性例子包括a)使嵌合型寡核苷酸的靶向序列与耙核酸序列杂交形成第一杂交体，其中该靶核酸序列以3'-5'方向延伸到该嵌合型寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，从而确定该靶核酸序列的非杂交部分；b)在聚合试剂和核苷酸前体存在下，使用该靶核酸序列的非杂交部分作为模板来延伸该第一杂交体的嵌合型寡核苷酸，从而形成了包含第一延伸产物和耙核酸序列的第一双链体(d叩lex);C)使该第一双链体变性以从第一延伸产物上释放靶核酸序列；d)使协作性寡核苷酸与第一延伸产物杂交，从而形成第二杂交体，其中该第一延伸产物以3'-5'方向延伸到该协作性寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，从而确定了该第一延伸产物的非杂交部分；和e)在聚合试剂和核苷酸前体存在下，使用该第一延伸产物作为模板来延伸该第二杂交体的协作性寡核苷酸，从而形成了包含该第一延伸产物和与该第一延伸产物互补的第二延伸产物的反应产物。步骤a)-e)宜重复一次或多次，通常在约1-约100次之间，一般在约10-约50次之间，更常见在约20-约40次之间。在一些实施方式中，聚合试剂是引物依赖性DNA聚合酶(任选热稳定的)，其说明性例子包括激烈火球菌(尸;;rococa^y^/w的(/yi,)DNA聚合酶、火球菌种(尸jracoc'cws平)GB-D(尸印)DNA聚合酶、沃氏火球菌(/yYcocc"siwew/)(尸wo)DNA聚合酶、水生栖热菌(772emz附a，a"c^)(7bg)DNA聚合酶、布氏栖热菌(77^mw6raC朋^)(rar)DNA聚合酶、黄栖热菌(TTzermz^//ams')(77/)DNA聚合酶、排气孔嗜高温菌(77ze，ococc^//tora/的(77/或J^W)DNA聚合酶、海栖热袍菌(77zermotogamaW"ma)(7)wfl)DNA聚合酶和嗜热栖热菌(:77^，M^^wop/z/Z^Xn/ODNA聚合酶和它们的衍生物。在一些实施方式中，步骤b)中的聚合试剂是引物依赖性逆转录酶，例如但不限于鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和嗜热栖热菌(77zermz^Aerwo;^//^)(7^)DNA聚合酶和它们的衍生物。在一些实施方式中，步骤e)中的聚合试剂是DNA聚合酶，其宜是热稳定的。在其它实施方式中，聚合依赖性核酸处理反应包括i)使可环化的第一协作性寡核苷酸的第一靶向序列与耙核酸序列的第一子序列杂交形成第一杂交体，其中该第一协作性寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补；ii)使该第一协作性寡核苷酸的第二靶向序列与该靶核酸序列的第二子序列杂交形成第二杂交体，其中该第二子序列毗连(adjacentto)该第一子序列；iii)在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该第一协作性寡核苷酸的第一和第二靶向序列，形成的第一双链体，该第一双链体包含该耙核酸序列的第一和第二子序列及环化形式的包含该第一协作性寡核苷酸的第一和第二靶向序列的连接产物；iv)使该第一双链体变性以从靶核酸上释放连接产物；V)使嵌合型寡核苷酸与连接产物杂交以形成第三杂交体；vi)在聚合试剂与核苷酸前体存在下，使用连接产物作为模板来延伸该第三杂交体的嵌合型寡核苷酸，从而形成第一延伸产物；Vii)使第二协作性寡核苷酸与该第一延伸产物杂交以形成第四杂交体，和viii)在聚合试剂(例如，引物依赖性DNA聚合酶，例如但不限于4)29DNA聚合酶)与核苷酸前体存在下，使用该第一延伸产物作为模板来延伸该第四杂交体的第二协作性寡核苷酸，从而形成包含第一延伸产物和与该第一延伸产物互补的第二延伸产物的反应产物。在其它实施方式中，核酸处理反应是连接酶依赖性核酸处理反应，其说明性例子包括1.使嵌合型寡核苷酸的第一耙向序列与耙核酸序列的第一子序列杂交以形成第一杂交体，其中该嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补；2.使第一协作性寡核苷酸的第二靶向序列与该靶核酸序列的第二子序列杂交形成第二杂交体，其中该第二子序列毗连该第一子序列；3.在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该嵌合型寡核苷酸与该第一协作性寡核苷酸，形成的第一双链体，其包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及同时包含该嵌合型寡核苷酸和该第一协作性寡核苷酸的连接产物；4.使该第一双链体变性以从靶核酸上释放连接产物；和5.使第二协作性寡核苷酸与该连接产物的嵌合型寡核苷酸和第一协作性序列部分杂交以形成反应产物。在其它说明性例子中，连接酶依赖性核酸处理反应包括a.使第一嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列与靶核酸序列的第一子序列杂交以形成第一杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸的3'寡核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补，并且可捕捉序列的5'核苷酸不可连接；b.使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列与靶核酸序列中毗连该第一子序列的第二子序列杂交以形成第二杂交体，其中可捕捉序列的5'核苷酸不可连接；c.在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该第一嵌合型寡核苷酸与该第二嵌合型寡核苷酸以形成第一双链体，该第一双链体包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及同时包含该第一嵌合型寡核苷酸和该第二嵌合型寡核苷酸的连接产物；d.使该第一双链体变性以从靶核酸上释放连接产物；和e.使协作性寡核苷酸与该连接产物的第一和第二嵌合型寡核苷酸杂交以形成反应产物。在还有其它实施方式中，连接酶依赖性核酸处理反应包括i.使第一嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列与靶核酸序列的第一子序列杂交形成第一杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸包含的可捕捉序列能与捕捉寡核苷酸杂交，并且该第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补；ii.使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列与靶核酸序列中毗连该第一子序列的第二子序列杂交形成第二杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸包含的可捕捉序列能与信号寡核苷酸杂交；iii.在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该第一嵌合型寡核苷酸与该第二嵌合型寡核苷酸以形成第一双链体，该第一双链体包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及同时包含该第一嵌合型寡核苷酸和该第二嵌合型寡核苷酸的反应产物；和iv.使该第一双链体变性以释放反应产物与靶核酸。在一些实施方式中，步骤l-5或a-e或i-iv可重复一次或多次，通常在约l-约100次之间，一般在约10-约50次之间，更常见在约20-约40次之间。连接试剂宜选自T4DNA连接酶、大肠杆菌Cfoc/^Wc/w'aco//)DNA连接酶和丝状栖热菌(77^wM,/i/^附/s)(Tfi)DNA连接酶及它们的衍生物。在另一方面，本发明提供装有以下物质的试剂盒(1)不与耙核酸序列杂交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游离于溶液中)；P)提供可检测信号并与捕捉寡核苷酸杂交的信号寡核苷酸；(3)至少一种嵌合型寡核苷酸，其包含(a)与靶核酸序列的子序列杂交的第一靶向序列；和(b)与选自以下的序列杂交的可捕捉序列捕捉寡核苷酸；或(ii)信号寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一种协作性寡核苷酸，所述第二靶向序列与选自以下的序列杂交(a)靶核酸序列中与所述第一靶向序列杂交的子序列不同的子序列；或(b)靶核酸序列的互补链的子序列，或(c)至少一种嵌合型寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒还装有(5)—种或多种聚合和/或连接试剂。在一些实施方式中，(1)-(5)所示任一种或多种组分(例如，1、2、3、4或5)是冻干形式。(1)-(5)所示任两种或多种组分(例如，2、3、4或5)宜是混合物的形式。或者它们可处于独立的容器中。在一些实施方式中，捕捉寡核苷酸固定在固体表面上(例如，微粒或珠、纳米丝(nanowire)、诊断带(diagnosticstrip)或反应容器的表面)。在一些实施方式中，将两种或多种捕捉寡核苷酸固定成捕捉寡核苷酸阵列的形式。附图简述图1:显示通过RT-PCR从以下澳大利亚甲型流感(AustralianInfluenzaA)分离物PB2基因区段所生成的产物的琼脂糖凝胶照片H5N3(+)、H5N3、H11N6、H7N7、H12N9、H7N7、H4N4、H6N5和H9N2。图2:采用聚合酶链式反应(PCR)的本发明方法的一种实施方式的示意图。(图2A)固定的捕捉寡核苷酸(B);(图2B)包含信号试剂(C)的信号寡核苷酸(B");(图2C)包含可捕捉序列(B')和耙向序列(E')及协作性寡核苷酸(F')的嵌合型寡核苷酸;(图2D)靶核酸序列(E);(图2E)包含了第一延伸产物(F)的嵌合型寡核苷酸与靶核酸序列的杂交体；(图2F)嵌合型寡核苷酸与包含延伸产物的靶核酸序列和包含第二延伸产物(G)的协作性寡核苷酸的杂交体；(图2G)固定的捕捉寡核苷酸与包含信号试剂的信号寡核苷酸的杂交体(即，正信号)；(图211)固定的捕捉寡核苷酸与嵌合型寡核苷酸的杂交体(即，负信号)。图3:采用滚环扩增(RCA)的本发明方法的一种实施方式的示意图。图4:采用连接链式反应(LCR)的本发明方法的一种实施方式的示意图。图5:采用连接链式反应(LCR)的本发明方法的一种实施方式的示意图。图6:采用连接链式反应(LCR)的本发明方法的一种实施方式的示意图。图7:显示采用终点检测(endpointdetection)分析H7N7甲型流感cDNA的图示。利用50的0.5pmolPCR-标签引物(PCR-TAGprimer)进行35轮PCR后，检测450nm吸光度图8:显示滴定实验结果的图示，该实验采用终点检测步骤测定本发明方法的一个实施方式中PCR-标签引物的最佳用量。35轮PCR扩增后检测450nm的样品吸光度。较暗的点显示PCR靶标存在时的吸光度，较亮的点显示背景吸光度。图9:显示PCR产物的琼脂糖电泳和溴化乙锭染色的照片，所述PCR产物按照图8所示相同试验扩增来测定PCR-标签引物的最佳用量。在各种情况中，反向引物的用量是PCR-标签引物的4倍。阴性对照不含起始模板，PCR反应总体积是50(il。泳道号指定为M，HyperLadderII(超分子量梯度II);(1)使用1皮摩尔PCR-标签引物和H7N7模板的PCR产物；(2)使用0.5皮摩尔PCR-标签引物和H7N7模板的PCR产物；(3)使用0.25皮摩尔PCR-标签引物和H7N7模板的PCR产物；(4)使用1皮摩尔PCR-标签引物阴性对照的PCR产物；(5)使用0.5皮摩尔PCR-标签引物阴性对照的PCR产物；禾l::l(6)使用0.25皮摩尔PCR-标签引物阴性对照的PCR产物。序列简述<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>发明详述丄定乂除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所理解相同的含意。虽然可用与本文所述相似或等价的任何方法与材料实施或检验本发明，但优选本文所述的方法与材料。为本发明的目的，以下术语如下定义。本文中用冠词"一"和"一个"指一个或一个以上(即，至少一个)该冠词的语法宾语。例如，"一个元件"表示一个元件或一个以上的元件。"约"表示某数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、用量、重量或长度与参比数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、用量、重量或长度相比，最多有30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的不同。术语"扩增"或"核酸扩增"或"扩增反应"指能产生某具体靶核酸序列的许多个多核苷酸拷贝的生化反应。如果耙核酸序列是单链，则该反应可产生互补序列。在一些实施方式中，该反应是聚合酶链式反应(PCR)或使用聚合酶拷贝核酸序列的相似反应，例如解旋酶依赖性扩增(HAD)、转录介导的扩增(TM.A)、链说换扩增技术(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。寡核苷酸与单链形式的耙核酸序列杂交所形成的双链区域是引发(启动)反应所需。在其它实施方式中，术语"扩增"或"核酸扩增"或"扩增反应"指使用连接酶或相似的酶来共价连接两条寡核苷酸或两条寡核苷酸子序列的生化反应，例如连接酶链式反应(LCR)。当两条寡核苷酸或寡核苷酸子序列在靶核酸序列中的毗连位点杂交时，连接酶能连接二者。或者，如果两条寡核苷酸或寡核苷酸子序列在隔开一个或多个核酸残基的位点杂交，即它们不毗连，则用聚合酶将双链区域之间的单链区域转化成双链区域，然后用连接酶连接毗连的寡核苷酸以形成连续的双链区域。术语"可捕捉序列"指能与另一核酸序列杂交的核酸序列。在一些实施方式中，可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，在示范性例子中后者可以是固定于支持物(例如，固体表面)或游离于溶液中。术语"捕捉寡核苷酸阵列"表示固定在固体表面上已知不连续位置的多个捕捉寡核苷酸。对于反应容器或诊断带的表面，捕捉寡核苷酸可以排列成两维空间寻址阵列，例如2X2阵列。或者，捕捉寡核苷酸可以排列成管状构形。在其它实施方式中，捕捉寡核苷酸排列在任何常规拓扑学构造的两维或三维反应容器的内表面或外表面上。核酸阵列是本领域已知的，可以许多方式分类；包括有序阵列(例如，分辨不连续位点的化学物质的能力)和随机阵列。有序阵列包括但不限于采用以下技术制成的阵列光刻印刷技术(阿弗麦屈克斯基因芯片(AffymetrixGeneChip))、点样技术(辛太尼(Synteni)和其它阵列)、印刷技术(休莱特帕—德阵列(HewlettPack.ard)和罗塞特阵列(Rosetta))，三维"凝胶垫"阵列等。还可使用液体阵列，即三维阵列方法，例如流式细胞术。当采用流式细胞术时，捕捉寡核苷酸宜固定于例如微球等支持物。在一些实施方式中，有序阵列包括在已知位置含有核酸的阵列。即，本文所述的可捕捉序列或捕捉寡核苷酸固定在基板上的已知位置。"已知"位置表示己知或原来已知的位点。本文所用的术语"嵌合型寡核苷酸"指包含至少两条核酸序列或部分的寡核苷酸，所述至少两条核酸序列或部分的位置或连接方式不是天然产生的。术语"互补"和"互补性"指通过碱基配对规则而相关的核苷酸序列。例如，序列"A-G-T-C"与序列"T-C-A-G"互补。互补可以是"部分互补"，其中只有一些核酸碱基按照碱基配对规则匹配。因此，互补性无需是完全的；可以有能影响第一序列和第二序列之间杂交的任何数量的碱基不匹配。然而，如果突变数量太大以致于在严格性最低的杂交条件下亦不能发生杂交，则该序列不是互补序列。因此，"基本上互补"表示第一序列与第二序列足够互补，从而能在所选择的反应条件下杂交。本领域熟知足以实现特异性的互补性和杂交严格性的关系。因此，本发明的任何分析方法中可使用基本上互补的序列。例如，这种序列可以是完全互补的或可含有l个到多个不匹配，只要杂交条件足以区分靶序列和非靶序列。因此，基本上互补的序列的相同性百分比可以是100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75或更低。或者，核酸之间可具有"完全"或"总体"互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度有明显影响。除非另有需要，否则本说明书全文中的词语"包含"、"含有"和"包含的"应理解为暗示了包括一个所述步骤或元件或步骤组或元件组，但也不排除任何其它步骤或元件或步骤组或元件组。本文所用的"杂交"表示互补核苷酸序列的配对产生了I)NA-DNA、DNA-RNA或DNA-PNA杂交体。互补碱基序列是通过碱基配对规则而相关的那些序列。对于DNA，A与T配对，C与G配对。对于RNA，U与A配对，C与G配对。还可使用碱基肌苷(I)。肌苷可与C或A.或G或T(稳定性呈降序)形成碱基配对。在这点上，本文所用的术语"匹配"和"不匹配"指互补核酸链中配对核苷酸的杂交能力。匹配的核苷酸能有效杂交，例如上述经典A-T和G-C碱基配对。不匹配是不能有效杂交的核苷酸的其它组合。"分离的"表示基本上或实质上不含自然状态下与其正常相伴的组分的物质。例如，本文所用的"分离的寡核苷酸"指从天然存在的状态下与其侧接的序列中纯化出的寡核苷酸，例如，除去了其正常毗连序列的DNA片段。本文所用的术语"寡核苷酸"指由通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物)相连的多个核苷酸单位(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其相关的结构变体或合成类似物)构成的聚合物。因此，虽然术语"寡核苷酸"通常指其中的核苷酸和连接键是天然产生的核苷酸聚合物，但应该理解该术语的范围内还包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、2-0_甲基核糖核酸等。该分于的确切大小可因具体应用而不同。寡核苷酸通常较短，般约10-30个核苷酸，但该术语也可指任何长度的分子，虽然术语"多核苷酸"或"核酸"通常用于大的寡核苷酸。本文所用的术语"寡核苷酸"、"多核苷酸"或"核酸"指DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA或PNA。该术语通常指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。"引物"表示与DNA或RNA链配对时，能在合适的聚合试剂存在下启动引物延伸产物合成的寡核苷酸。为获得最大程度的扩增效率，引物通常是单链的，但还可以是双链的。引物必须足够长，从而能在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的长度取决于许多因素，包括应用、采用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，依据耙序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-35个或更多个核苷酸，虽然其可以只含有较少的核苷酸。引物可以是大的多核苷酸，例如约200个核苷酸-几千碱基或更多。可以选择引物，使其与设计与之杂交的模板上的序列"基本上互补"，并可用作启动合成的位点。"基本上互补"表示引物的互补性足以与耙核苷酸序列杂交。引物与设计与之杂交的模板之间最好不含错配，但这不是必需的。例如，可将非互补的核苷酸连接于引物的5，端，其余的引物序列与模板互补。或者，可将非互补核苷酸或非互补的核苷酸段插入引物中，前提是引物序列与要杂交的模板序列足够互补，从而形成用于合成引物的延伸产物的模板。用于描述两条或多条核酸序列之间序列关系的术语包括"参比序列"、"比较窗"、"序列相同性"、"序列相同性百分比"和"基本上相同"。"参比序列"的长度至少是10个，但经常是15-20个，常是至少25个单体单位(即核苷酸)。因为两条核酸序列可以各含有(l)在两条多核苷酸之间相似的序列(即，只是整个核苷酸序列的一部分)，和(2)在两条核酸序列之间不同的序列，一般通过在"比较窗"上比较核酸序列的序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域，从而在两条(或多条)核酸序列之间进行序列比较。"比较窗"指至少50个，通常约50-约100个，更常见约100-约150个连续位置的概念性区段，其中两条序列进行最佳比对后，将一条序列与连续位置数量相同的参比序列作比较。为了最佳比对两条序列，与参比序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可包含约20%或更少的添加或缺失(即，空位)。为比对某比较窗，可通过计算机执行算法[(威斯康星遗传学软件包7.0版(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，遗传学计算杉—L纟fi(GeneticsComputerGroup),575ScienceDrive麦迪逊，威斯康星州，美国)]或通过观测和所选择的各种方法产生的最佳比对(即，在比较窗..匕获得的同源性百分比最高)来最佳比对序列。还可参考BLAST族程序，例如Altschul等，1997，Nucl.AcidsRes.25:3389所披露的。序列分析的详细讨论可见Ausubel等，"《嵐新分子生物学方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)"，约翰威立父子公司(JohnWiley&Sonslnc)，1994-1998，第15章中的19.3部分。术语"反应容器"指进行本发明方法的容器。反应容器可以是适用于标准分子生物学反应的任何容器，因此可以适合这种应用的材料构建。这种材料可以是天然或合成的，或者可联用天然和合成材料形成。可用于构建反应容器的示范性材料包括塑料(例如，聚碳酸酯、聚苯乙烯和聚丙烯)、玻璃等。本发明的特别优选的反应容器包括常规PCR试管和微量滴定板，例如96-孔微量滴定板。在本发明的一些实施方式中，将捕捉寡核苷酸固定在反应容器的内表面上。在这些实施方式中，反应容器宜用透明材料构建，从而能从反应容器外部检测信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸的杂交。在具体的实施方式中，反应容器的特征在于其具有基本上平的表面。或者，反应容器的特征在于其具有基本上管状的表面，即将两维平面薄板巻成三维管状构形。可用这种构形将更大表面积的捕捉寡核苷酸固定入例如"流通"小室中。在其它实施方式中，反应容器是微射流装置。在本文中，术语"序列相同性"和"相同性"可互换使用，其指在比较窗上核酸序列按照核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸的相同程度。因此，"序列相同性百分比"通过以下步骤计算在比较窗上比较两条最佳比对的序列，测定两条序列中核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)相同的位置数以获得匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)，将结果乘以ioo从而获得序列相同性百分比。对于本发明的目的，"序列相同性"应理解为表示用软件随附的参考手册所用的标准默认值，通过DNASIS计算机程序(用于windows的2.5版本；购自日立软件工程有限公司(HitachiSoftwareengineeringCo.,Ltd.),南旧金山，加利福尼亚州，美国)计算的"匹配百分比"。本文所用的"严格性"指杂交期间的温度和离子强度条件，以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高，进行杂交的核酸序列之间的互补性程度越高。本文所用的"严格条件"指如下温度和离子强度在该条件下只有基本上互补或互补碱基比例高，优选具有精确互补性的多核苷酸和寡核苷酸才会杂交并且在一些实施方式中会产生扩增产物。所要求的严格性依赖于核苷酸序列，并取决于杂交期间存在的各种组分，严格性通常随所用的核苷酸类似物而有很大变化。本领域技术人员熟知严格条件。对于将寡核苷酸用作杂交反应中的探针，严格条件通常选择比在确定离子强度和pH下具体序列的计算热解链温度(Tm)低约10-20°C。Tm是50%的靶序列与互补探针杂交的温度(在确定离子强度和pH下)。本领域技术人员熟知Tm的计算。利用下式可以最佳地计算长度短于14个碱基残基的寡核苷酸的Tm:Tm=4(wG+xC)+2(yA+zT)-16.6*logl0(0.050)+16.6*loglO([Na+])，其|::l::1w、x、y、z分别是序列中碱基G、C、A、T的数目，[Na+]是盐浓度。对于长亍13个碱基残基的寡核苷酸，通过Breslauer等(1986，Proc.Nat.Acad.Sci.83:3746-50)所述的最近邻公式(nearestneighbourformulae),但使用Sugimoto等(1996，Nucl.AcidsRes.24:4501-4505)公布的数值计算Tm。RNA热力学特性的数值可取自Xia等(1998，Biochemistry37:14719-14735)。应该理解寡核苷酸探针或引物至少可在低严格条件.F，优选至少在中等严格条件F，更优选在高严格条件下与靶序列杂交。本文所述探针杂交反应的低严格条件包括和包含42'C杂交条件为至少约1Mv/v-至少约15%v/v的甲酰胺和至少约1M-至少约2M的盐；42'C洗涤条件为至少约1M-至少约2M的盐。低严格条件还包括65X:杂交条件为1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS;室温下洗涤条件为(i)2XSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5%BSA，1mMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，5%SDS。探针杂交反应的中等严格条件包括和包含42'C杂交条件为至少约16%v/v-至少约30%v/v的甲酰胺和至少约0.5M-至少约0.9M的盐；42'C洗涤条件为至少约0.5M-至少约0.9M的盐。中等严格条件还包括65t:杂交条件为1%牛血清白蛋白(BSA)、lmMEDTA、0.5MNalIP04(pH7.2)、7%SDS;42。C洗涤条件为(i)2XSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5。/。BSA，lmMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，5%SDS。探针杂交反应的高严格条件包括和包含42t:杂交条件为至少约31%v/v-至少约50%v/v的甲酰胺和至少约0.01M-至少约0.15M的盐；42。C洗涤条件为至少约0.01M-至少约0.15M的盐。高严格条件还包括65。C杂交条件为1%BSA、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS;65。C以上的洗涤条件为(i)0.2XSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5%BSA，lmMEDTA，40mMNalIP04(pH7.2)，1%SDS。本领域熟知探针杂交反应的其它严格条件。技术人员己知可以调节各种因素来优化杂交特异性。可优化最终洗涤的严格性以确保高杂交程度。详细的例子参见《最新分子生物学方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(同上)，第2.10.1-2.10.6页和《分子克隆实验室手册》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL〕(Sambrook等编)(冷泉港出版社，1989),第1.101-1.104章。短语"靶核酸序列"指感兴趣的任何核酸序列。其可以是完整的基因或其一部分。因此，靶核酸序列可以是包含遗传突变，例如但不限于核苷酸插入、缺失和单核苷酸多态性(SNP)的某基因一部分。靶核酸序列还可以是完整的基因或其一部分编码的核酸。因此，本发明所考虑的靶核酸序列包括DNA、cDNA、RNA、mRNA和cRNA。靶核酸序列还可以是天然产生或合成的核酸分子。Z分桥微,鄉旅本发明提供分析靶核酸序列的方法，例如测定其是否存在或数量。该方法利用多种寡核苷酸与核酸处理反应合作，从而在耙核酸序列存在下产生可检测信号。所述多种寡核苷酸包含(1)任选固定在固体表面并且不与靶核酸序列杂交的捕捉寡核苷酸；(2)提供可检测信号并与捕捉寡核苷酸杂交的信号寡核苷酸；(3)在一些实施方式中可用作引物的至少一种嵌合型寡核苷酸，其包含(a)与耙核酸序列的子序列杂交的第一耙向序列；和(b)与选自以下的序列杂交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信号寡核苷酸；和(4)包含第二靶向序列的至少一种协作性寡核苷酸，其在一些实施方式中可用作引物，所述第二靶向序列与选自以下的序列杂交(a)靶核酸序列中与所述第一靶向序列杂交的子序列不同的子序列；或(b)耙核酸序列的互补链的子序列，或(c)至少一种嵌合型寡核苷酸。本发明的核酸处理反应获得的如下反应产物(如果试样中存在耙核酸序列的话)其包含第一链以及第二链，第一链包含至少一种嵌合型寡核苷酸或其延伸产物，第二链包含至少一种协作性寡核苷酸或其延伸产物，从而阻断了嵌合寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，进而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交并给出靶标是否存在或数量的信号。当靶核酸序列不存在时，核酸处理反应不可能发生，从而使得嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交并阻断信号。3.孩麼必潘反座本发明方法可采用能产生上述反应产物的任何核酸处理方法。示范性核酸处理方法包括核酸扩增。本领域熟知核酸扩增的代表性方法，包括但不限于PCR(参见，例如Saiki等，1985，Science,230:1350-1354;Mullis等，1987，MethodsEnzymol155:335-350)、链置换扩增(SDA和多重SDA(MSDA);参见，例如美国专利5,422,252和Little鄉)、滚环扩增(RCA;参见，例如Liu等，1996，J.Am.Chem.Soc118:1587-1594和美国专利5,854,033及美国专利6,642,034)、基于核酸序列的扩增(NASBA;参见，例如So()knanan等，1994，Biotechniques17:1077-1080)、连接酶链式反应(LCR;参见，例如WO89/09835)和Q|3复制酶扩增(参见，例如Tyagi等，1996,同,..t:)。还可利用这些技术的各种替代方法，例如SyvanenAnne-Christine，(2001，同上)所总结的。在本方法中，可利用不同扩增反应的任何可用特征组合来提高该方法的灵敏度和/或特异性。在一些实施方式中，本发明的核酸处理反应基于聚合酶依赖性核酸扩增反应。示范性的此类扩增是聚合酶链式反应(PCR)，其中当一对寡核苷酸中的一条寡核苷酸与其互补的寡核苷酸分开时，由其合成的延伸产物可用作模板来合成该对中另一寡核苷酸的延伸产物。然而，本领域技术人员知道，通常利用热稳定的引物依赖性聚合酶，聚合酶的选择通常取决于所用的具体PCR方法。如图2所示，在示范性的此类例子中，嵌合型寡核苷酸的靶向序列与靶核酸序列之间形成第一杂交体。然后用聚合试剂延伸靶向序列，该试剂可以是引物依赖性DNA聚合酶或引物依赖性逆转录酶。这种酶的作用是将核苷三磷酸(例如，脱氧核糖核苷酸三磷酸；dNTP)掺入杂交体的靶向序列延伸段中，这种掺入作用可以对含有在寡核苷酸引物的3，末端核苷酸和靶核苷酸序列的5，末端核苷酸之间完全匹配配对的杂交体具有选择性，或者无选择性，无论这种配对是否完全匹配。在这点上，熟知一些酶，例如真核引物依赖性DNA聚合酶和鸟类骨髓瘤病毒(AMV)逆转录酶不具有3'纠错活性(核酸外切酶'(exo:0，因此只延伸含有在寡核苷酸的3'末端核苷酸和靶核苷酸序列的5'末端核苷酸之间完全匹配的杂交体中结合的核苷酸。或者，其它结合试剂，例如原核来源的引物依赖性DNA聚合酶包括，例如大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，具有纠错活性(核酸外切酶+(exo+))，因此不显示其选择性，虽然可从商品供应商购得缺乏这种纠错活性的这种酶的变型。然而，寡核苷酸延伸使用3'exo—聚合试剂通常是理想的。本领域技术人员熟知基于PCR的核酸处理反应可用的合适聚合试剂。为重复PCR的轮次而无需额外加入DNA聚合酶，DNA聚合酶宜是热稳定的，包括但不限于激烈火球菌(尸jrococc船y^/owX)(/yw)I:)NA聚合酶、火球菌种(P，ococcwGB-D(/^p)DNA聚合酶、沃氏火球菌(/^racoccMwoew/)(尸wo)DNA聚合酶、水生栖热菌(77zermz^a^a"c船)(7^《)DNA聚合酶、布氏栖热菌(77^wws6roc/am^)(7^)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermusflavus)(^7)I)NA聚合酶、排气孔嗜高温菌(77^mwcocc^toorafo)(77/或^W)[)NA聚合酶、海栖热袍菌(772ermo/oga"wW"ma)(7^a)DNA聚合酶和嗜热栖热菌(7Tzd^Ae，o;/z//^)(7%)DNA聚合酶和它们的衍生物。本发明所用的合适逆转录酶，例如但不限于鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和嗜热栖热菌(77^mzMAe，o;/H7w力(7Y/z)DNA聚合酶和它们的衍生物。选择聚合试剂的其它因素包括试样中的核酸是DNA还是RNA(即，一般只有逆转录酶能将脱氧核苷三磷酸有效掺入RNA模板的延伸产物中)。利用靶核酸序列作为模板来延伸嵌合型寡核苷酸的耙向序列会产生含有第一延伸产物和靶核酸序列的双链体。然后通过变性使该第一延伸产物与耙核酸序列分开，从而使得协作性寡核苷酸能与该第一延伸产物杂交，因此形成了第二杂交体。然后，如上所述用该第一延伸产物作为模板延伸该协作性寡核苷酸。因为该第--:延伸产物包含该嵌合型寡核苷酸，在此阶段形成的第二双链体包含该第一延伸产物和与该第一延伸产物互补，因而也与该嵌合型寡核苷酸互补的第二延伸产物。此第二双链体对应于本发明的反应产物。与可捕捉序列互补的序列是"阻断"序列，其用亍阻断嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，从而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交。在其它实施方式中，聚合酶依赖性扩增包括滚环扩增(RCA)，其中寡核苷酸引物与环状核酸分子的杂交可进行连接，即环化，DNA聚合酶(通常具有链置换活性)利用该环状核酸分子作为模板合成第一延伸产物。延伸产物通常是长核酸分子，其含有多个与模板环状核酸分子互补的重复序列。对于PCR，在互补寡核苷酸引物存在F，第一延伸产物随后可用作模板来合成其它延伸产物，从而能扩增原始模板环状核酸分子。如图3所示，在此类的示范性例子中，协作性寡核苷酸和靶核酸序列之间形成第一杂交体，从而能在杂交后环化该协作性寡核苷酸。协作性寡核苷酸具有可连接的末端(如图3所示的E,'和E2')，从而可用连接酶催化连接该协作性寡核苷酸的5'和3'末端(详述于—F文)。含有可捕捉序列(B')的嵌合型寡核苷酸与环化的协作性延伸产物杂交，引发用链说换聚合酶催化的第一延伸产物的产生。加入与第一延伸产物某区域互补的另一协作性棼核苷酸(F')，假如环状探针得到连接，则能引发第二延仲产物产生。第二延伸产物与嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列部分互补。第二延伸产物中与可捕捉序列互补的序列是"阻断"序列，其阻断嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，从而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交。适合r本发明所考虑的RCA的DNA聚合酶宜能置换与模板链互补的链，这称为链'A':换，这些:DNA聚合酶缺乏5'到3'核酸外切酶活性。合成连接的协作性寡核苷酸多份拷贝需耍链置换。如果具有5'到3'核酸外切酶活性，则能破坏合成的链。本发明方法所用的DNA聚合酶具有高度持续性也是理想的。通过评估本发明方法所用DNA聚合酶进行滚环复制的能力不难测定其是否适用亍本发明方法。示范性滚环DNA聚合酶包括细菌噬菌体029DNA聚合酶(美国专利5,198.543和5,001,050)、噬菌体M2DNA聚合酶(Mats腿oto等，Gene84:247(1989))、噬菌体(!)PRD1DNA聚合酶(Jung等，Proc.Natl.Acad.Sd.USA84:8287(1987))、VENT.RTM.DNA聚合酶(Kong等，J.Biol.Chem.268:1965-1975(1993))、DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等，Eur.J.Biochem.45:623-627(1974))、T5[)NA聚合两每(Chatterjee等，Gene97:13-19(1991))、I)RDlDNA聚合酶(Zhu和Tto，Bk)chim.Biophys.Acta.1219:267-276(1994))和T4DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic,Curr.Biol.5:149-157(1995))。具体的实施方式中利用(D29DNA聚合酶。利用链置换因子，例如解旋酶可促进链置换。能在链置换因子存在下执行滚环复制的任何DNA聚合酶认为适用于所述方法，即使该DNA聚合酶在不存在这种因子时不能执行滚环扩增。可用亍RCA的链置换因子包括但不限于BMRF1聚合酶附属亚难(accessorysubunit)(Tsu讓i等，J.Virology67:7648-7653(1993))、腺病点DNA-结合蛋白(Zijderveld和vanderVliet，J.Virology68:1158-1164(1994))、单纯疱疹病「1ICP8(Boehmer和Lehman,J.Virology67:711-715(1993);Skaliter禾[lLehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10665-10669(1994))、单链DNA结合蛋白(SSB;Rigler和Romano,J.Biol.Chem.270:8910-8919(:1995))和小牛胸腺解旋酶(Siegel等，J.Biol.Chem.267:13629-13635(1992))。/[;其它实施方式中，该核酸处理反应基于连接酶依赖性核酸扩增。具体地说，XHl5]^利4,883,750描述了寡核苷酸连接试验。连接酶依赖性反应的例子是连接酶链式反应(LCR)，其中一种寡核苷酸与第一靶序列杂交，另一种寡核苷酸与该第一靶序列毗连的第二靶序列杂交。将杂交配对的寡核苷酸用作连接底物来产生含有两种寡核苷酸的连接产物。如果耑耍，随后nj以将连接产物从靶序列上置换下来(例如通过变性)以产生该靶序列的其它连接产物，因此扩增了与该靶核酸互补的连接寡核苷酸。如图4所示，在该类型的示范性实例(=卩'，通过嵌合型寡核苷酸的第-耙向序列与靶核酸序列的第一子序列杂交形成第一杂交体，其中该嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补。然后通过第一协作性寡核苷酸的第二靶向序列与该靶核酸序列的第::::::::::子序列杂交形成第二杂交体，其中该第..::::::::::子序列毗连该第一子序列。随后在该第一子序列的5'核苷酸与连接试剂存在.F将该嵌合型寡核苷酸与该第一协作性寡核苷酸相连，从而形成含有该靶核酸序列的第一和第二子序列及含有该嵌合型寡核苷酸和该第一协作性寡核苷酸的连接产物的第-双链体。本领域技术人员熟知这些实施方式中可用的合适连接试剂，包括但不限于T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶和丝状栖热菌(77)DNA连接酶以及它们的衍生物。在某些实施方式中，该连接试剂是热稳定性的。连接后，通过变性将连接产物与靶核酸序列分离，从而可使第二协作性寡核苷酸与连接产物的嵌合型寡核苷酸和第协作性序列部分杂交形成反应产物。第二协作性寡核苷酸具有与嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列互补的阻断区域，即阻断序列，该序列用亍阻断嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，从而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交。当第一协作性寡核苷酸未与嵌合型寡核苷酸相连，即耙核酸序列不存在时，第二协作性寡核苷酸的阻断区域通常不与可捕捉序列杂交，或只以较低的亲和力杂交。本领域技术人员己知，通过以—F步骤可使得只有第一协作性寡核苷酸与嵌合型寡核苷酸相连时发生阻断区域与可捕捉序列的实质性杂交(i)调节第二协作性寡核苷酸的阻断区域的大小和/或(ii)该阻断区域与嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列的互补性；或(iii)插入非互补序列使之舭连阻断序列。调整毗连阻断序列的非互补序列碱基组成使之与第一连接产物更多或更少地互补能通过以R方式调节检测系统的灵敏度。如果将非互补序列(图4中B2和E2之间的区段)与第一连接产物调节(或"调谐")为更互补，将增加检测系统的灵敏度(即，使之能检测浓度较低的靶序列)，而如果将调节(或"调谐":)为与第一连接产物的互补性较低，则检测系统的灵敏度降低。因此，可利用可调谐非互补间插序列来调节处理反应的灵敏度。图5A显示了采用LCR的另一示范性例子，其包括将第一嵌合型寡核苷酸的第,巴向序列(Er-Br)与靶核酸序列的第一予序列杂交以形成第一杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一亍序列的5'核苷酸互补，并且可捕捉序列的5'核苷酸(该可捕捉序列是该第一嵌合型寡核苷酸的一部分)不可连接。然后使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列(E2'-B2')与靶核酸序列中毗连该第一子序列的第::::::::子序列杂交以形成第二杂交体，其中可捕捉序列的3，核苷酸(该可捕捉序列是该第二嵌合型寡核苷酸的一部分)不可连接。在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在F，将该第一嵌合型寡核苷酸与该第二嵌合型寡核苷酸相连，从而形成包含该靶核酸序列的第---和第::::::::::子序列及同时含有该第一嵌合型寡核1f酸和该第二嵌合型寡核苷酸的连接产物的第一双链体。本领域技术人员熟知该实施方式中可用的合适连接试剂，包括但不限于T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶和丝状栖热菌(70DNA连接酶以及它们的衍生物。在一些实施方式中，该连接试剂是热稳定性的。然后使该第一双链体变性来分离连接产物与耙核酸。以此方式可将连接产物与捕捉寡核苷酸(图5A中的B)杂交，从而竞争与信号靡核苷酸(图5A中的B")结合。在此例，超过预定范围的信号量与起始靶序列的含量逆相关。在该例子的改进形式中，与第一嵌合型探针(Er-Br)和第二嵌合型探针间有"间隙"(图5B)。杂交后，先用聚合酶填补Er和E2，之间的间隙，再用连接酶催化连接步骤。或者在杂交步骤中加入与靶标(E)中的间隙序列互补的间隙填补寡核苷酸，并且该间隙填补寡核苷酸参与连接反应。图6A显示了采用LCR的另--示范性例子，包括将第一嵌合型寡核苷酸的第一耙向序列与耙核酸序歹"E)的第一子序列杂交以形成第一杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸包含能杂交捕捉S核苷酸的可捕捉序列(1V)，并且该第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第-子序列的5'核苷酸互补。使第::......:嵌合型寡核苷酸的第二耙向序列(E2'-B4')与靶核酸序歹U(E)中毗连该第一子序列的第二子序列杂交以形成第二杂交体，其中该第二嵌合型寡核苷酸包含能杂交信号寡核苷酸(B")的可捕捉序列(IV)。在该第一:f序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，将该第一-嵌合型寡核苷酸4该第二嵌合型寡核苷酸相连，从而形成包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及冋时含有该第一嵌合型寡核苷酸和该第二嵌合型寡核苷酸的连接产物的第一双链体。然后使该第--双链体变性来分离反应产物与靶核酸。通过与基板上的捕捉寡核苷酸以及含有可检测部分的信号寡核苷酸杂交来检测反应产物，例如但不限于乳胶珠、胶体金、酶、量子点(quantumdot)或信号放大技术(SAT;例如翻专利5,902,724)。在后一例子中，超过预定范围的信号量与原始样品中的靶序列含量成比例。相关实施方式(图6B)需要存在聚合酶来填补与El'和E2'互补的区域之间的间隙序列，或使用具有适合的磷酸化末端从而能进行酶催化连接的可连接间隙填充性寡核苷酸。本发明的连接酶依赖性实施方式产生的连接产物还可以通过RCA环化和扩增。木发明的核酸处理反应可以包括试验可含有的各种其它试剂。这些试剂包括，例如盐类、缓冲液、中性蛋白质(例如白蛋白)、洗涤剂等，这些试剂可用于促进最佳杂交、链合成和检测，和/或降低非特异性或背贯相互作用。依据样品制备方法和靶标的纯度，还可使用提高试验效率的其它试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌剂等。《微辦根据试样中是否存在靶核酸序列，本发明捕捉寡核苷酸可杂交或"捕捉"信号寡核苷酸或嵌合型寡核苷酸。在一些实施方式中，将捕捉寡核苷酸固定在固体表面上，而在其它实施方式中，它游离于溶液中。在捕捉寡核苷酸固定在固体表面上的实施方式中，该表面可由合成改性的天然、合成或天然产生的物质构成，包括但不限于纤维素物质，例如纸张，纤维素和纤维素衍生物，如醋酸纤维素；玻璃或玻璃纤维；天然或合成的织物；塑料；尼龙；多孔凝胶，例如琼脂糖；硅胶、葡聚糖和明胶；多孔纤维基质；基亍淀粉的物质，例如葡聚糖凝胶(Sephadex)交联的葡聚糖链；陶瓷物质；乳胶；聚氯乙烯和聚酰胺膜；聚苯乙烯；聚碳酸酯；和聚氯乙烯-二氧化硅的组合，等，。在一些实施方式中，固体表面形成了反应容器中进行处理反应的表面。在其它实施方式中，固体表面还可以是插入反应容器中并在完成用于信号检测的处理反应后拿出的诊断带的表面。在还有其它实施方式中，固体表面是任选作标记以协助鉴定的微粒或珠的表面。在其它实施方式中，表面是半导体纳米线(semiconductingnanowire)，该表面宜配置成场效应晶体管，并在核酸序列(例如，可捕捉序列)与固定在纳米线表面的捕捉寡核苷酸结合或杂交后能改变导电率(参见，例如Cui等，2001，Science293:1289-1292;Hahm和Lieber，2004，NanoLett.4:51-54;Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.SciUSA100:4984-4989;Chen等，2004，J.Am.Chem.Soc.126:1563-1568和Patolsky等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:〗4017-14022)。可采用任何合适的技术将捕捉寡核苷酸固定在固体表面。例如，Holstrom等(1993，Anal.Biochem.209:278-283)利用生物素对亲和素和链棉亲和素的亲和力将生物素化的核酸分子固定于亲和素/链霉亲和素包被的支持物.....t:。可采用的另方法包括用聚-L-Lys或聚-L-Lys、Phe预先包被聚苯乙烯或玻璃固相，然后利用双功能交联剂共价连接氨基或巯艰改性的寡核苷酸(Running等，1990，Biotechniques8:276-277;Newton等，1993，NucleicAcidsRes.21:1155-1162)。Kawai等(1993，AnalBiochem.209:63-69)描述了连接短寡核苷酸探针以形成多聚体，再将其克隆入噬菌粒载体的替代方法。然后再将这些寡核苷酸连接在聚苯乙烯板....匕并用254nmUV照射固定。还可参考将短的5'-磷酸化寡核苷酸引物直接共价连接于化学改性的聚苯乙烯板(交联(CovalinkTM)板，南克公司(Nunc))的方法(Rasmussen等，1991，Anal.Biochem.198:138-142)。还可考虑O'C()rmeU-Mak)ney等的文章(1996，TIBTECH14:401-407)，该篇文章披露了分别将生物素化寡核苷酸和巯基化寡核苷酸固定于链霉亲和素包被的硅晶片和碘乙酰胺包被的硅晶片。还将氨基改性的寡核苷酸固定在异硫氰酸酯包被的玻璃上(Guo等，1994，NucleicAcidsRes.22:5456-5465)和环氧硅烷(silane-ep()xide)包被的晶片.....匕(Eggers等，1994，BioTechniques17:516-5240)。......I二述方法指合成后将寡核苷酸引物连接于基板。或者，可以采用，例如Maskos和Southern(1992，NucleicAcidsRes，201679-1684)或Fodor等(同上)的方法原位合成寡核苷酸引物。本领域技术人员应知道可将捕捉寡核苷酸直接或间接固定于固体表面上。例如，可将捕捉寡核苷酸吸附于固体表面，或者共价连接于间隔分子，该间隔分子共价连接于固体表面。所述间隔分子可包括乳胶微粒，蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)或聚合物，例如葡聚糖或聚-(乙二醇)。或者，间隔分子可以包含同型-多核苷酸尾，例如寡聚-dT。捕捉寡核苷酸可以任何排列方式安排于固体表面，只要有助于在信号寡核苷酸被捕捉时检测信号寡核苷酸。在某些实施方式中，将捕捉寡核苷酸在固体表面上排布成捕捉寡核苷酸阵列的形式。将对应于具体靶标的捕捉寡核苷酸固定于阵列的特定位置有助于检测多重反应的结果。在将捕捉寡核苷酸固定在微粒或珠的实施方式中，根据反应所用微粒或珠总数的特定比例固定对应于具体耙标的捕捉寡核苷酸有助于检测多重反应的结果。本发明的捕捉寡核苷酸通常不是靶标特异性的，而是对本文所述嵌合型寡核苷酸或信号寡核苷酸中所含的各人工可捕捉序列特异(优选的)，从而能将它们用作"通用阵列"。即，含有相同或有限组捕捉寡核苷酸的阵列(固相或液相阵列)。"液相阵列"表示通过，例如流式细胞术分析的溶液中的阵列。在一些实施方式中，捕捉寡核苷酸采取通用表面的形式；S卩，包含可制造和应用于任何用途的有限组捕捉寡核苷酸的标准阵列。这种通用阵列与基本上互补的信号寡核苷酸联用，信号寡核苷酸在靶序列存在下与捕捉寡核苷酸结合。最终的用户只需设计包含任何所需靶序列的不同嵌合型寡核苷酸便可定制阵列，本领域技术人员知道这通常是简单而低廉的。一些实施方式制备了不同的通常为人工捕捉寡核苷酸阵列；即，捕捉寡核苷酸与己知的靶序列不具有互补性。然后可将与阵列的捕捉寡核苷酸基本上互补的可捕捉序列掺入嵌合型寡核苷酸中。试样中存在靶核酸序列时，本发明的信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交并提供表明该试样中存在该靶核酸序列的至少部分可检测信号。因此，信号寡核苷酸包含能与捕捉寡核苷酸杂交的核苷酸序列和与该寡核苷酸结合的信号试剂。信号寡核苷酸中结合有信号试剂，包括(1)直接连接信号试剂与信号寡核苷酸；(2)间接连接信号试剂与信号寡核苷酸(即，连接信号试剂与随后结合信号寡核苷酸的第二中间体)；和(3)连接信号寡核苷酸的后续反应产物。信号试剂宜直接连接于信号寡核苷酸。信号试剂可选自色原、催化剂、酶、荧光团、发光分子、化学发光分子、镧系离子(如铕(Eu34))、放射性同位素和直接可见的信号试剂。直接可见的信号试剂可利用胶态金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、乳胶颗粒、脂质体、枝聚体(dendrimer)(或枝聚体样或连环体(concatenated)核酸结构，例如SAT)或含有产信号物质的其它载体，等等。U.S.4,366,241;U.S.4,843,000和U.S.4,849,338披露了大量适用作信号试剂的酶。可用于本发明的合适酶信号试剂包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。可单独使用酶信号试剂，或与溶液中的第二酶联用。或者，可用作本发明合适信号试剂的荧光团包括但不限于荧光素、罗丹明、德克萨斯红、荧光黄或R-藻红蛋白。还应该知道在间接连接信号试剂的情况中(2)，例如生物素、洋地黄毒甙、链霜亲和素和各种蛋白质抗原等试剂可用作接头并且需要存在第二中间体来产生可检测信号。对于生物素，第二中间体可包括链霉亲和素酶偶联物。对于抗原信号试剂，第二中间体可包括抗体-酶偶联物。在捕捉寡核苷酸游离于溶液中的某些实施方式中，捕捉寡核苷酸包含信号检测系统的一部分，信号寡核苷酸包含该信号检测系统的另一部分，其中各部分协作以产生表明试样中存在靶核酸序列的第一信号或表明试样中不存在靶序列的第二信号。在示范性例子中，捕捉寡核苷酸包含受体荧光团，信号寡核苷酸包含供体荧光团，从而当信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交时，受体和供体荧光团足够接近进而诱发荧光共振能量转移(FRET)。检测到FRET能给出试样中存在靶核酸序列的信号，而缺乏FRET可给出试样中不存在该序列的信号。技术人员知道，可用以下两种方法中的至少一种检测FRET:荧光法或猝灭法。在荧光法中，将荧光检测器设置于受体荧光团的发射光谱，供体向受体的能量转移以及受体的荧光表明信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸结合。在猝灭法中，将检测器设置于供体荧光团的发射光谱，供体向受体的能量转移以及供体光谱的猝灭表明信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸结合。本发明的嵌合型寡核苷酸包含与靶核酸序列的子序列杂交的第一靶向序列和与选自捕捉寡核苷酸或信号寡核苷酸的序列杂交的可捕捉序列。如上所述，不存在靶核酸序列时，该嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交并阻断信号转导。在一些实施方式中，该嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列择优与捕捉寡核苷酸杂交。这可能是因存在的嵌合型寡核苷酸浓度高于信号寡核苷酸所致，或者可修饰嵌合型寡核苷酸，从而使其与捕捉寡核苷酸杂交的亲和力高于信号寡核苷酸的。对于靶序列而言，可捕捉序列通常是非天然的(即，外源性)核酸，但加入该靶向序列或与之相连。在本申请中应该注意，"靶序列"可包括原始样品靶序列，或衍生靶标，例如本文所述反应的反应物或产物；因此该靶序列可为OLA反应中的第一连接探针或连接的探针、PCR产物等。可捕捉序列用作嵌合型寡核苷酸的独特标识符(identifier)，从而成为靶序列的独特标识符。总之，可在，例如阵列上开发多组可捕捉序列和相应的捕捉寡核苷酸以最大程度降低它们彼此间以及与反应混合物中其它组分，包括耙序列和较大核酸序列中耙序列以外的序列(例如，基因组DNA中的序列)发生交叉杂交。美国申请公布号20030096239披露了一些可捕捉或"衔接头(adapter)"序列。示范性可捕捉序列是符合以下标准的序列。它们未在基因组(优选人基因组)中发现，它们不具有有害结构，例如发夹环。此外，根据系统的结构，本领域技术人员知道可将可捕捉序列掺入嵌合型寡核苷酸的3'或5'端，或内部位置。本领域技术人员知道可捕捉序列的长度可因所需的结合"强度"和所需的不同可捕捉序列数量而不同。在一些实施方式中，可捕捉序列一般长约6-约500个碱基对，通常是约8-约100，更常见是约10-约25个碱基对。在一些实施方式中，可捕捉序列唯一鉴别出能与靶向序列结合的靶序列。艮P，虽然可捕捉序列本身无需与靶序列结合，但该系统能通过检测是否存在可捕捉序列来检测靶序列。因此，随后将对可捕捉序列的检测用作存在靶序列的标志。分子生物学领域的技术人员熟知鉴定靶核酸序列的合适子序列的方法和算法，这些方法和算法广泛使用。这些方法包括序列比对方法(Gotoh0.Multiplesequencealignment:algorithmsandapplications."序歹ij比对算法及应用"Adv:Biophys.1999;36:1.59-206。LecompteO，ThompsonJD，Plewniak.:F，ThierryJ，Poch07Multiplealignmentofcompletesequences(MACS)inthepost-genomicera."后基因组时代的全长序列多重比对(MACS)"Gene.2001年5月30日；270(l,2):17-30)，点矩阵方法和数据库检索方法，例如局部序列比对基本检索:I::具禾口FASTA程序(PearsonWR.FlexiblesequencesimilaritysearchingwiththeFASTA3programpackage."采用FASTA3程序包的柔性序列相似性检索"MethodsMolBiol.2000;132:185-219;Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller,W.，Myers,E.W.和Lipman，D.J.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool.""局部序列比对基本检索工具"J.Mol.Biol.215:403-410)。靶核酸序列的子序列可以是核酸序列家族中的保守区域，或者可以是具体靶核酸序列中独特的区域。设计能杂交靶核酸序列的子序列的靶向序列的方法也是熟知并广泛使用的。在这点上，可参考Dieffenbach等，1995《PCR引物实验室手册》(PCRPrimer:ALaboratoryManual),CSHL出版社(CSHLpress),冷泉港，美国；Erlich，1989，《PCR技术DNA扩增的原理和应用》(PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification),势i，乇—克屯页出版th(StocktonPress),纟丑纟勺；I皿is等，1990，《PCR方案方法与应用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications),学术出版社(AcademicPress),纽约；Ellingboe等，1992，《PCR技术DNA测序》(ThePCRTechnique:DNASequencing),伊顿出版公司(EatonPublishingCo.)，内蒂克，马萨诸塞州；Bej等，1991，《生物化学禾卩分J'-卞物的E'il:综述》(CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology),26:301-334;Hughes等，2001，Nat.Biotechnol.19:342-347;Kane等，2000，NucleicAcidsRes.28:4552-4557;Relogio等，2002，NucleicAcidsRes.30:e51;Wang等，2003，Bioinformatics19:796-802;Chen等，2002，BMCBioinformatics3:27;Hill等，2002，生物信息学和化学信息学目标纪要(ProceedingsofObjectsinBio-&Chem-Informatics),OMG目标管理组(OMGObjectManagementGroup),华盛顿，哥伦比亚特区(美国)，第39-44页；Li等，2001，Bioinformatics17:1067-1076;Lipshutz等，1999，Nat.Genet.21:20-24;Nielsen等，2003，NucleicAcidsRes.3:1:3491-3496;Raddatz等，2001，Bioinformatics17:98-99;Rahmann，2003，JournalofBioinformaticsandComputationalBiology.1:343-361;Reymond等，2004，Bioinformatics20:27:1-273;Rimour等，2003，首届健康网格大会纪耍(ProceedingsofthefirstHealthgridConference),里昂，法国，第88-96页；Rouillard等，2002，Bioinformatics18:486-487;Rouillard等，2003，NucleicAcidsRes.31:3057-3062。耙向序列通常与靶核酸序列的子序列基本上互补。例如，如果靶核酸序列的子序列是A-G-T-A-C，T-G，则互补的靶向序列可以是T-C-A-T-G-A誦C。计算靶核酸序列的子序列和它们的互补序列的特性，并用于优化靶序列的设计。所关注的特性包括但不限亍寡核苷酸长度(以碱基残基计)、Tm和自身杂交的倾向性。本领域技术人员熟知评估这些特性的算法，这些算法广泛应用。可以参考Jarman，2004，Bioinformatics20(10):1644-1645;Gibbs等，1997，J.Virol.Methods63(1-2):9-16;Gibbs等，1998，J.Virol.Methods,74(1):67-76;Antoniw，1995，MolBiotechnol4(2):111-119;LeGuyader等，1996，Arch.Virol.141(11):2225-2235;Chen等，1995，VimsRes.39(2-3):365-375;Wilson等，1993，J.Clin.Microbiol.323:1573-1580;Chen等，1989，FEMSMicrobiol.Lett.57:19-24;Greigen等，1994，'l.Clin.Microbiol.32:335-351;Evertsson等，2000'APMIS108:385-392;Hryniewiecki等，2002，J.HeartValveDis.11:870-874;Rothman等，2002，J.Infect.Dis.186:1677-1681;McCabe等，1995，Pediatrics95:165-169;Lisby等，2002，Infect.Dis.Clin.NorthAm.16:393-412;Ley,1998，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.17:247-253。本发明的协作性寡核苷酸包含与选自以下的序列杂交的第二靶向序列靶核酸序列中与第一靶向序列所杂交的子序列不同的子序列；或靶核酸序列的互补链的子序列；或至少一条嵌合型寡核苷酸。在核酸处理反应中，有靶核酸序列存在时，协作性寡核苷酸与嵌合型寡核苷酸协作形成反应产物。在本发明全文中，反应产物包含第一链以及第二链，第一链包含至少一种嵌合型寡核苷酸或其延伸产物，第二链包含至少一种协作性寡核苷酸或其延伸产物，从而阻断了嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，进而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交。可采用任何合适的方法制备本发明方法所用的寡核苷酸，例如Nanmg等(1979，MethodsEnzymol.68:90)和美国专利4,356,270所述的磷酸三酯法。或者，可采用Brown等(1979，MethodsEnzymol.68:109)所述的磷酸二酯法进行这种制备。还可采用以上方法的自动实施方式。例如，在一种这样的自动实施方式中，将二乙基亚磷酰胺用作起始物质，并如Beaucage等，(1981，TetrahedronLetters22:1859-1862)所述进行合成。还可参考美国专利4,458,066和4,500,707，该两篇专利涉及在改性固体支持物上合成寡核苷酸的方法。还可能使用从生物学来源分离的寡核苷酸(例如，质粒或噬菌体DNA的限制性核酸内切酶消化产物的变性链)。在一些实施方式中，根据美国专利5,424,186(Fodor等)所披露的方法合成寡核苷酸。该方法采用光刻印刷技术在基板表面的精确已知位置合成多种不同的寡核苷酸。或者，可采用基于PCR的方法，例如Antson等(2000，NucleicAcidResearch28(12):e58)所述的方法产生寡核苷酸。这些基于PCR的方法特别适用于产生较长，特别是长于100个核苷酸的寡核苷酸。在适于寡核苷酸彼此杂交或与靶核酸(包括DNA或RNA)杂交的条件下按照本发明方法杂交核酸。在这点上，可以参考，例如NUCLEICACIDHYBRIDIZATION,APRACTICALAPPROACH(《核酸杂交，一种实用方法》)(Homes和Higgins编)(IRL出版社(IRLpress),华盛顿，哥伦比亚特区，1985)。杂交是否发生通常受以.F因素的影响核酸长度、pH、温度、一价和二价阳离子的浓度、核酸的杂交体形成区域中G和C的比例、介质粘度和可能存在变性剂。这种变量也影响杂交所需的时间。因此，优选条件取决亍具体的应用。然而，可常规测定这些经验条件而无需过多实验。在某些实施方式中，本发明方法采用高区分杂交条件。例如，可参考Wallace等(1979，Nucl.AcidsRes.6:3543)，他们描述了与含有一个内部碱基对不匹配的相似寡核苷酸探针相比，区别完全匹配并与靶序列完全同源的11-17个碱基长的寡核苷酸探针杂交情况的条件。还可参考Wood等(1985，Proc.Natl.Acid.SciUSA82:1585)，他们描述了利用3M四甲基氯化铵的11-20个碱基长寡核苷酸的杂交条件，其中杂交体的解链温度只取决于寡核苷酸探针的长度而无论其GC含B。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10个核苷酸长的寡聚物进行严格杂交的杂交条件，利用核苷酸类似物，例如(锁定'(locked)核酸最易亍获得相似的条件(Christensen等，2001BiochemJ354:481-4)。杂交反应通常能在任选含有杂交优化剂，例如等稳定剂(isostabilizingagent)、变性剂和/或复性加速剂的杂交缓冲液存在下进行。等稳定剂的例子包括但不限亍甜菜碱和低级四烷基铵盐。变性剂是通过千扰双链核酸中碱基之间的氢键或核酸分子的水合作用来降低双链核酸分子解链温度的组合物。变性剂包括但不限于甲酰胺、甲醛、二甲基亚砜、乙酸四乙酯、尿素、异硫氰酸胍、甘油和离液盐。杂交加速剂包括核不均--核糖核蛋白(hnRP)Al和阳离亍洗涤剂，例如溴化十六垸基三甲铵(CTAB)和溴化十二垸基三甲铵(DTAB)、聚赖氨酸、精胺、亚精胺、单链结合蛋白(SSB)、噬菌体T4基因32蛋白和乙酸铵与乙醇的混合物。还应知道如果本发明核苷酸序列含有两条链(例如，基因组DNA)或具有能阻碍寡核苷酸杂交和/或延伸(例如，RNA)的二级结构，单独或在合成延伸引物分子的同时分离核酸序列的链是理想的。可采用任何合适的变性方法，例如物理、化学或酶学方法实现这一链分离。分离多核苷酸序列各链的一种物理方法包括加热该核酸序列直至其基本上完全(>99%)变性。常规热变性可包括在约8(TC-105。C的温度进行1-10分钟。还可利用称为解旋酶或酶RecA(具有解旋酶活性)的各类酶中的某种酶，在有已知能使DNA变性的核糖ATP(riboATP)(rATP)存在下诱导链分离。KuhnHoffmann-Berling(1978，CSH-QuantitativeBiology4363)描述了用解旋酶分离核酸各链的合适反应条件，Radding(1982,Ann.Rev.Genetics16405-437)总结了利用RecA的技术。或者，可通过，例如施加并使低压电通过试样来进行电变性(Purvis等，1996，第四届国际生物传感器大会(4thWorldCongressonBiosensors)，曼谷，第39页，艾尔赛维高技术公司(ElsevierAdvancedTechnology),牛潍，该份文献纳入本文作为参考)，或用稀酸处理试样(例如，用0.25MHCl处理7.5-10分钟(Meinkoth和Wahl，1984，AnalBiochem.138267-284)。5./依据信号试剂的性质，可通过目测或仪器方法检测本发明信号寡核苷酸的可检测信号。通过用光照射荧光标记并用荧光光度计检测荧光；通过提供酶系统来产生可用分光光度计检测的染料；或利用反射计检测染料颗粒或有色的胶态金属或非金属颗粒；在利用放射性标记或化学发光分子的情况中，用辐射计数器或放射自显影法来仪器检测信号。因此，可用检测装置检测或扫描与标记相关的光，所述光可以包括荧光、发光、聚焦光束或激光。在这种情况中，可利用电荷耦合器件(chargecoupledevice)(CCD)或光电池来扫描阵列中各位置的捕捉寡核苷酸/信号寡核苷酸杂交体发射的光，并用数字计算机S接记录数据。或者，如果捕捉寡核苷酸固定在微粒或珠上，则可用荧光活化细胞分选(FASC)技术检测信号试剂。在一些情况中，仪器检测愤号不是必需的。例如，如本文所述，利用与阵列形式(format)相关的胶态金属颗粒或酶促产生的颜色斑点，冃测阵列能解读阵列的模式。在一些实施方式中，固定捕捉寡核苷酸的固体表面还可与模式(pattem)识别设备和软件联用将信号模式从(例如)阵列转化成明语遗传分布(plainlanguagegeneticprofile)。在某些实施方式中，利用"芯片读数计"检测阵列上信号试剂产生的信号。例如，Pirrung等(美国专利5,143,854)描述了"芯片读数计"可利用的检测系统。芯片读数计通常还可结合一些信号处理(方法)来确定具体阵列位置或元件的信号是真阳性或者可能是假信号。例如，Fodor等(美国专利5，925,525滩述了示范性芯片读数计。在具体的实施方式中，依据与捕捉寡核苷酸杂交的信号寡核苷酸的含量，本发明的可检测信号不仅表明靶核酸序列的存在，还表明靶核酸序列的含量。在这点上，可通过本领域技术人员已知的任何方法定量测定靶核酸序列，例如但不限于参考浓度己知的标准核酸样品。还可通过纳入阳性和阴性对照来帮助解读本发明的可检测信号。本领域技术人员不难确定合适的对照。阳性对照可包括嵌合型寡核苷酸，该嵌合型寡核苷酸中包含具有对试样中可能存在的序列(例如p-肌动蛋白序列)具有特异性的第一子序列。阴性对照可包括嵌合型寡核苷酸，该嵌合型寡核苷酸缺乏第一耙标特异性子序列或所具有的靶标特异性子序列基本上不与耙核酸序列杂交。6.试#本发明可用的合适试样包括从任何生物获得的单链或双链核酸提取物，或它们的拷贝。提取物可以从生物的任何来源获得，例如但不限于裂解物、细胞、组织或源自病毒、真菌、细菌、植物和动物的其它材料。可按照细胞裂解步骤制备核酸的样品提取物(例如DNA或RNA)，所述步骤包括但不限于用SDS、渗透性冲击、超声波处理、异硫氰酸胍和溶菌酶处理来实现裂解。本发明可用的合适DNA包括基因组DNA或cDNA。可通过例如《最新分子生物学方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY)(Ausubel等编)(约翰威利父子有限公司(JohnWiley&Sons,Inc.)，1995)和《分子克隆实验室手册》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL)(Sambrook.等编)(冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress),.1.989)描述的多种常规使用的方法中的任何一种来制备这种DNA。可通过例如《最新分子生物学方法》(同上)、《分子克隆实验室手册》(同上)和Chomczynski和Sacchi(1987，Anal.Biochem.162:156)描述的任何合适方法制备RNA样品提取物。本领域技术人员应知道，样品提取物可包括任何数量的事物，包括但不限于体液(包括但不限于实际..匕任何生物的血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液)；环境样品(包括但不限于空气、农业、水和土壤样品)；生物战剂样品；研究样品；纯化的样品，例如纯化的基因组DNA、RNA、蛋白质等；原始样品(细菌、病毒、基因组DNA等)。样品还可包括样品混合物，例如不同来源的两种或多种样品混合在一起。本领域技术人员应知道，实际上可对样品进行任何实验操作。7.反座叙可在任何合适的反应容器，包括试管、微孔、晶片(g卩，芯片)和微射流装置中实施本发明的分析方法。在一些实施方式中，用捕捉寡核苷酸、嵌合型寡核苷酸、协作性寡核苷酸、信号寡核苷酸、反应缓冲液、酶、信号试剂和核苷酸前体中的至少-种制造或预制容器。为实施本发明的分析方法而预先优化了含量的反应组分优选以溶液或冻千形式包含在一个或多个反应容器中。在该类型的示范性例子中，最终用户简单地将核酸样品、核酸加工酶、嵌合型寡核苷酸和协作性寡核苷酸l::l:'的至少-种加入这种反应容器中以实施测定。在一些实施方式中，将反应容器置于可控热(thermocontrollable)环境(例如热循环仪、孵育箱等)中来执行本发明分析方法的各步骤。在其它实施方式中，所述反应容器能执行这些分析方法中所用的一步或多步操作。这些操作包括但不限于混合；过滤；核酸提取；核酸纯化；结合；洗脱；为进行杂交、核酸处理反应(例如，PCR、LCR、OLA、RCR等)和使核酸杂交体变性而控热；和检测信号寡核苷酸。例如，美国专利申请公布2002/0115200、2002/0173032、2003/0008286和2005/0142565披露了该类型的示范性装置。试縱可将按照本发明方法分析试样中靶核酸序列所需的所有基本组分一起装在试剂盒中。这些试剂盒任选装有使观察信号试剂可见化的合适组分、阳性和阴性对照、稀释缓冲液等。还可装有适合对核酸实施核酸处理反应的组分。这些组分包括各种聚合酶，例如但不限于Tag聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶等(取决于所采用的核酸处理反应技术)，核苷酸前体和缓冲溶液。这种试剂盒还可装有用于各组分的不同容器。在一些实施方式中，这些试剂盒装有实施本发明方法的使用说明书。，在具体实施方式中，如章节7的实施例所述，本发明试剂盒中包含装有固定有捕捉寡核苷酸并含有预先制备的试剂混合物(优选冻干形式)的反应容器。为使本发明便于理解与实施，借助以下非限制性实施例描述了特别优选的实施方式。实施例实施例1RT-PCR检测甲型流感病毒聚合酶基因区段PB2设计RT-PCR引物来扩增甲型流感病毒PB2区段的一部分。在许多位点使用肌苷或混合碱基，从而能扩增许多不同病毒的聚合酶基因。引物之一是嵌合型的，只要PCR引物的5'端含有可捕捉序列或"标签"。本实施例中所用的可捕捉序列是5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'C[SEQIDNO:l]，在图2中标记为B')，其是设计(思路)如美国专利6，027，884所述的一条序列。可使用在靶序列(甲型流感病&)中未发现的任何其它可捕捉序列。嵌合型流感病毒正向引物Ch-PB2(1)F含有序列5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCAG(C/T)TCITC(C/T)TT(C/T)AG(C/T)TT(C/T)GG-3'[SEQII)NO:2]。流感病^反向引物PB2(2)R含有序列5'-AGTAT(T/C)CTCAT(T/C)CC(T/A)GANCC-3'[SEQIDNO:3]。这些引物所产生产物的预期大小约为1010bp。然而，这可能依据感兴趣的样品中存在的病毒而有所不同，因为分离物之间PB2编码序列的长度可能略有不同(图1)。詹辟微及脱.按照生产商的使用说明书，利用QIAGENRNA简便提取试剂盒提取样品(例如，羊水或临床样品)的病毒RNA。先加入600pL胍变性剂和6pL2-巯基乙醇以火活100样品，再应用QIAGEN提取方案。将提取的RNA重悬在50fiL不含RN:A.酶的水中(恰根，QIAGEN)。将2|iL重悬的RNA用于RT-PCR反应。将约100皮摩尔捕捉寡核苷酸(图2中标记为B)(间隔基团-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3';[SEQIDNO:4])结合在形状适用于热循环机器的试符的条带或96-孔板的各孔上。可利用5'修饰基团(例如，在氨基和捕捉寡核苷酸的5'端之间含有(CH2)6"间隔"序歹U(或类似序列)的氣基)实现捕捉寡核苷酸与基质的结合。或者，可将能以极高亲和力非共价结合链霭亲和素包被平板的5'生物素部分掺入捕捉寡核苷酸的一端。将信号寡核苷酸设计为含有与检测部分(例如，乳胶微珠)偶联的序列5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'([SEQIDNO:1]，图2中标记为B")，将其加入用捕捉棼核苷酸预包被的微孔滴定板的各孔。信号寡核苷酸的加入量与固定的捕捉寡核作酸m大致相等。可通过滴定各试验和各批试剂来凭经验确定要加入的捕捉裒核苷酸的精确量。定量,/定肺舰.已将PB2基因的986bp区段克隆入质粒PCRTOP02.1(英杰公司(Invitrogen))中。该质粒(本文称为"对照质粒")的序列与正向引物Ch-PB2(1)F和反向引物PB2(2)R的病毒序列互补部分互补。可利用对照质粒的连续稀释液作为试验的定量测定标准品和RT-PCR反应的试剂对照。将每孔0-10,000皮摩尔的质粒连续稀释液可用作定量测定(标准品)和试剂对照。当每孔固定约ioo皮摩尔捕捉引物时，定量测定标准品的浓度范围应是每孔0-10纳摩尔，包括每孔0、3、10、30、100、300、1000、3000和10,000皮摩尔，标准品的每种浓度使用一式两孔。1.如下所示，给热循环仪编程序，从而能在PCR扩增后立即进行cDNA合成cDNA合成1轮46°C30分钟加上60°C10分钟变性1轮94'C2分钟PCR扩增8轮由以下步骤构成的降温(stepdown)PCR:94'C变性15秒在各轮连续的"降温轮次"中，在56"C、54°C、52°C、50°C、48°C、46°C、44°C、42。C退火30秒68。C延伸75秒然后进行36轮94。C15秒(变性)4(TC30秒(退火)68°C75秒(延伸)最终延伸(任选的)l轮68"C5分钟2.在冰上将以下物质加入0.2mL不含核酸酶的薄壁PCR试管(其壁上预先结合了捕捉寡核苷酸)2X反应混合物25(iL模板RNA2(iL或对照质粒的连续稀释液(作为定量测定标准品)(2pL)有义引物Ch-PB2(1)F2nL(160皮摩尔)反义引物2pL(160皮摩尔)S叩erscriptIIIRT/钼标签混合物(SuperscriptIIIRT/PlatinumTaqMix)(英杰公司)22pL信号寡核苷酸(通过滴定预先测定的IOO皮摩尔或其它含量)以不含RNA酶的水加至50pL。3.轻柔混合并简单离心以确保所有组分位于扩增试管的底部。将反应平板或试管置于如上所述编程的预加热热循环仪中。4.随着反应进行，嵌合型流感病毒正向引物Ch-PB2(1)F5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCAG(C/T)TCITC(C/T)TT(C/T)AG(C/T)TT(C/T)GG-3'[SEQIDNO:2]掺入双链PCR产物并被隔离，因而其不能与固定的捕捉寡核苷酸(间隔物-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3';[SEQIDNO.4])和0',丄寡核苷酸之间的结合发生竞争。因此，各PCR轮次的"退火"阶段的信号寡核苷酸结合量随反应进行而增加。将含有未知(物质)的试管/孔中的信号强度与为了获得标准曲线而掺加了连续稀释的质粒标准品的试管/孔中的信号强度作比较。通过与标准曲线相比较，可以计算样品中靶病毒序列的浓度。并非必须用个别的连续试管/孔来产生标准曲线。在后一情况中，可使用"内标"，其中可使用只检测标准RNA或质粒的不同嵌合型引物和信号寡核苷酸配对，使含量己知的序列无关标准RNA或质粒在同一反应试管中与未知样品共同扩增。然后可将未知样品产生的信号量与同一试管中内标RNA或质粒产生的信号作比较。可在PCR反应的全部轮次结束时检测信号强度，或者用读数装置检测每轮PCR反应的信号强度。或者，在另一实施方式中，可将信号寡核苷酸连同除模板RNA以外的所有成分预先掺入(例如，通过冻干)反应试管。可通过加水重建反应混合物。实施例2"终点"检测本实施例采用与扩增步骤相隔离的"终点"检测步骤。如实施例1所述，将检测试剂和信号试剂加入96孔板中，其中每孔固定有约100皮摩尔捕捉寡核苷酸。可捕捉嵌合型RT-PCR引物如实施例1所示(Ch-PB2(l)F5'-CTTTAATCTCAAIDNO:2]。信号赢核苷酸如实施例1所示，但经生物素化，其在检测孔中的存在量与捕捉寡核昔酸的摩尔数相等(虽然这要对各种不同的分析物进行滴定)。RT-PCR引物与实施例1所用的那些相同。RT-PCR反应如实施例1所述进行，但RT-PCR期间不包含捕捉寡核苷酸和信号寡核苷酸。纳入连续稀释的质粒对照作为定量测定标准品。RT-PCR反应结束后，将反应产物在94'C加热5分钟，然后用湿的冰猝灭，并转移至检测平板。随着PCR反应进行，嵌合型可捕捉PCR引物掺入双链产物中，其与捕捉寡核苷酸竞争结合信号寡核苷酸的效率较低。反应结束时PCR产物的含量越高，对结合信号寡核苷酸的竞争就越弱。37。C静置20分钟后，用每孔300pL的lXSSCpll7.2洗涤检测平板三次，然后将PBS/0.1M吐温/0.5MBSA配制的链霉亲和素过氧化物酶偶联物(罗氏目录号腦9153)的1:10,000稀释液加入孔中，37"C培育30分钟，随后用PBS/吐温洗漆三次。翻转排干各平板，再向各孔中加入底物。然后加入用100mM乙酸钠/柠檬酸，pH4.9配制的0.42mMTMB(罗氏目录号11484281001)、0.004%H202(v/v)。用2MH2S04终止反应。所形成的产物首先是蓝色的，反应终止后呈黄色，可溶于水。以650nm为参比波长，用ELISA平板读数计检测450nm吸光度。实施例3连接酶依赖性反应本示范性实施例所用的DNA是对照质粒DNA，其含有甲型流感病毒PB2基因区段编码区的双链DNA拷贝。在该质粒中，PB2基因的986bp区段已插入质粒PCRT0P02.1(英杰公司)中。欽激遂絲樣微舰.将可连接的寡核苷酸设计成与甲型流感病毒中包括密码子627(或甲型流感病毒的PB2序列中位点等价的数字位点)的区域互补。Ch-PB2U5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCTTGCAGCIGCICCACCIG-3'([SEQIDNO:5]，图4中标记为B'匿Er)。PB2D-5'-AICAIAGIAGIATGCAGT-3'([SEQIDNO:6]，图4中标记为E2')。上游嵌合型连接寡核苷酸中所用的可捕捉序列与实施例1所用的序列相同。出于示范性的目的，利用上述标准质粒DNA作为靶标，使用热稳定的DNA连接酶进行连接酶依赖性反应。扩增和检测对照质粒(上述)中甲型流感病毒的PB2区段一部分的过程如下所述(Belgrader等，1995，GeneticIdentityConferenceProceedings(《遗传同一'性大会纪要》)，第六届人类鉴定国际论坛SixthInternationalSymposiumonHumanIdentification白勺'改进'方去)将5等份质粒稀释在20LCR混合物中，该LCR混合物中含有50mMTris/HClpH8.5，50mMKCl，10mMMgCl2，1mMNAD+，lOmMDTT，LCR寡核苷酸组(50皮摩尔各引物，Ch-PB2U和PB2D)和10单位的T叫DNA连接酶。热循环如下进行先进行1轮95"C2分钟的变性，再进行20-25轮95"C30秒的变性和65"C4分钟的连接。进行连接酶介导反应步骤的反应容器整合有包含专门设计的第二种协作性寡核苷酸(在图4中标记为B2-E2)的检测系统。对于检测系统，将约50皮摩尔的捕捉寡核苷酸(间隔物-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3')([SEQIDNO:4],图4中标记为B)结合在形状适用于热循环机器的试管的条带或96孔板的孔上。可利用5'修饰基团(例如，在氨基和捕捉寡核苷酸的5'端之间含有(CH^"间隔"序列(或类似序列)的氨基)实现捕捉寡核苷酸与孔的结合。或者，可将能以极高亲和力非共价结"链裙亲和素包被平板的5'生物素部分掺入捕捉寡核苷酸的一端。应注意该连接酶介导的实施方式中，捕捉寡核苷酸的序列与实施例1所用捕捉寡核苷酸的相同。该序列与嵌合型连接寡核苷酸ChPB2U的非流感病毒序列互补部分互补。将信号寡核苷酸设计为含有与检测部分(例如，乳胶珠)偶联的序列5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'[SEQIDNO:1]，将其加入用捕捉寡核苷酸(间隔物-5'-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG國3')[SEQIDNO:4]预包被的微量滴定板的各孔。信号寡核苷酸的加入量与已固定的捕捉寡核苷酸量大致相等。可通过滴定各试验和各批试剂来凭经验确定耍加入的捕捉寡核苷酸的精确量。遂接蘑分导游反应包翁.-1.95'C2分钟，使耙质粒DNA变性。2.使嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列(Ch-PB2U)与靶核酸序列的第一子序列杂交以形成第一杂交体，其中该嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补。3.使第一协作性寡核苷酸的第二靶向序列(PB2D)与靶核酸序列中毗连该第一子序列的第二子序列杂交以形成第二杂交体。4.在该第一子序列的5'核苷酸存在下，利用TaqDNA连接酶连接嵌合型寡核苷酸形和第一协作性寡核苷酸，形成第一双链体，其包含该耙核酸序列的第一和第二子序列及同时包含该嵌合型寡核苷酸和第一协作性寡核苷酸的连接产物。5.95'C使第一双链体变性30秒来分开连接产物与靶核酸。6.使专门设计的第二种协作性寡核苷酸(图4中的B2-E2)与嵌合型寡核苷酸及该连接产物的第一协作性序列部分杂交以形成反应产物。该专门设计的第二种协作性寡核苷酸可以在连接酶介导的循环过程结束时加入，或者可以在该过程开始时即存在于反应混合物中。7.以上形成的反应产物隔开了第二协作性寡核苷酸(图4中标记为B2-E2)中所含的阻断性寡核苷酸序列。隔开阻断序列使得信号寡核苷酸能与固定的捕捉寡核苷酸杂交，从而产生与靶序列含量定量相关的信号(通过乳胶微珠的局部浓度)。通过连接酶介导检测过程从起始浓度己知的对照质粒连续稀释液产生标准曲线，将产生的信号与标准曲线作比较并评估未知样品的起始浓度。实施例4滚环扩增反应本实施例描述了包含密码子627的流感病毒PB2基因区段某区域的检测和定量测定。在本实施例中，将含有PB2基因区段的986bpDNA插入物的质粒PCR-TOP02.1(英杰公司)用作靶标。美国专利5,854,033中描述了起始连接和RCA步骤的方案。1.97°C，将1纳克-300纳克的几种质粒连续稀释液在不同塑料试管中加热4分钟使之变性，并在有5'磷酸化开环探针存在的连接条件下温育，所述探针的5'和3'端分别与连接寡核苷酸CH-PB2U和PB2D的靶标特异性部分相同。95个核苷酸的开环协作性寡核苷酸与以下序列联用5'-AICAIAGIAGIATGCAGTTCATAAGACTCGTCATGTCTCAGCAGCTTCTAACGGTCACTAATACGACTCACTATAGGTTGCAGCIGCICCACCIG-3'[SEQIDNO:7]。反应混合物中T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs))的浓度是每mL缓冲液5单位，所述缓冲液含有10mMTris-HCl(pH7.5)、0.20MNaCl、10mMMgCl2、2mMATP。开环探针的浓度是80nM。总反应体积是40微升。37"C连接25分钟。2.从各试管取25pL，与等体积的缓冲液混合，所述缓冲液中含有50mMTris-HC1(pH7.5)、10mMMgCl2、1mMDTT、400一各dTTP、dATP、dGTP、dCTP，还含有浓度为0.2nM，具有以'F序列的42碱基嵌合型滚环复制引物5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCGCTGAGACATGACGAGTC-3'[SEQIDNO:8]。应注意该序列的某区域是与实施例1中用于RT-PCR的可捕捉序列相同的可捕捉序列。不同的区域与开环协作性寡核苷酸[SEQIDNO:7]互补。3.加入(D29DNA聚合酶(160ng/50pL),30。C温育反应混合物30分钟。4.向以上反应混合物中加入与新合成的链互补的另一种协作性寡核苷酸，即反向引物。该引物的浓度是0.2pM，其序列是5'-AATACGACTCACTATAGG-3'[SEQIDNO:9]。反应在3or再持续30分钟，合成的第:::::::::链与最初与环化协作性寡核苷酸互补的序列反向互补并包含与SEQIDNO:8所示区域互补的序列(用作阻断性序列)。5.各反应试管含有与SEQIDNO:8所示区域(上述)互补的固定捕捉寡核苷酸[SEQIDNO:4]和与实施例l所用信号寡核苷酸相同的信号寡核苷酸。随着第二链在步骤4中合成，合成了阻断性序列，该序列隔开了SEQIDNO:8所示区域，使其与固定的捕捉寡核苷酸序列[SEQIDNO:4]和信号寡核苷酸之间的结合的竞争较小。随着第二链产物数量累积，结合的信号寡核苷酸的数量增加。所产生的信号量与加入起始反应者的质粒用量成比例。6.在RCA的另一例子中，该方法与以前的例子相同，除了在反应结束时进行检测步骤和将25各反应样品转移至微孔平板中的不同检测孔中。用100皮摩尔捕捉寡核苷酸预包被检测孔，这些孔中含有与生物素偶连的信号寡核苷酸(100皮摩尔)。然后用链霉亲和素过氧化物酶(罗氏目录号10891.53)和底物TMB(采用与上述实施例2相同的方法)检测所结合的信号寡核苷酸浓度。实施例5终点"检测II本实施例显示了终点检测步骤的另一实施方式。如实施例1所述，将检测试剂和信号试剂加入96孔板中，其中每孔固定有约0.01皮摩尔捕捉寡核苷酸。可捕捉嵌合型RT-PCR引物是5'-CTTTAATCTCAATCAATACAAATCGAIGTIAGIGAIACICAIGG-3'[SEQIDNO:10]。信号寡核苷酸如实施例1所示，但作FAM标记，其在检测孔中的存在量与捕捉寡核苷酸的摩尔数大致相等(虽然各种不同分析物要滴定)。PCR.引物如以F的表格所列(PCR-标签引物和PB2(2)反向引物)。如实施例1所示进行PCR反应，但以200皮克cDNA作为耙标开始并省略了起始RT(反向转录)步骤。该反应在PCR期间不包含捕捉寡核苷酸和信号寡核苷酸地进行。PCR反应结束后，如下段到所述处理反应产物。随着PCR反应进行，嵌合型可捕捉PCR弓I物(PCR-标签弓I物)掺入双链产物中，其与捕捉寡核苷酸竞争结合信号寡核苷酸的效率较低。反应结束时PCR产物的含量越高，结合信号寡核苷酸的竞争就越弱。检测H7N7甲型流感病毒cDNA的具体反应条件如下所示:DNA模板(H7N7甲型流感病毒cDNA)雄pgPCR-标签引物5'誦CTTTAATCTCAATCAATACAAATCGAIGTIAGIGAIACICAIGG-3'[SEQIDNO:10]0.5-1皮摩尔PB2(2)反向引物5，-AGTATYCTCATYCCWGAICC國3，[SEQIDNO:3]4皮摩尔dNTP0.2mMDNA聚合酶l个单位MgCl22mMPCR缓冲液IX加水达到终体积50PCR扩增后(35轮)，将PCR产物稀释一倍。制备以下混合物抗-标签(5'-生物素-GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG-3'，[SEQIDNO:4])0.01皮摩尔标签(5，-FAM-CTTTAATCTCAATCAATACAAATC-3'，[SEQIDNO:l])0.25皮摩尔*用水将抗-标签和标签的总体积补至50PCR产物50|iL将100反应混合物转移入链霉亲和素平板的各孔中，37"C温育40分钟。倒掉平板中的混合物，用PBS洗涤4次。45向链霉亲和素平板的各孔中加入用抗体稀释剂(150mMTris-HCl，100mMNaCl，2%V/VFBS(胎牛血清)作1:1,000稀释的100(15毫单位)过氧化物酶偶连的抗-FAM抗体，37"C温育40分钟。倒掉平板中的混合物，用PBS洗涤4次。向链霉亲和素平板的各孔中加入100nLBM蓝(罗氏)底物，室温.F温育5分钟。将100H2S04加入链霉亲和素平板的各孔，室温下温育10分钟。检测450nm的吸光度。如图7所示，本项分析的结果表明采用终点检测步骤，该试验能灵敏地检测H7N7甲型流感病毒cDNA，相对于背景的信噪比良好。图8显示了测定上述试验中PCR-标签引物最佳用量的滴定实验的结果。这些结果表明50中PCT-标签引物的最佳用量约为0.5皮摩尔。琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色测定到采用该方法扩增的PCR产物具有预期大小(见图9)。本文引用的每份专利、专利申请和出版物的内容全文纳入本文作为参考。本文引用任何参考文献不应理解为承认该参考文献可用作本申请的"现有技术，，。说明书的目的是描述本发明的优选实施方式，而不是将本发明限制于任一实施方式或具体的特征组合。因此，本领域技术人员知道，借鉴本文内容可在所示例的具体实施方式中作出各种改进和改变而不脱离本发明的范围。所有这些改进和改变应属于随附的权利要求书的范围内。权利要求1.一种分析试样中靶核酸序列的方法，该方法包括-在一反应容器中合并(1)不与该靶核酸序列杂交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游离于溶液中)；(2)提供可检测信号并与捕捉寡核苷酸杂交的信号寡核苷酸；(3)至少一种嵌合型寡核苷酸，其包含(a)与靶核酸序列的子序列杂交的第一靶向序列；和(b)与选自以下的序列杂交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信号寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一种协作性寡核苷酸，所述第二靶向序列与选自以下的序列杂交(a)靶核酸序列中与所述第一靶向序列杂交的子序列不同的子序列；或(b)靶核酸序列的互补链的子序列，或(c)至少一种嵌合型寡核苷酸；和(5)包含核酸的试样；-使该反应容器中的内含物进行核酸处理反应，如果试样中存在靶核酸序列的话则形成反应产物，其中如此形成的反应产物包含第一链以及第二链，第一链包含至少一种嵌合型寡核苷酸或其延伸产物，第二链包含至少一种协作性寡核苷酸或其延伸产物，从而阻断了嵌合型寡核苷酸的可捕捉序列与捕捉寡核苷酸杂交，进而使得信号寡核苷酸与捕捉寡核苷酸杂交；和-检测信号寡核苷酸的可检测信号，该信号表明试样中靶核酸的存在或含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸处理反应是聚合依赖性核酸处理反应。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，其包括a)使嵌合型寡核苷酸的靶向序列与靶核酸序列杂交形成第一杂交体，其中该靶核酸序列以3'-5'方向延伸到该嵌合型寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，从而确定该靶核酸序列的非杂交部分；b)在聚合试剂和核苷酸前体存在下，使用该靶核酸序列的非杂交部分作为模板来延伸该第一杂交体的嵌合型寡核苷酸，从而形成了包含第一延伸产物和靶核酸序列的第一双链体；C)使该第一双链体变性以从第一延伸产物释放耙核酸序列；d)使协作性寡核苷酸与第一延伸产物杂交，从而形成第二杂交体，其中该第一延伸产物以3'-5'方向延伸到该协作性寡核苷酸的3'末端核苷酸以外，从而确定了该第一延伸产物的非杂交部分；和e)在聚合试剂和核苷酸前体存在下，使用该第一延伸产物作为模板来延伸该第二杂交体的协作性寡核苷酸，从而形成了包含该第一延伸产物和与该第一延伸产物互补的第二延伸产物的反应产物。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a)-e)重复一次或多次。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述聚合试剂是引物依赖性DNA聚合酶。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b)中的聚合试剂是引物依赖性逆转录酶。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合依赖性核酸处理反应包括i)使可环化的第一协作性寡核苷酸的第一靶向序列与靶核酸序列的第一子序列杂交形成第一杂交体，其中该第一协作性寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补；ii)使该第一协作性寡核苷酸的第二靶向序列与该靶核酸序列的第二子序列杂交形成第二杂交体，其中该第二子序列毗连该第一子序列；iii)在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该第一协作性寡核苷酸的第-一和第二靶向序列，形成的第一双链体，该第一双链体包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及环化形式的包含该第一协作性寡核苷酸的第一和第二靶向序列的连接产物；iv)使该第一双链体变性以从靶核酸释放连接产物；v)使嵌合型寡核苷酸与连接产物杂交以形成第三杂交体；vi)在聚合试剂与核苷酸前体存在下，使用连接产物作为模板来延伸该第三杂交体的嵌合型寡核苷酸，从而形成第一延伸产物；Vh)使第二协作性寡核苷酸与该第一延伸产物杂交以形成第四杂交体，和viii)在聚合试剂与核苷酸前体存在下，使用该第一延伸产物作为模板来延伸该第四杂交体的第二协作性寡核苷酸，从而形成包含第一延伸产物和与该第一延伸产物互补的第二延伸产物的反应产物。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸处理反应是连接酶依赖性核酸处理反应。9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其包括1.使嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列与靶核酸序列的第一子序列杂交以形成第一杂交体，其中该嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补；2.使第一协作性寡核苷酸的第二靶向序列与该耙核酸序列的第二子序列杂交形成第二杂交体，其中该第二子序列毗连该第一子序列；3.在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该嵌合型寡核苷酸与该第一协作性寡核苷酸，形成第一双链体，所述第一双链体包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及同时包含该嵌合型寡核苷酸和该第一协作性寡核苷酸的连接产物；4.使该第一双链体变性以从靶核酸释放连接产物；和5.使第二协作性寡核苷酸与该连接产物的嵌合型寡核苷酸和第一协作性序列部分杂交以形成反应产物。10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括a.使第一嵌合型寡核苷酸的第一靶向序列与靶核酸序列的第一子序列杂交以形成第一杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸的3'寡核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补，并且可捕捉序列的5'核苷酸不可连接；b.使第二嵌合型寡核苷酸的第二靶向序列与耙核酸序列中毗连该第一子序列的第二子序列杂交以形成第二杂交体，其中可捕捉序列的5'核苷酸不可连接；c.在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该第一嵌合型寡核苷酸与该第二嵌合型寡核苷酸以形成第一双链体，该第一双链体包含该耙核酸序列的第-和第二子序列及同时包含该第一嵌合型寡核苷酸和该第二嵌合型寡核苷酸的连接产物；d.使该第一双链体变性以从靶核酸释放连接产物；和e.使协作性寡核苷酸与该连接产物的第一和第二嵌合型寡核苷酸杂交以形成反应产物。11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其包括i.使第一嵌合型寡核苷酸的第一耙向序列与耙核酸序列的第一子序列杂交形成第一杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸包含能与捕捉寡核苷酸杂交的可捕捉序列，并且该第一嵌合型寡核苷酸的3'核苷酸与该第一子序列的5'核苷酸互补；ii.使第二嵌合型寡核苷酸的第二耙向序列与耙核酸序列中毗连该第一子序列的第二子序列杂交形成第二杂交体，其中该第一嵌合型寡核苷酸包含能与信号寡核苷酸杂交的可捕捉序列；iii.在该第一子序列的5'核苷酸和连接试剂存在下，连接该第一嵌合型寡核苷酸与该第二嵌合型寡核苷酸以形成第一双链体，该第一双链体包含该靶核酸序列的第一和第二子序列及同时包含该第一嵌合型寡核苷酸和该第二嵌合型寡核苷酸的反应产物；和iv.使该第一双链体变性以从靶核酸释放反应产物。12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，步骤l-5或a-e或i-iv重复一次或多次。13.—种试剂盒，其装有(1)不与靶核酸序列杂交的捕捉寡核苷酸(例如，固定的或游离于溶液中)；(2)提供可检测信号并与捕捉寡核苷酸杂交的信号寡核苷酸；(3)至少一种嵌合型寡核苷酸，其包含(a)与靶核酸序列的子序列杂交的第一靶向序列；和(b)与选自以下的序列杂交的可捕捉序列(i)捕捉寡核苷酸；或(ii)信号寡核苷酸(4)包含第二靶向序列的至少一种协作性寡核苷酸，所述第二靶向序列与选自以下的序列杂交(a)靶核酸序列中与所述第一靶向序列杂交的子序列不同的子序列；或(b)耙核酸序列的互补链的子序列，或(C)至少一种嵌合型寡核苷酸。14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，其还装有(5)—种或多种聚合试剂和/或连接试剂。15.如权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于，组分(l)-(5)中的任一种或多种采用冻干形式。16.如权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于，组分(l)-(5)中的任两种或多种采用混合物形式。17.如权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于，组分(l)-(5)中的任两种或多种装在不同容器中。18.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在固体表面上。19.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在微粒或珠的表面。20.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在纳米线的表面。21.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述捕捉寡核苷酸固定在反应容器的表面。22.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，多个捕捉寡核苷酸以捕捉寡核苷酸阵列形式固定。23.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述阵列是固相阵列。24.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述阵列是液相阵列。25.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，在反应容器中提供组分(l)-(5)中的任一种或多种。26.如权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，所述组分以预先优化以用来实施权利要求1-12中任一项所述的方法的形式存在。27.如权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，最终用户向反应容器中加入核酸样品、核酸处理酶、嵌合型寡核苷酸和协作性寡核苷酸中的至少一种来全文摘要本发明披露了用寡核苷酸测定靶核酸序列存在的方法，所述寡核苷酸与核酸处理反应相配合从而产生可检测信号。在一些实施方式中，这些方法还有助于定量测定靶核酸序列。本发明还披露可用于实施本发明方法的试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101248191SQ200680030935公开日2008年8月20日申请日期2006年7月6日优先权日2005年7月6日发明者G·R·巴尼特,R·T·巴纳德申请人:生物芯片创新控股有限公司