色氨酸转运蛋白基因及其用途的制作方法

专利名称：色氨酸转运蛋白基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及色氨酸转运蛋白基因及其用途，特别是涉及控制色氨酸同化能 力的酿造酵母、用该酵母制造的酒类、其制造方法等。更具体而言，本发明涉及通过控制酿造酵母的编码色氨酸转运蛋白Tat2p的基因TAT2、特别是啤酒酵 母的特征性nonScTAT2基因的表达量来控制色氨酸同化能力的酵母，以及使用 该酵母的酒类的制造方法等。
背景技术：
众所周知，氨基酸是酒类的重要呈味成分，是左右品质的重要因素。因此， 结合要达到的酒质来控制氨基酸的量，在新品种开发中非常重要。但是，由于氨基酸在发酵中作为氮源被酵母同化，因而难以控制发酵结束 时的氨基酸的含量。酵母为了将细胞外的氨基酸作为氮源利用，必须将氨基酸摄入菌体内。已 知酵母的细胞膜中存在的氨基酸转运蛋白参与此种氨基酸的摄取。作为酵母的氨基酸转运蛋白，已知有底物特异性低的Gapl、底物特异性不 同的多种氨基酸转运蛋白(色氨酸转运蛋白TAT2、精氨酸转运蛋白Canl、脯氨 酸转运蛋白Put4等(Mol Cell Biol. 14: 6597-6606， 1994、 Curr Genet 36: 317-328， 1999))。迄今为止，已报道了以下实例，为控制酒类中的氨基酸含量，使用与氨基 酸摄取有关的基因(gapl， shr3， canl， put4， uga4)发生突变的酵母(日本 特开2001-321159号公报)，以及使支链氨基酸转运蛋白BAP2高表达的例子(日 本特开2000-316559号公报)。发明内容鉴于上述情况，为了改变酒中的氨基酸组成，制造具有特殊品质的酒类， 期望得到氨基酸的同化能力受到控制的酵母。本发明者为了解决上述课题进行了潜心研究，结果从啤酒酵母中成功地鉴 定并分离出编码比已知蛋白质更有效的色氨酸转运蛋白的基因。另外，制作了 将得到的基因导入酵母并使其表达的转化酵母，证实能控制色氨酸的同化能力， 从而完成了本发明。艮口，本发明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型色氨酸转运蛋白基因、该基 因编码的蛋白质、该基因的表达得到调节的转化酵母、通过使用该基因的表达 得到调节的酵母来制造酒类的方法等。具体而言，本发明提供如下所示的多核 苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的 酒类的制造方法等。(1) 多核苷酸，其选自由下述(a) (f)组成的组，(a) 多核苷酸，其含有由序列号l的碱基序列组成的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；(c) 多核苷酸，其含有编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插 入和/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成且具有色氨酸转运蛋白活性 的蛋白质的多核苷酸；(d) 多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有60%以上同一 性的氨基酸序列且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；(e) 多核苷酸，其含有与由序列号l的碱基序列的互补碱基序列组成的多 核苷酸在严谨条件下杂交且编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷 酸；以及(f) 多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多 核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交且编码 具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。(2) 上述(1)所述的多核苷酸，其是选自由下述(g) (i)组成的组，(g) 多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列或由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加i io个氨基酸后的氨基酸序列组成且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；(h) 多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有90%以上同一 性的氨基酸序列且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；以及(i) 多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或含有与序列号1的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交且 编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。(3) 上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。(4) 上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组 成的蛋白质的多核苷酸。(5) 上述(1) (4)任一项所述的多核苷酸，其是DNA。(6) 多核苷酸，其是选自由下述(j) (m)组成的组，(j)多核苷酸，其编码具有与上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产 物互补的碱基序列的RNA;(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 表达的RNA;(1)多核苷酸，其编码具有特异性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 的转录产物活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 表达的RNA。(7) 蛋白质，其是由上述(1) (5)任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。(8) 载体，其是含有上述(1) (5)任一项所述的多核苷酸的载体。 (8a)上述(7)所述的载体，其含有包含以下(x) (z)的构成要素的表达盒(x)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向连接的上述(1) (5)任一项所述的多核(z)与RNA分子的转录终止以及多腺苷酸化作用有关的在酵母起作用的信号。(9) 载体，其是含有上述(6)所述的多核苷酸的载体。(10) 酵母，其是导入了上述(8)或(9)所述的载体的酵母。(11) 上述(10)所述的酵母，其通过导入上述(8)所述的载体，增强色 氨酸的同化能力。(12) 酵母，其通过导入上述(9)所述的载体，或通过破坏与上述(5) 所述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的 表达。(13) 上述(11)所述的酵母，其通过增加上述(7)所述的蛋白质的表达量，提高色氨酸的同化能力。(14) 酒类的制造方法，其使用上述(10) (13)任一项所述的酵母。(15) 上述(14)所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。(16) 上述(14)所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。(17) 酒类，其是使用上述(14) (16)任一项所述的方法制造的酒类。(18) 评价方法，其用根据具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因 的碱基序列设计的引物或探针，评价被测酵母的色氨酸同化能力。(18a)通过上述(18)所述的方法来筛选色氨酸同化能力高或低的酵母的方法。(18b)用通过上述(18a)所述的方法筛选的酵母来制造酒类(例如啤酒) 的方法。(19) 评价方法，其通过培养被测酵母，测定具有序列号1碱基序列的色 氨酸转运蛋白基因的表达量，来评价被测酵母的色氨酸同化能力。(20) 酵母的选择方法，其培养被测酵母，对上述(7)所述的蛋白质进行 定量或测定具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因的表达量，选择具有 与目的色氨酸同化能力相应的上述蛋白质的生成量或上述基因的表达量的被测 酵母。(20a)酵母的选择方法，其培养被测酵母，测定色氨酸同化能力，选择具有目的色氨酸同化能力的被测酵母。(21) 上述(20)所述的酵母的选择方法，其培养标准酵母和被测酵母， 测定具有序列号1的碱基序列的色氨酸转运蛋白基因在各酵母中的表达量，选 择与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被测酵母。(22) 上述(20)所述的酵母的选择方法，其培养标准酵母和被测酵母， 对各酵母中上述(7)所述的蛋白质进行定量，选择与标准酵母相比该蛋白质的 量多或少的被测酵母。即，上述(20)所述的酵母的选择方法，其培养多种酵 母，对各酵母中的上述(7)所述的蛋白质进行定量，从中选择该蛋白质的量多 或少的被测酵母。(23) 酒类的制造方法，其特征在于，用上述(10) (13)所述的酵母 以及通过上述(20) (22)所述的方法选择的酵母中的任一酵母进行以酒类 制造为目的的发酵，调节色氨酸含量。根据使用本发明的转化酵母的酒类制造方法，由于色氨酸的同化得到促进， 从而可以改变酒中的氨基酸组成，能制造具有特征品质的酒类。


图1表示啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时间， 纵坐标表示0D660值。图2表示啤酒试验酿造中浸出物消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间， 纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w%)。图3表示啤酒试验酿造中酵母中的nonScTAT2基因的表达行为。横坐标表 示发酵时间，纵坐标表示检测到的信号辉度。图4表示啤酒试验酿造中酵母增殖量的经时变化。横坐标表示发酵时间， 纵坐标表示0D660值。图5表示啤酒试验酿造中浸出物消耗量的经时变化。横坐标表示发酵时间， 纵坐标表示浸出物表观浓度(w/w%)。
具体实施方式
本发明者认为通过调节酵母的色氨酸转运蛋白的活性，能控制色氨酸的同化。基于这种构想不断研究，根据用日本特开2004-283169中公开的方法解读 的啤酒酵母基因组信息，分离并鉴定出啤酒酵母特有的编码色氨酸转运蛋白的 non-ScTAT2基因。该碱基序列如序列号1所示。另外，由该基因编码的蛋白质 的氯基酸序列如序列号2所示。 l.本发明的多核苷酸首先，本发明提供(a)多核苷酸，其含有由序列号l的碱基序列组成的多核 苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的 多核苷酸。多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA。作为本发明对象的多核苷酸，不限于来自上述啤酒酵母的编码色氨酸转运 蛋白的多核苷酸，还包含编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷 酸。作为功能同等的蛋白质，例如，可列举(c)由在序列号2的氨基酸序列中缺 失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成且具有色氨 酸转运蛋白活性的蛋白质。作为此种蛋白质，可列举由序列号2的氨基酸序列 中缺失、取代、插入和/或添加例如1 100个、1 90个、1 80个、1 70个、 1 60个、1 50个、1 40个、1 39个、1 38个、1 37个、1 36个、l 35个、1 34个、1 33个、1 32个、1 31个、1 30个、1 29个、1 28 个、1 27个、1 26个、1 25个、1 24个、1 23个、1 22个、1 21个、 1 20个、1 19个、1 18个、1 17个、1 16个、1 15个、1 14个、l 13个、1 12个、1 11个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个(1 数个)、1 5个、1 4个、1 3个、1 2个、1个氨基酸残基后的氨基酸序列 组成且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插 入和/或添加的数量， 一般越小越好。另外，作为此种蛋白质，可列举(d)具有 与序列号2的氨基酸序列有约60%以上、约70%以上、71%以上、72%以上、73% 以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、 81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以 上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4% 以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99.9%以上同一性的氮 基酸序列且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质。上述同源性的数值一般越大越 好色氨酸转运蛋白活性，另外，对于色氨酸转运蛋白的活性，可采用例如(Mol Cell Biol. 14: 6597-6606， 1994)中记载的方法来进行测定。本发明也包含(e)多核苷酸，其含有与序列号1的碱基序列的互补碱基序 列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交且编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质 的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码序列号2的氨基酸序列组成的蛋 白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交且 编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。这里，"在严谨条件下杂交的多核苷酸"，指以序列号1碱基序列的互补碱 基序列组成的多核苷酸或编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部 分为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多 核苷酸(例如DNA)。作为杂交的方法，可以利用例如Molecular Cloning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等 中记载的方法。本说明书中所述的"严谨条件"可以是低严谨条件、中严谨条件以及高严 谨条件中的任一种。"低严谨条件"，例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5%SDS、 50%甲酰胺、32。C的条件。"中严谨条件"，例如为5XSSC、 5XDenhardt溶液、 0. 5%SDS、 50%甲酰胺、42。C的条件。"高严谨条件"，例如为5XSSC、 5XDenhardt 溶液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、5(TC的条件。上述条件中，温度越高，越能高效 地获得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。但是，影响杂交严谨性的因素有 温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技 术人员可通过适当选择这些因素来实现同样的严谨性。在杂交中使用市售的试剂盒时，例如可使用Alkphos Direct Labelling Reagents [Amersham Pharmacia公司制]。此时，根据试剂盒中附带的操作方法 (protocol),与已标记的探针一同保温过夜后，将膜在55'C的条件下用含有0. 1%(W/V)SDS的1次洗涤缓冲液洗涤后，可检测出杂交后的多核苷酸(例如DNA)。作为此外可杂交的多核苷酸，可列举通过FASTA、 BLAST等同源性检索软件， 使用默认参数计算时，与编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸具有约60%以上、 约70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76°/。以上、77% 以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、 85°/。以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以 上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1% 以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以 上、99.8%以上、99.9%以上同一性的多核苷酸。关于氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据Karlin及Altschul的 BLAST算法(proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268， 1990; proc Natl Acad Sci USA 90: 5873， 1993)决定。开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX 的程序(Altschul SF， et al: J Mol Biol 215: 403， 1990)。用BLASTN分 析碱基序列时，参数例如为score二100、 wordlength二12。用BLASTX分析氨基 酸序列时，参数例如为score = 50、 wordlength二3。使用BLAST和Ga卯ed BLAST 程序时，使用各程序的默认参数。此外，本发明的多核苷酸包含(j)多核苷酸，其编码具有与上述(5)所述 的多核苷酸(DNA)的转录产物互补的碱基序列的RNA; (k)多核苷酸，其编码通 过RNAi作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)表达的RNA; (l)多核苷酸， 其编码具有特异性切割上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的转录产物活性的RNA; 以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA) 表达的RNA。这些多核苷酸被整合进载体，进而可在导入了该载体的转化细胞中 抑制上述(a) (i)的多核苷酸(DNA)的表达。因此，可在希望抑制上述多核苷 酸(DNA)表达的情况下优选利用。本说明书中，"编码具有与DNA的转录产物互补的碱基序列的RNA的多核苷 酸"，指所谓的反义DNA。反义技术作为抑制特定内源性基因的表达的方法而公 知，各种文献中均有记载[例如，参照平岛及井上新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达(日本生化学会编，东京化学同人)pp. 319-347， 1993等。 日语原文「平島招上W井上新生化学実験講座2核酸IV遺伝子(Z)複製i発 現(日本生化学会編，東京化学同人)」]。反义DNA的序列，优选为与内源性 基因或其一部分互补的序列，但只要能有效地抑制基因的表达，也可以不完全 互补。转录的RNA相对于靶基因的转录产物优选具有90X以上、进一步优选具 有95%以上的互补性。反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱 基以上，进一步优选为500个碱基以上。本说明书中，"编码通过RNAi作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸"，指用 于通过RNA干扰(RNAi)抑制内源性基因表达的多核苷酸。"RNAi"指将具有与 耙基因序列同一或类似序列的双链RNA导入细胞内，导入的外源基因及内源性 靶基因的表达均受到抑制的现象。这里使用的RNA，可列举例如21 25个碱基 长的产生RNA干涉的双链RNA，例如，dsRNA (双链RNA) 、 siRNA(小干扰RNA) 或shRNA(短发夹RNA)。此种RNA可通过脂质体等运载系统局部运载至所需位点， 也可以使用生成上述双链RNA的载体使其局部表达。此种双链RNA(dsRNA、 siRNA 或shRNA)的制备方法、使用方法等已在许多文献中公开(参照日本特表 2002-516062号公报；美国公开专利第2002/086356A号；Nature Genetics, 24(2)， 180-183， 2000 Feb. ; Genesis, 26(4), 240-244， 2000 April; Nature,407:6802，319-20，2002S印.21 ;Genes & Dev., Vol. 16， (8)，948-958， 2002 Apr. 15;Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ， 99(8)， 5515-5520， 2002 Apr. 16; Science, 296(5567)， 550-553， 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9， 6047-6052， 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5)， 497-500， 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5)， 500-505， 2002 May; Nucleic Acids Res. ， 30:10， e46, 2002 May 15 等)。本说明书中，"编码具有特异性切割DNA转录产物活性的RNA的多核苷酸" 一般指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通过切割靶DNA的转录产物， 阻断该基因的功能。关于核酶的设计，可参照各种公知文献(例如参照FEBS Lett. 228: 228， 1988; FEBS Lett, 239: 285， 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059，1989; Nature 323: 349， 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733， 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875， 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125， 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271， 1992等)。另外， "编码通过共抑制作用抑制DNA表达的RNA的多核苷酸"，指通过"共抑制"阻 断靶DNA的功能的核苷酸。本说明书中，"共抑制"是指通过在细胞中由转化导入具有与内源性靶基因 同一或类似序列的基因，从而使导入的外源基因及内源性靶基因的表达均受到 抑制的现象。关于具有共抑制作用的多核苷酸的设计，可参照各种公知文献(例 如，参照Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793， 1997， Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810， 1996等)。2.本发明的蛋白质本发明还提供由上述多核苷酸(a) (i)中任一多核苷酸编码的蛋白质。本 发明的优选蛋白质，是由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或 添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白 质。作为此种蛋白质，可列举由在序列号2的氨基酸序列缺失、取代、插入和 /或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有色氨酸转运蛋白 活性的蛋白质。此种蛋白质，还可以列举具有与序列号2的氨基酸序列有上述 同源性的氨基酸序列，且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质。这类蛋白质可用《分子克隆第3版》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc. Acids. Res. ， 10, 6487 (1982) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79， 6409 (1982) ，，、 "Gene, 34， 315 (1985) " 、 "Nuc. Acids. Res., 13， 4431 (1985)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82， 488 (1985)"等中记载的 定点诱变法获得。本发明的蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个以上的 氨基酸残基，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列的位置上缺失、 取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸残基，缺失、取代、插入及添加中的2 种以上也可同时发生。以下，例示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互 取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2 — 氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2—氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2， 4一二氨基丁酸、2， 3—二氨基丙酸；E组脯氨酸、3—羟基脯氨酸、4一羟基 脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。本发明的蛋白质也可以用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等化学合成法来制造。另外，还可以利用Advanced ChemTech公司、Perkin Elmer 公司、Pharmacia 公司、Protein Technology Instruments 公司、 Synthecell-Vega公司、PerS印tive公司、岛津制作所公司等制造的肽合成仪 进行化学合成。3.本发明的载体及导入了该载体的转化酵母其次，本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体含有上述(a) (i)任一项所述的多核苷酸(DNA)。本发明的载体通常如下组成，其含有包含(x) 在酵母细胞内可转录的启动子；(y)与该启动子以正向或反向连接的上述(a) (i)任一项所述的多核苷酸(DNA);以及(z)与RNA分子的转录终止及多腺苷酸 化作用有关的在酵母中起作用的信号作为构成要素的表达盒。本发明中，在后 述的啤酒酿造中，使上述本发明的蛋白质高表达时，将这些多核苷酸针相对该 启动子正向导入，以促进上述(a) (i)任一项所述的多核苷酸(DNA)的表达。 另外，在后述的啤酒酿造中，抑制上述本发明的蛋白质表达时，将这些多核苷 酸针相对该启动子反向导入，以抑制上述(a) (i)任一项所述的多核苷酸(DNA) 的表达。抑制上述本发明的蛋白质表达时，也可在载体中可表达地导入上述 (j) (m)任一项所述的多核苷酸。且在本发明中，通过破坏上述靶基因(DNA)， 可抑制上述多核苷酸(DNA)的表达或上述蛋白质的表达。基因的破坏，可通过 向参与耙基因的基因产物表达的区域，例如编码区域、启动子区域的内部添加 或缺失一个或多个碱基，或使这些区域整体缺失来进行。这种基因破坏的方法， 可参照公知的文献(例如，参照Proc. Natl. Acad. Sci.USA， 76， 4951 (1979)、Methods in Enzymology， 101， 202(1983)、日本特开平6-253826号公报等)。作为导入酵母时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp 型)、染色体整合型(Yip型)中的任一种。例如，作为YEp型载体，已知有YEp24 (J. R. Broach et al. ， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983)，作为YCp型载体，已知有YCp50(M. D. Roseetal. ， gene， 60， 237， 1987)，作为Yip型载体，已知有YIp5 (K. Struhl et al.， Proc.Natl.Acad. Sci. USP， 76, 1035,1979)，并可容易地获得。作为用以调节酵母中基因表达的启动子/终止子，如能在酿造用酵母中起 作用，同时又不受醪液中的成分的影响，可以是任意的组合。例如，可利用甘 油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3 —磷酸甘油酸激酶基因(PGK1) 的启动子等。这些基因已被克隆，例如在M. F. Tuite et al. ， EMB0 J.， 1， 603(1982)中有详细记载，通过已知的方法即可容易地获得。作为转化时使用的选择性标记，由于酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记， 所以可利用遗传霉素抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUPl)(Marinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81， 337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m， PDR4)(分 别为猪腰淳嗣等，生化学，64， 660， 1992; Hussain et et al. ， gene， 101， 149， 1991。日语原文「猪腰淳嗣b、生化学，64， 660， 1992; Hussain et et al. , gene， 101， 149， 1991」)等。如上所述构建的载体被导入宿主酵母。作为宿主酵母，可列举能用于酿造 的任意酵母，例如用于酿造啤酒、葡萄酒、清酒等的酵母等。具体可列举酵母 属(Saccharomyces)等的酵母，但在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德 酵母(Sacchaxomyces pastorianus) W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951 、 NBRC1952 、 NBRC1953、 NBRC1954等。此外，还可以使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如协会的1号、3号、和4号等葡萄酒 酵母；清酒酵母，例如协会的用于清酒的7号、和9号酵母等，但不限于此。 本发明优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母。作为酵母的转化方法，可利用常用的公知方法。例如，可使用电穿孔法"Meth.Enzym. ， 194， pl82(1990)"、原生质球法"Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75 pl929(1978)"、醋酸锂法"J. Bacteriology, 153， pl63(1983)"、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) 、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中i己载的方》去，f旦不限于 此。更具体而言，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(例如YEPD培养基 "Genetic Engineering. Vol, 1， Plenum Press, New York, 117(1979)"等) 中培养至OD600nm的值为1 6。将此培养酵母离心分离并收集、洗涤，用浓度 约为1 2M的碱金属离子、优选锂离子进行预处理。将此细胞在约3(TC下静置 约60分钟后，与将导入的DNA (约l 20u g) —同在约3(TC下静置约60分钟。 加入聚乙二醇，优选加入约4， 000道尔顿的聚乙二醇，使最终浓度为约20% 50%。 在约3(TC下，静置约30分钟后，将此细胞在约42"C下加热处理约5分钟。优 选将此细胞悬浮液用标准酵母营养培养基洗涤，置于规定量的新鲜标准酵母营 养培养基中，在约3(TC下静置约60分钟。之后，移植到含有作为选择性标记使 用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。此外，关于一般性的克隆技术，可参照《分子克隆第3版》、"Methods in Yeast Genitics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, NY)"等。4.本发明的酒类的制造方法及通过该制造方法制得的酒类将上述本发明的载体导入适合酿造所需酒类的酵母中，通过使用该酵母， 可制造在氨基酸的组成上具有特点的酒类。另外，也可同样使用通过下述本发 明的酵母评价方法选择的酵母。作为制造对象的酒类，例如可列举啤酒、发泡 酒等的啤酒味饮料、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于此。另外，在本发 明中，根据需要，通过使用靶基因的表达受到抑制的酿造酵母，也可以制造所 需的且色氨酸含量降低的酒类。即，通过使用上述导入了本发明的载体的酵母、 上述本发明的多核苷酸(DNA)的表达受到抑制的酵母或下述用本发明的酵母评 价方法选择的酵母，进行以酒类制造为目的的发酵，调节(增加或减少)色氨 酸的生成量，可以制造所需的且色氨酸含量得到调节(增加或减少)的酒类。制造这些酒类时，除了使用本发明中得到的酿造酵母代替亲株外，可利用 公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往方法完全相同，不 会因制造发酵期縮短的酒类而增加成本。gP，本发明可在使用已有设施、不增 加成本的情况下进行制造。5.本发明的酵母的评价方法本发明涉及用根据具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因的碱基序 列设计的引物或探针来评价被测酵母的色氨酸同化能力的方法。这种评价方法的一般方法是公知的，例如，在W 0 01 / 040514号公报、日本特开平8—205900 号公报等中有记载。下面，对该评价方法进行简单说明。首先，制备被测酵母的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等 公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)]。以得到的基因组为对象，用根据色氨酸转 运蛋白基因的碱基序列(优选0RF序列)设计的引物或探针，分析被测酵母的 基因组中是否存在其基因或其基因的特异性序列。引物或探针的设计可用公知 的方法来进行。基因或特异性序列的检测可使用公知的方法来进行。例如，将含有特异性 序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸 作为一个引物使用，另一引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分或全 部的多核苷酸或含有其碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，通过PCR法扩增 酵母的核酸，测定扩增物的有无、扩增物的分子量大小等。用于引物的多核苷 酸的碱基数通常为10bp以上，优选为15 25bp。且夹在两引物间部分的碱基数 通常以300 2000bp为宜。PCR法的反应条件不受特别限定，例如，可使用变性温度90 95°C，退火 温度40 60°C，延伸温度60 75°C，循环数10次以上等条件。所得反应 生成物可通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，并测定扩增产物的分子 量。通过该方法，根据扩增产物的分子量是否是含有特异部分的DNA分子的大 小，来预测和评价该酵母的色氨酸同化能力。且通过分析扩增物的碱基序列， 可进一步更加正确地预测和评价上述性能。本发明也可以通过培养被测酵母，测定具有序列号1的碱基序列的色氨酸 转运蛋白基因的表达量，评价被测酵母的色氨酸同化能力。另外，通过培养被测酵母，对色氨酸转运蛋白基因的转录产物mRNA或蛋白质进行定量，可以测定 色氨酸转运蛋白基因的表达量。mRNA或蛋白质的定量可用公知的方法来进行。 mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量， 例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。另外，通过测定培养被测酵母时得到的发酵 液中的色氨酸浓度，也可预测该被测酵母中上述基因的表达量。而且，通过培养被测酵母，测定具有序列号1的碱基序列的色氨酸转运蛋 白基因的表达量，选择与目的色氨酸同化能力相应的上述基因表达量的酵母， 可选择出适于酿造所需酒类的酵母。另外，也可以培养标准酵母及被测酵母， 测定各酵母中上述基因表达量，比较标准酵母和被测酵母的,上述基因表达量， 从而选择出所需的酵母。具体而言，例如可通过培养标准酵母及被测酵母，测 定具有序列号1的碱基序列的色氨酸转运蛋白基因在各酵母中的表达量，选择 与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被测酵母株，从而选择出适于酿造 所需酒类的酵母。或者，可以通过培养被测酵母，选择色氨酸同化能力高或低的酵母，从而 选择出适于酿造所需酒类的被测酵母。上述情况下，作为被测酵母或标准酵母，例如可使用上述导入了本发明的 载体的酵母、实施了突变处理的酵母、发生了自发突变的酵母等。关于色氨酸 同化能力的评价，例如，可通过用氨基酸分析仪(例如，L-8800高速氨基酸分 析仪；日立公司制)、标准氨基酸分析柱(P/N855-3506;日立制作所公司制) 分析发酵结束后的啤酒的氨基酸组成，评价氨基酸组成中的色氨酸浓度来进行。 突变处理，例如可使用紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙 酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等试剂处理的化学方法等任何方法(例如，参照大嶋 泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67_75、学会出版中 心等。日语原文「大嶋泰治編著、生物化学実験法39、酵母分子遺伝学実験法、 p67-75、学会出版ir乂夕一」)。关于可作为标准酵母、被测酵母使用的酵母，可列举能用于酿造的任意酵 母，例如适用于酿造啤酒、葡萄酒、清酒等的酵母等。具体可列举酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母 (Sacchaxomyces pastorianus) W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453 、 NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951 、 NBRC1952 、 NBRC1953、 NBRC1954等。此外，也可以使用威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；葡萄酒酵母，例如协会的1号、3号、和4号等葡萄酒 酵母；清酒酵母，例如协会的7号、和9号等清酒酵母，但不限于此。本发明 优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母。标准酵母、被测酵母可从上述酵母组中 以任意组合选择。 实施例下面，通过实施例详细说明本发明的内容，但本发明不限于以下的实施例。 实施例l:新型色氨酸转运蛋白基因(nonScTAT2)的克隆用日本特开2004-283169中记载的比较数据库检索后，结果发现了啤酒酵 母特有的新型色氨酸转运蛋白基因、nonScTAT2 (序列号1)。根据得到的碱基序 列信息，分别设计用于扩增全长基因的引物nonSCTAT2_F (序列号3) /腦ScTAT2—R (序列号4)，以基因组解读株Saccharomyces pastorianus Weihenst印han 34/70株的染色体DNA为模板进行PCR，获得含有nonScTAT2全 长基因的DNA片段。将按上述操作得到的nonScTAT2基因片段，通过TA克隆插入pCR2. 1-T0P0 载体[Invitrogen公司制]。用Sanger法(F. Sanger, Science, 214， 1215， 1981)分析nonScTAT2基因的碱基序列，并证实了碱基序列。 实施例2:啤酒试酿中的nonScTAT2基因表达分析用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株进行啤酒试酿，将从发 酵中的啤酒酵母菌体中提取的m固A用啤酒酵母DNA微阵列进行检测。麦芽汁浸出物浓度 12.69%麦芽汁体积 70L麦芽汁中溶解氧浓度 8.6Ppm发酵温度 15°C酵母添加量 12. 8 X 106细胞/mL对发酵液进行经时采样，观察酵母增殖量(图1)、浸出物表观浓度(图2) 的经时变化。与此同时，对酵母菌体进行采样，将制备好的mRNA用生物素标记， 使其与日本特开2004-283169中记载的啤酒酵母DNA微阵列杂交。用基因芯片 操作系统(GC0S; GeneChip Operating Software 1.0， Affymetrix公司制)进 行信号检测。nonScTAT2基因的表达模式如图3所示。 结果证实nonScTAT2基因在一般的啤酒发酵中表达。 实施例3: nonScTAT2基因的高表达株的制备将实施例1中所述的nonScTAT2/pCR2. 1-T0P0用限制酶Sacl及Notl酶解， 制备含有蛋白质编码区域全长的DNA片段。将该片段与经限制酶Sacl及Notl 处理的pYCGPYNot连接，构建nonScTAT2高表达载体nonScTAT2/pYCGPYNot。 pYCGPYNot是YCp型的酵母表达载体，导入的基因在丙酮酸激酶基因PYK1的启 动子的控制下高表达。作为酵母中的选择性标记，包含遗传霉素抗性基因G418、 作为大肠杆菌中的选择性标记，包含氨苄青霉素抗性基因Ampr。使用通过上述方法制作的高表达载体，用日本特开平07-303475中记载的 方法，转化Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70株。用含有 300mg/L遗传霉素的YPD平板培养基(1%酵母浸出物、2%多聚蛋白胨、2%葡萄糖、 2%琼脂)选择转化体。实施例4:啤酒试验酿造中氨基酸同化量的测定在下述条件下，用亲株和实施例3中获得的nonScTAT2高表达株进行发酵 试验。麦芽汁浸出物浓度 12%麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约7ppm发酵温度 12"C恒定酵母添加量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(0D660)(图4)、浸出物消耗量(图5)的经时变化。进而用L-8800高速氨基酸分析仪(日立公司制)以及 标准氨基酸分析柱P/N855-3506 (日立制作所公司制)测定发酵结束后的啤酒的 氨基酸组成，结果如表1所示，用nonScTAT2高表达株制造的啤酒的氨基酸组 成与用亲株制造的啤酒相比，色氨酸减少，呈现出不同的特征。 表l氨基酸量(mM)亲株nonScTAT2高表达株色氨酸0.18430. 1135实施例5: nonScTAT2基因的破坏按照文献(Goldstein et al. ， yeast. 15 1541 (1999))的方法，以含有 抗药性标记的质粒(pFA6a (G418r)， pAG25 (natl) ， pAG32 (hph))为模板进 行PCR，制备用于破坏基因的片段。用所制备的用于破坏基因的片段转化W34/70株或孢子克隆W34/70-2株。 转化采用日本特开平07-303475中记载的方法进行，选择试剂的浓度分别为遗 传霉素300mg/L，诺尔丝菌素50 mg/L。 实施例6:啤酒试验酿造中氨基酸同化量的测定在下述条件下，用亲株及实施例5中获得的nonScTAT2破坏株进行发酵试验。麦芽汁浸出物浓度 12%麦芽汁体积 1L麦芽汁中溶解氧浓度 约7ppm发酵温度 12t:恒定酵母添加量 5g湿酵母菌体/L麦芽汁对发酵醪液进行经时采样，分析酵母增殖量(0D660)、浸出物消耗量的经 时变化。进而用L-8800高速氨基酸分析仪(日立公司制)以及标准氨基酸分析 柱P/N855-3506 (日立制作所公司制)测定发酵结束后啤酒的氨基酸组成，并测 定氨基酸同化量。根据本发明的酒类制造方法，由于可以控制酵母的色氨酸同化能力，从而 可以调节色氨酸含量，制造在氨基酸组成上有特点的酒类。
权利要求
1. 多核苷酸，其选自由下述(a)～(f)组成的组，(a)多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸；(c)多核苷酸，其含有编码由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列组成且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；(d)多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有60％以上同一性的氨基酸序列且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；(e)多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交且编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交且编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。
2. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其选自由下述(g) (i)组成的组，(g) 多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列或由在序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加i io个氨基酸后的氨基酸序列组成且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；(h) 多核苷酸，其含有编码具有与序列号2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列且具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸；以及(i) 多核苷酸，其含有由序列号l的碱基序列组成的多核苷酸、或含有与 序列号1的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交且 编码具有色氨酸转运蛋白活性的蛋白质的多核苷酸。
3. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的 多核苷酸。
4. 根据权利要求1所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
5. 根据权利要求1 4任一项所述的多核苷酸，其是DNA。
6. 多核苷酸，其选自由下述(j) (m)组成的组，(j)多核苷酸，其编码具有与权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的转录 产物互补的碱基序列的RNA;(k)多核苷酸，其编码通过RNAi作用抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA) 表达的RNA;(1)多核苷酸，其编码具有特异性切割权利要求5所述的多核苷酸(DNA) 的转录产物活性的RNA;以及(m)多核苷酸，其编码通过共抑制作用抑制权利要求5所述的多核苷酸 (DNA)表达的RNA。
7. 蛋白质，其是由权利要求1 5任一项所述的多核苷酸所编码的蛋白质。
8. 载体，其是含有权利要求1 5任一项所述的多核苷酸的载体。
9. 载体，其是含有权利要求6所述的多核苷酸的载体。
10. 酵母，其是导入了权利要求8或9所述的载体的酵母。
11. 根据权利要求10所述的酵母，其通过导入权利要求8所述的载体，提 高色氨酸同化能力。
12. 酵母，其通过导入权利要求9所述的载体，或通过破坏与权利要求5所 述的多核苷酸(DNA)相关的基因，抑制权利要求5所述的多核苷酸(DNA)的 表达。
13. 根据权利要求11所述的酿造用酵母，其通过增加权利要求7所述的蛋 白质的表达量，提高色氨酸同化能力。
14. 酒类的制造方法，其使用权利要求10 13任一项所述的酵母。
15. 根据权利要求14所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是麦芽饮料。
16. 根据权利要求14所述的酒类的制造方法，其酿造的酒类是葡萄酒。
17. 酒类，其是用权利要求14 16任一项所述的方法制造的酒类。
18. 评价方法，其用根据具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因的碱 基序列设计的引物或探针，评价被测酵母的色氨酸同化能力。
19. 评价方法，其通过培养被测酵母，测定具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因的表达量，来评价被测酵母的色氨酸同化能力。
20. 酵母的选择方法，其培养被测酵母，对权利要求7所述的蛋白质进行定 量或测定具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因的表达量，选择具有与 目的色氨酸同化能力相应的所述蛋白质的生成量或所述基因的表达量的被测酵 母。
21. 根据权利要求20所述的酵母的选择方法，其培养标准酵母和被测酵母，测定具有序列号1碱基序列的色氨酸转运蛋白基因在各酵母中的表达量，选择 与标准酵母相比该基因为高表达或低表达的被测酵母。
22. 根据权利要求20所述的酵母的选择方法，其培养标准酵母和被测酵母， 对各酵母中权利要求7所述的蛋白质进行定量，选择与标准酵母相比该蛋白质 的量多或少的被测酵母。
23. 酒类的制造方法，其特征在于，用权利要求10 13所述的酵母以及通 过权利要求20 22所述的方法选择的酵母中的任一酵母进行以酒类制造为目的 的发酵，调节色氨酸含量。
全文摘要
本发明涉及色氨酸转运蛋白基因及其用途，特别是涉及色氨酸同化能力得到控制的酿造酵母、用该酵母制造的酒类、其制造方法等。更具体而言，本发明涉及通过控制酿造酵母的编码色氨酸转运蛋白TAT2p的基因TAT2、特别是啤酒酵母的特征性nonScTAT2基因的表达量来控制色氨酸同化能力的酵母，以及使用该酵母的酒类的制造方法等。
文档编号C12G1/00GK101253265SQ200680031879
公开日2008年8月27日 申请日期2006年8月31日 优先权日2005年9月1日
发明者下永朋子, 中尾嘉宏, 儿玉由纪子 申请人:三得利株式会社