Rho蛋白质检测的制作方法

专利名称：Rho蛋白质检测的制作方法
专利说明Rho蛋白质检测 发明领域 本发明部分地涉及活化Rho蛋白质的检测方法。

背景技术：
Rho GTP酶是Ras超家族的一类结构和功能独特的GTP酶(Wennerberget al.，2005，J.Cell Sci.，118843-846；Takai et al.，2001，Physiol.Rev.，81153-208)。它们参与多种多样的细胞功能，包括调节肌动蛋白和微管蛋白动力学、细胞极性、膜转运途径和转录因子活性(Ridley et al.，1992，Cell，70389-399；Braga et al.，1997，J.Cell Biol.，1371421-1431；和Coso et al.，1995，Cell，811137-1146)。然而，该家族中一些成员(如RhoBTB1，RhoBTB2和RhoH)似乎与经典的成员，例如RhoA、Rac1和Cdc42，在功能上关系并不紧密(Aspenstrom et al.，2004，Biochem J.，377327-337)。因此，本领域技术人员公认，通过序列同源性来界定Ras超家族GTP酶中的Rho GTP酶是最为明确的。
若对超过150个哺乳动物Ras超家族成员的全部GTP酶功能区进行比对并根据比对结果分类形成系统树，20个Rho蛋白质构成Ras超家族树的一个单独的分支(Wennerberg et al.，2005，J.Cell Sci.，118843-846)。Rho蛋白质在GTP酶域内的整体同源性将它们与Ras超家族的其他成员区分开来。Rho蛋白质在GTP酶内共有40-95％的同源性，与其他的Ras超家族GTP酶具有30％或更低的同源性。此外，Rho蛋白具有一个这种小GTP酶类的GTP酶特有的基序。该基序称作Rho插入域(Rho insert domain)，位于小GTP酶域第5β折叠链和第4α螺旋之间(Zong et al.，2001，Mol.Cell Biol.，215287-5298)。
因此，如果一种小G蛋白在与其他Ras超家族蛋白进行比对时落在Rho分支内(例如该蛋白质与其他Rho蛋白具有至少40％的同源性)，并含有Rho插入域，则认为该小G蛋白是Rho家族蛋白。
已知Rho GTP酶参与许多致病过程——例如转移性侵袭、细菌和病毒感染和高血压——的进展(Symons，1995，Curr.Op.Biotech.，6668-674；Chenet al.，1996，Science，2742115-2118；和Uehata et al.，1997，Nature，389990-994)。由于它们在基本细胞功能和致病过程中的多种作用，因此开发可允许研究人员分析细胞中Rho GTP酶活性的测定方法吸引了人们大量的兴趣。而且，人们在开发适合于靶向Rho GTP酶或Rho GTP酶转导途径的药物发现高通量筛选的测定方法以及适合于诊断应用的测定方法方面投入了很大的兴趣。
由Rho GTP酶介导的细胞活动依赖于GTP酶的活化状态。当GTP与Rho GTP酶结合时，它们处于活化状态，并且能够结合效应物并传递信号级联，引起特定的细胞响应。当GDP与Rho GTP酶结合时，Rho蛋白处于非活化状态(Takai et al.，2001，Physiol.Rev.，81153-208)。已经开发出了数种用于监视Rho GTP酶活化状态的测定方法。
有一种测定方法称为Rho效应物沉降(pull down)测定法，它最初由Ren等开发用于RhoA GTP酶(1999，EMBO J.，18578-585)，和由Benard等开发用于Rac1/Cdc42 GTP酶(1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)，是一种经典的、最广泛使用的测定方法。该方法包括通过结合在珠子上的效应物捕获活化的Rho GTP酶蛋白质，从珠子释放GTP酶蛋白质，分离珠子和释放GTP酶蛋白质，随后进行SDS-PAGE，并通过western印迹对GTP酶蛋白质进行分析。该测定方法的重复性差，因为在测定执行过程中需要多重操作处理，并且灵敏度较低。它也不适合于高通量应用(Teusch et al.，2006，Assay and Drug Devel.，4133)。
还有几种基于细胞的测定方法，其使用荧光生物探针(bio-probes)检测活化的Rho GTP酶(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)。此类测定方法中有几个版本是依靠报道系统监视体内Rho GTP酶的活化。因此，这些基于细胞的测定方法并不监视GTP酶的实际内源水平(Itoh et al.，2002，Mol.Cell Biol.，226582-6591；Pertz et al.，2006，Nature，4401069-1072；和Vadim et al.，2000，Science，290333-337)。基于细胞的测定方法的其他版本使用与环境染料(environmental dye)直接连接的效应物域监视体内内源GTP酶的活化。因为在任何特定探针上布置环保染料都需要大量的分析，而且特定的效应物可能不适合于与染料连接，所以任何特定效应物的有效性都是不能预测的(Nalbant et al.，2004，Science，3051615-1619)。而且，因为在体内使用直接效应物检测导致往往识别多于一种GTP酶的探针，所以在这些测定方法中，特异性是一个问题。这类测定方法的另一个问题是外源效应物的引入实际上会改变Rho GTP酶的活化水平，该问题产生了一种在技术上具有挑战性的测定方法(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)。
荧光生物传感器探针也已用于体外测定，但它们的灵敏度非常低。而且，染料会对环境变化作出响应，这也为药物筛选应用带来了问题(Hahn etal.，美国专利申请6,951,947B2)。
有人报道了一种用于基于酶的Rho活化检测方法(Chen et al.，2003，J.Biol.Chem.，2782807)。该测定方法利用GST-效应物-GBD来亲和沉淀活性GTP-Rho。GTP在偶联的酶测定中被洗脱并转变成ATP。然后通过萤火虫荧光素酶法测量ATP。这种测定方法高度依赖于GST沉降测定，因此具有与该测定法相关的大多数缺点。而且，因为在这种方法中不涉及Rho特异的抗体，所以该测定法的特异性有限。
还报道了一种自动化的基于细胞的Rho活化测定方法(Teusch et al.，2006，Assay and Drug Devel.，4133)。这种测定方法是被开发用来代替GST沉降测定的，因为后者不适于高通量筛选且重复性差。该测定法基于Rho调节肌动蛋白细胞骨架的能力。因为肌动蛋白细胞骨架受多种信号途径的调节，所以这种测定方法的特异性非常有限。
因此，需要有一种简单、对特定GTP酶蛋白特异、可重复、灵敏且适合于高通量筛选应用的Rho GTP酶活化测定方法。本发明即是为了这一需要以及其他的方面提供的。
发明概要 本发明涉及用于检测活化Rho GTP酶蛋白质的方法，所述方法通过1)使固体支持物与包含活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，其中固体支持物与活化Rho GTP酶结合肽连接，并且其中样品中的活化Rho GTP酶与活化Rho GTP酶结合肽结合；和2)检测样品中活化的Rho GTP酶蛋白质，其中在检测期间活化的Rho GTP酶蛋白质保持与固体支持物联结(remainsassociated with the solid support)。在一些实施方案中，固体支持物是微量滴定板或微阵列。
在一些实施方案中，该样品包括含有内源活化Rho GTP酶蛋白质的细胞裂解物。在一些实施方案中，该样品包含少于50μg的总蛋白。在一些实施方案中，该细胞裂解物是从少于105个细胞制备的。在一些实施方案中，该细胞裂解物未被澄清。在一些实施方案中，该样品包含外源GTP、GDP或GTPγS。
在一些实施方案中，在检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质之前，添加抗原提呈缓冲剂(Antigen Presenting Buffer)。该抗原提呈缓冲剂包括一种或多种能够减少活化Rho GTP酶蛋白质自固体支持物的损失的化合物或处理。在一些实施方案中，抗原提呈缓冲剂包括热变性、尿素处理、戊二醛、乙醇或三氯乙酸，或其任意组合。在一些实施方案中，三氯乙酸的最终浓度为大约0.5％至大约15％v/v。
在一些实施方案中，在检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质之前，添加结合缓冲剂(Binding Buffer)。在一些实施方案中，所述结合缓冲剂包括水溶性聚蔗糖(ficoll)、葡聚糖或聚乙二醇，或其任意组合。在一些实施方案中，该聚乙二醇是PEG 4000或PEG 8000，其终浓度为大约2％至大约40％v/v。
在一些实施方案中，使用对一种或多种活化Rho GTP酶蛋白质特异的抗体来检测活化Rho GTP酶蛋白质。
在一些实施方案中，活化Rho GTP酶蛋白质是组成型活性突变体。在一些实施方案中，活化Rho GTP酶蛋白质是RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、或RhoBTB2。
在一些实施方案中，活化Rho GTP酶结合肽结合一种或多种活化RhoGTP酶蛋白质，且其对活化Rho GTP酶蛋白质的亲和力是对非活化形式的Rho GTP酶蛋白质的亲和力的至少2倍高(at least 2 fold higher)。在一些实施方案中，活化Rho GTP酶结合肽是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH、WASP或Dia1，或它们的突变体或多聚体。在一些实施方案中，活化Rho GTP酶结合肽共价或非共价地连接于固体支持物。在一些实施方案中，共价连接是二硫键连接，非共价连接是GST连接。在一些实施方案中，活化RhoGTP酶结合肽是冻干的。
在一些实施方案中，该方法进一步包括对与活化Rho GTP酶结合肽结合的活化Rho GTP酶蛋白质的量进行定量。在一些实施方案中，使用对一种或多种Rho GTP酶蛋白质特异的抗体对活化Rho GTP酶蛋白质的量进行定量。
在一些实施方案中，活化Rho GTP酶蛋白质的检测是利用吸光度、发光或荧光来检测活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽之间的相互作用而进行的。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使样品与测试剂接触，并确定测试剂是否调节活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽之间的相互作用。
附图简述

图1A描绘了重组效应物-GBD肽的考马斯染色SDS凝胶。图1B描绘了野生型和修饰Rho靶蛋白-Cys-GBD的DNA和氨基酸序列。图1C描绘了选择性结合活化RhoA的修饰Rho靶蛋白-Cys的Western印迹分析。
图2A描绘了使用ROCK板通过发光测定法检测活性RhoA所检测到的RhoA信号。图2B描绘了使用POSH板通过490nm吸光度检测活性Rac1所检测到的Rac1信号。图2C描绘了使用WASP板通过490nm吸光度检测活性Cdc42所检测到的Cdc42信号。
图3A描绘了用ROCK-GBD马来酰亚胺板通过发光测定法检测到的RhoA信号。图3B描绘了用POSH-GBD马来酰亚胺板通过490nm吸光度检测到的Rac1信号。
图4描绘的是使用抗RhoA抗体的Western印迹，显示抗体温育期间G-LISAGTP酶信号的损失。
图5A描绘的是显示用于RhoA G-LISA抗原提呈缓冲剂的开发的发光检测(白色条形显示GDP信号，灰色条形显示GTPγS信号)。图5B描绘的是通过490nm吸光度检测的Rac1信号，显示TCA在Rac1POSH G-LISA中作为抗原提呈缓冲剂。
图6A描绘了通过490nm吸光度检测的RhoA信号，显示在结合缓冲剂的存在下活性RhoA的稳定性(SS是血清饥饿样品--白色条形；钙蛋白酶抑制剂(Calpeptin)标记的RhoA诱导的样品--灰色条形)。图6B描绘了通过490nm吸光度检测到的活性RhoA信号，显示在结合缓冲剂的存在下增强的RhoA信号(SS是血清饥饿样品--白色条形；钙蛋白酶抑制剂标记的RhoA诱导的样品--灰色条形)。图6C描绘了通过490nm吸光度检测到的Rac1信号，显示结合缓冲剂对Rac1信号的影响(SS是血清饥饿样品--白色条形；EGF标记的RhoA诱导的样品--灰色条形)。
图7A描绘的是用于G-LISA开发的RhoA及RhoA，B，C单克隆抗体的筛选策略和Western分级。图7B描绘了图7A所示单克隆抗体G-LISA筛选的原始数据。
图8描绘了用未澄清的细胞裂解物在ROCK马来酰亚胺板上进行RhoAG-LISA测定的发光。
图9描绘了在G-LISA测定中用非共价效应物-GBD板通过490nm吸光度检测的Rac1信号。
图10描绘了RhoA G-LISA中细胞裂解物的滴定，以及GST-Rho靶蛋白-RBD沉降测定的Western印迹结果。
图11描绘了G-LISA中组成型活化RhoA滴定的吸光度检测结果。
图12描绘了针对Rac1的沉降测定和G-LISA测定的直接比较。
图13A描绘了被表皮生长因子(EGF)体内活化的Rac1的G-LISA分析。图13B描绘了被EGF体内活化的Cdc42的G-LISA分析。图13C描绘了利用G-LISA测定的转染分析。
图14描绘了对冻干的效应物-GBD板的延长保存期研究。
图15描绘了POSH-GBD板在药物发现应用中的使用。
实施方案描述 本发明提供了一种Rho GTP酶活化测定方法，该方法简单、对特定GTP酶蛋白质具有特异性、可重复、灵敏、并且适合于与传统的沉降测定方法相比具有多种优势的高通量筛选应用。
如本文所使用的，术语“大约”是指被修饰的值的大约±5％的范围。例如，短语“大约10”表示9.5-10.5的范围。
如本文所使用的，术语“片段”在指蛋白质时，是指小于整体的肽或多肽。在一些实施方案中，片段包含至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、大约5-大约100个、大约5-大约50个、大约5-大约25个、大约100-大约200个、5-100个、5-50个、5-25个、100-200个、不超过200个、不超过100个、不超过75个、不超过50个、或者不超过25个氨基酸残基。“片段”还可称为蛋白质的“部分”。
如本文所使用的，术语“样品”是指包含Rho GTP酶蛋白质(活化的和/或非活化的)和/或Rho GTP酶结合肽的组合物。样品的实例包括，但不仅限于，血液、细胞、细胞裂解物等。在一些实施方案中，细胞裂解物被澄清或未被澄清。在一些实施方案中，样品包含外源的GTP、GDP或GTPγS。
如本文所使用的，术语“澄清的”(clarified)是指样品被清洁(clear)、缩减(reduced)或过滤(filtered)以除去在裂解细胞时产生的不溶解性物质。任何方法均可用于澄清细胞裂解物，包括但不仅限于，离心、过滤等。
如本文所使用的，短语“Rho GTP酶蛋白质”(也称作“Rho亚家族蛋白质”)包括活性蛋白质和非活性蛋白质二者。当GTP与Rho GTP酶蛋白质相结合时，它们处于活性状态，能够结合效应物并传播信号级联，引起特定的细胞响应。当GDP与Rho GTP酶蛋白质相结合时，Rho蛋白质是非活性的。本发明的方法可以用于检测活化的GTP酶蛋白质。Rho GTP酶蛋白质包括，但不仅限于，RhoA(SEQ ID NO1)，RhoB(SEQ ID NO2)，RhoC(SEQ ID NO3)，RhoD(SEQ ID NO4)，Rnd3(SEQ ID NO5)，Rnd1(SEQ IDNO6)，Rnd2(SEQ ID NO7)，Rif(SEQ ID NO8)，RhoG(SEQ ID NO9)，RhoH(SEQ ID NO10)，Rac1(SEQ ID NO11)，Rac1b(SEQ ID NO84)，Rac2(SEQID NO12)，Rac3(SEQ ID NO13)，Cdc42(SEQ ID NO14)，TC10(SEQ IDNO15)，TCL(SEQ ID NO16)，Wrch-1(SEQ ID NO17)，Wrch-2(SEQ IDNO18)，RhoBTB1(SEQ ID NO19)，和RhoBTB2(SEQ ID NO20)，或者其任何亚群。
“Rho GTP酶结合肽”或“活化Rho GTP酶结合肽”(也称作“Rho亚家族结合肽”)是能够结合活化Rho GTP酶蛋白质的蛋白质或其片段。“RhoGTP酶结合肽”并不指GTP或其类似物。“Rho GTP酶结合肽”在这里还称作“效应物”(effector)。本领域技术人员可通过常规实验来鉴定保留其结合活性Rho GTP酶蛋白质之能力的Rho GTP酶结合肽片段。在一些实施方案中，在本文提供的方法中使用的Rho GTP酶结合肽结合Rho GTP酶蛋白质，且其与Rho GTP酶蛋白质的GTP结合态的亲和力是与Rho GTP酶蛋白质的GDP结合态的亲和力的至少2倍。
在一些实施方案中，Rho GTP酶结合肽可以包括小G蛋白效应物之氨基酸序列的全部或部分或片段，其中小G蛋白效应物例如ROCK1、ROCK2、Citron、DGKθ、移动结合蛋白(Kinectin)、Dia1、Dia2、Dia3、PLC-ε，蛋白激酶N、Rhophillin、Rho靶蛋白(Rhotekin)、FHOD、p67Phox、PLC-β、POR-1、POSH、Sra-1、突触小泡磷酸酶(Synaptojanin)-2、Ack1、Ack2、CEP1、CEP2、CEP3、CEP4、CEP5、CIP4、外被体(Coatamer)α、外被体γ、MRCKα、MRCKβ、Pak4、Spec1、Spec2、WASP、N-WASP、IRSp53、IQGAP-1、IQGAP-2、MEKK1、MEKK4、MLK2、MLK3、p70 S6激酶、Pak1、Pak2、Pak3、Pak4、Pak5、Pak6、PI3K(p85亚单位)、PIP5K、PLD-1，或其任何亚群或组合。在一些实施方案中，Rho GTP酶结合肽是多聚体化的，从而存在多于一个单位的配体。例如，Rho GTP酶结合肽可以是二聚体或三聚体化的(3个拷贝)。Rho GTP酶结合肽还可以具有该蛋白质与Rho GTP酶蛋白质结合的序列的4、5、6、7、8、9、或10个拷贝。
如果将某蛋白质与其他Ras超家族蛋白质进行比对时，其落入Rho分支(例如，该蛋白质与其他Rho蛋白质具有至少40％的同源性)，并且其含有Rho插入域，则认为该蛋白质是“Rho GTP酶蛋白质”。在一些实施方案中，如果一种小G蛋白质与其他Rho蛋白质，例如但不仅限于，RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、和/或RhoBTB2具有至少40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、40-99、50-99、60-99、70-99、80-99、85-99、90-99、或95-99％的同源性，则认为该小G蛋白质是Rho家族蛋白质。此外，当使用某种方法如保守域发现工具(conserveddomain finder)表明某种蛋白质包含Rho插入蛋白时，则认为该蛋白质具有Rho插入蛋白。将鉴定为具有Rho插入域的蛋白质看作Rho GTP酶蛋白质。任何方法或软件均可用于确定某种蛋白质是否包含Rho插入蛋白。作为一个非限制性实例，可以使用例如“rpsblast”采用默认设置，将蛋白质对保守域数据库进行比较，rpsblast可在例如美国国家生物技术信息中心的网站上找到，其在万维网上的地址为ncbi“点”nlm“点”nih“点”gov/Structure/cdd/wrpsb“点”cgi。如这里所使用的，对于互联网地址，术语“点”是指“.”。本文提供了Rho GTP酶蛋白质的实例，包括但不仅限于，RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、RhoBTB2等。
鉴定蛋白质家族成员或同源物的其他方法和实例包括，但不仅限于下述。有多种蛋白质家族数据库可用于分析或鉴定同源蛋白质、域和基序。数据库的实例包括，但不仅限于，简单模块构架搜索工具(Simple ModularArchitecture Resource Tool，SMART)、比对和HMM蛋白质家族数据库(Pfam)、人类蛋白质参考数据库(Human Protein Reference Database，HPRD)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man OMIM)、癌症基因组解剖计划(Cancer Genome Anatomy Project，CGAP)和Entrez Protein搜索数据库。SMART数据库可以在smart“点”embl-heidelberg“点”de/访问。Pfam数据库可以通过互联网的万维网在例如sanger“点”ac“点”uk/Software/Pfam/search.shtml进行访问。OMIM是部分为美国国家生物技术信息中心(NCBI)开发的与疾病相关的人类遗传突变数据库。OMIM可通过环球网在例如ncbi“点”nlm“点”nih“点”gov/Omim/进行访问。CGAP是一个旨在建立破译癌细胞分子解剖学所需的信息和技术工具的跨学科计划。CGAP可以通过互联网的万维网在例如ncbi“点”nlm“点”nih“点”gov/ncicgap/进行访问。Entrez蛋白质搜索数据库可以通过互联网的万维网在ncbi“点”nlm“点”nih“点”gov/entrez/query“点”fcgi？db＝Protein进行访问。这些数据库中的一些可能包含完整的或部分的核苷酸或氨基酸序列。近年来，隐藏马尔可夫模型(HMM)已成为一种用于检测这些家族成员的关键技术。Pfam、TIGRFAMs和SMART数据库使用由HMMER软件包提供的子集(profile)-HMM。TIGRFAMs是人工注解(curated)蛋白质家族的集合，由下述各项组成HMMs、多序列比对、注释、GeneOntology(GO)指配、文献参考和指向相关TIGRFAMs、Pfam和InterPro模型的指示。TIGRFAMs包含超家族、亚家族和等价体(equivalog)水平的全长蛋白质和短区域。TIGRFAMs可以通过互联网的万维网在tigr“点”org/TIGRFAMs进行搜索和下载。
小G蛋白效应物的部分氨基酸序列可以是域，例如Cdc42/Rac相互作用性结合(CRIB)域、Rho结合域(RhoBD)、Rho相互作用域(RID)、Rho效应物或蛋白激酶C相关的激酶同源性区1(HR-1)、三十四肽(tetratricopeptide)重复单位(TPR)、或血小板白细胞C激酶底物(Pleckstrin)同源(PH)域。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的Rho GTP酶结合肽可包含针对Rho GTP酶蛋白质的效应物或其域。实例包括，但不仅限于，RhoBD、RID和HR-1域。能够结合活化RhoA GTP酶蛋白质的RhoBD的一种共有氨基酸序列是SEQ ID NO21。能够结合活化Rho GTP酶蛋白质的HR-1域的一种共有氨基酸序列是SEQ ID NO22。能够结合活化Rho GTP酶蛋白质的RID域的一种共有氨基酸序列是SEQ ID NO23。作为RhoA GTP酶蛋白质效应物的含有RhoBD的肽的实例包括，但不仅限于，Citron(SEQ IDNO24)，ROCK 1(SEQ ID NO25)和ROCK 2(SEQ ID NO26)。作为RhoA/B/C GTP酶蛋白质的效应物的含有HR-1域的肽的实例包括，但不仅限于，蛋白激酶N1(SEQ ID NO27)，蛋白激酶N2(SEQ ID NO28)，ROCK 1(SEQ ID NO25)，ROCK 2(SEQ ID NO26)，Rhophilin(SEQ ID NO29)，Rho靶蛋白(SEQ ID NO30)，和Rho靶蛋白2(Rhotekin 2)(SEQ ID NO83)。作为RhoA GTP酶蛋白质的效应物的含RID域的肽的实例包括，但不仅限于，ROCK 1(SEQ ID NO25)和ROCK 2(SEQ ID NO26)。其他作为RhoA GTP酶蛋白质效应物的肽的实例包括，但不仅限于，DGKθ(SEQ ID NO31)，移动结合蛋白(SEQ ID NO32)，Dia1(SEQ ID NO33)，Dia2(SEQ ID NO34)，MBS(SEQ ID NO82)和PLC-ε(SEQ ID NO35)。
作为RhoB GTP酶蛋白质效应物的肽的实例包括，但不仅限于，Db1(SEQ ID NO93)和p76RBE(SEQ ID NO94)。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的Rho GTP酶结合肽可以包括Rac小G蛋白的效应物。充当Rac小G蛋白效应物的域的实例包括，但不仅限于，TPR域和PH域。能够结合活化Rac小G蛋白的TPR域的一种共有氨基酸序列是SEQ ID NO36。能够结合活化Rac小G蛋白的PH域的一种共有氨基酸序列是SEQ ID NO37。作为Rac小G蛋白的效应物的含TPR域的肽的实例包括，但不仅限于，p67Phox(SEQ ID NO38)。作为Rac小G蛋白的效应物的含PH域的肽的实例包括，但不仅限于，PLC-β(SEQ IDNO39)。其他作为Rac小G蛋白效应物的肽的实例包括，但不仅限于，FHOD(SEQ ID NO40)、POR-1(SEQ ID NO41)、POSH(SEQ ID NO42)、Sra-1(SEQID NO43)、PP5磷酸酶(SEQ ID NO85)、肉桂酰(Cinnamolyl)-CoA还原酶(SEQ ID NO86)、UNC-115(SEQ ID NO87)、Wave(SEQ ID NO88)、丛蛋白(Plexin)B1(SEQ ID NO89)、p35(SEQ ID NO90)、Tre17(SEQ ID NO91)、CID(SEQ ID NO92)，和突触小泡磷酸酶-2(SEQ ID NO44)。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的肽可以包含作为Cdc42小G蛋白效应物的域。可充当Cdc42小G蛋白效应物的域的实例包括，但不仅限于，CRIB域。能够结合活化Cdc42小G蛋白的一种CRIB域共有氨基酸序列是SEQ ID NO45。作为Cdc42小G蛋白的效应物的含CRIB域的肽的实例包括，但不仅限于，Ack1(SEQ ID NO46)，Ack2(SEQ ID NO47)，Pak4(SEQ ID NO48)，WASP(SEQ ID NO49)和N-WASP(SEQ ID NO50)。其他作为Cdc42小G蛋白效应物的肽的实例包括，但不仅限于，CEP1(SEQ IDNO51)，CEP2(SEQ ID NO52)，CEP3(SEQ ID NO53)，CEP4(SEQ IDNO54)，CEP5(SEQ ID NO55)，CIP4(SEQ ID NO56)，外被体α蛋白(SEQ IDNO57)，外被体γ蛋白(SEQ ID NO58)，Dia3(SEQ ID NO59)，MRCKα(SEQID NO60)，MRCKβ(SEQ ID NO61)，Spec1(SEQ ID NO62)和Spec2(SEQID NO63)。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的GTP酶结合肽可以包含同时作为Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效应物的域。可充当Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效应物的域的实例包括，但不仅限于，CRIB域。能够结合活化Rac小G蛋白或活化Cdc42小G蛋白的CRIB域的一种共有氨基酸序列是SEQ ID NO45。作为Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效应物的包含CRIB域的肽的实例包括，但不仅限于，MLK2(SEQ ID NO64)、MLK3(SEQ ID NO65)、Pak1(SEQ ID NO66)、Pak2(SEQ ID NO67)、Pak3(SEQ IDNO68)、Pak5(SEQ ID NO69)、Pak6(SEQ ID NO70)、Tre17(SEQ ID NO91)、和Par6(SEQ ID NO71)。其他作为Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白效应物的肽的实例包括，但不仅限于，IRSp53(SEQ ID NO72)、IQGAP-1(SEQ IDNO73)、IQGAP-2(SEQ ID NO74)、MEKK1(SEQ ID NO75)、MEKK4(SEQID NO76)、p70S6激酶(SEQ ID NO77)和PI3k，p85亚单位(SEQ ID NO78)。
在一些实施方案中，本发明方法所使用的GTP酶结合肽可以包含同时作为Rac小G蛋白的效应物和RhoA小G蛋白的效应物的域。作为Rac小G蛋白的效应物和RhoA小G蛋白效应物的肽的实例包括，但不仅限于，PIP5K(SEQ ID NO79)。
在一些实施方案中，本发明方法所使用的GTP酶结合肽可以包含这样的域，所述域是针对活性形式的Rac小G蛋白、RhoA小G蛋白和Cdc42小G蛋白的结合蛋白。这类肽的实例包括，但不仅限于，PLD-1(SEQ IDNO80)、Vav PH、DH、CRD域(SEQ ID NO 81)。
在一些实施方案中，本发明方法所使用的GTP酶结合肽可以包含这样的域，所述域是针对活性形式的Rnd2小G蛋白或TC10小G蛋白的结合蛋白。这类肽的实例包括，但不仅限于，针对TC10的PIST(SEQ ID NO95)、针对Rnd2的Rapostlin(SEQ ID NO96)和针对Rnd2的Pragmin(SEQ IDNO97)。
在一些实施方案中，Rho GTP酶结合肽或效应物被修饰，从而使全部或部分的内部半胱氨酸残基突变成非半胱氨酸残基。在一些实施方案中，Rho GTP酶结合肽或效应物被修饰，从而使其含有C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，Rho GTP酶结合肽包含不同效应物或者能结合Rho GTP酶蛋白质的蛋白质之片段的组合。
本领域中理解，要将两种肽或蛋白质看作具有共同的或保守的肽域，或者将它们看作保守蛋白质家族的成员，其中一种肽或蛋白质的氨基酸序列并不需要与另一种肽或蛋白质100％相同。例如，对于短肽域(即少于50个氨基酸)而言，已发现有数种蛋白质具有称作Cdc42/Rac相互作用性结合(CRIB)域的肽域。CRIB域是一种14-16个氨基酸的序列，具有8个保守残基，先前已证明其参与信号分子与活化GTP结合形式的Rac和Cdc42的结合。共有CRIB域是I-S-X-P-X(4)-F-X-H-X(2)-H-V-G，其中括号内的数字代表可变(X)氨基酸残基的总数。
对于较大的肽域，例如具有50个或更多个氨基酸的肽，当两种或更多种蛋白质、肽或域是同源的、高度保守的或紧密相关时，给定的一种蛋白质、肽或域的氨基酸序列与另一种肽、蛋白质或给定的蛋白质内的域的氨基酸序列可以具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
一般地，在长度大于50个残基、差异小于50-60％的多个序列或子序列中，有多种算法重现其比对的主要特征。因此，长度大于50个氨基酸的紧密相关序列和蛋白质同源物将共有至少40％的氨基酸同一性，并且在一些实施方案中将共有至少40％-50％的氨基酸同一性，在一些实施方案中将共有至少50％-60％的氨基酸同一性，在一些实施方案中将共有至少60％-70％的氨基酸同一性，在一些实施方案中将共有至少70％-80％的氨基酸同一性，在一些实施方案中将共有至少80％-90％的氨基酸同一性，在另外一些实施方案中将共有至少90％-100％的氨基酸同一性。同源性可以用各种公众可得的软件工具进行计算，例如那些由NCBI(Bethesda，MD)开发的软件工具，它们可通过互联网(ftp“点”ncbi“点”nlm“点”nih“点”gov/pub/)获得。工具的实例包括，但不仅限于，可通过互联网的万维网在“ncbi”点”nlm”点”nih”点”gov访问的BLAST系统，和可通过互联网的万维网分别在“点”ebi“点”ac“点”uk/emboss/align/和ebi“点”ac“点”uk/clustalw/获得EMBOSS成对比对算法(BLOSUM62矩阵设置)和ClustalW比对。
在一些实施方案中，本发明提供了用于检测活化Rho GTP酶蛋白质的方法，包括使固体支持物与含活化Rho GTP酶蛋白质的样品相接触。固体支持物与活化Rho GTP酶结合肽连接。样品中的活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽结合。检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质。在检测期间，活化Rho GTP酶蛋白质保持与固体支持物联结。作为非限制性实例，固体支持物是微量滴定板的孔，所述孔与Rho GTP酶结合肽连接，使含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品与所述微量滴定板接触。在本实例中，Rho GTP酶结合肽和活化Rho GTP酶蛋白质彼此直接或者间接地通过复合物相互作用，而样品中其余的蛋白质和其他化合物被洗去或除去，留下活化Rho GTP酶蛋白质和固体支持物用于检测步骤。因此，在本实例中，认为Rho GTP酶蛋白质保持与固体支持物联结。相对地，在使用珠子的标准沉降测定中，其中Rh o GTP酶结合肽与珠子连接并与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，在将活化蛋白质加载到凝胶或其他类型的分离介质(例如柱)上之前将活化蛋白质从珠子上被洗脱下来并与珠子分离，或者在检测之前将活化蛋白质与固体支持物分离。然后对Rho GTP酶蛋白质进行检测，但是它已经与固体支持物(例如珠子)分离，因此在标准沉降测定中，活化Rho GTP酶蛋白质在检测步骤期间与固体支持物不保持联结。
如这里所使用的，当称两个蛋白质或组分“彼此结合”时，这可以表示它们直接彼此接触或者彼此形成复合物但不直接接触。
固体支持物可以是Rho GTP酶结合肽能够结合的任何表面。实例包括，但不仅限于，微量滴定板、珠子、盘(discs)、微阵列、载玻片等。在一些实施方案中，固体支持物包括微量滴定板或微阵列，但不包括珠子或盘。在一些实施方案中，用试剂活化或包被固体支持物，其中所述试剂会将蛋白质共价附接于固体支持物，例如通过例如形成二硫键。这种试剂的实例包括，但不仅限于，马来酰亚胺(malemide)。也可通过这样的方式包被或修饰固体支持物，使得蛋白质可以通过非共价相互作用而与固体支持物结合或键合。例如，固体支持物可以包含谷胱甘肽，谷胱甘肽会与含有GST部分的蛋白质结合，或者固体支持物可以包含阳离子，阳离子使得含有组氨酸标签的蛋白质与固体支持物结合。也可使用其他的修饰，包括但不仅限于，抗生物素蛋白-生物素、HA-血凝素等。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的Rho GTP酶结合肽共价附接于马来酰亚胺活化的板。马来酰亚胺活化的板可以商购，并且设计成通过可用的-SH部分固定生物分子，其中-SH部分通常来自半胱氨酸残基。马来酰亚胺活化板的实例包括，但不仅限于，聚苯乙烯微量培养板，例如Costar的巯基结合板和条(Corning，Inc.Corning，NY)，Reacti-BindTM马来酰亚胺活化板(Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL)和马来酰亚胺活化微孔板-巯基-TRAPTM(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)。
在一些实施方案中，可以将本发明方法所用的效应物肽附接在带有预活化的共价表面分子的固体支持物(例如微量滴定板或微阵列)上。这些板可以商购，表面对其偶联配偶物(coupling partners)高度特异，因此用于以位点定向(site-directed)的方式固定生物分子。这些板的实例包括，但不仅限于，N-氧琥珀酰亚胺(DNA-BINDTM)活化板、酰肼(Carbo-BINDTM)活化板、Univer-BINDTM板(Corning，Inc.Corning NY)、Reacti-Bind中性抗生物素蛋白包被板、Reacti-Bind链霉亲和素包被板、Reacti-Bind抗GFP包被板、Reacti-Bind抗GST包被板(Pierce Biotechnology，Rockland，IL)、Biotin-TrapTM、GST-TrapTM、Amine-TrapTM、Sugar-TrapTM、Streptavidin-TrapTM板(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)等。
在一些实施方案中，本发明方法所用的效应物肽可以和固体支持物(例如微量滴定板)连接(例如附接)，该固体支持物含有中度到高度结合性表面(medium to high binding surface)，其通过疏水或离子相互作用而被动地吸收生物分子。这些板的实例包括，但不仅限于，由Corning公司(Corning NY)、Pierce生物技术公司(Rockland IL)等制造的一系列EIA/RIA板。
在一些实施方案中，本发明方法所用的效应物肽可以连接于含有胺化或羧化表面的微量滴定板。通过这些表面使用双功能交联剂实现共价偶联，所述双功能交联剂使表面上的胺基或羧基偶联于肽上的官能团例如胺基、巯醇基或羧基。这些微量培养板包括，但不仅限于，由Corning公司(CorningNY)制造的聚苯乙烯或聚丙烯板系列。
在一些实施方案中，本发明方法所用的效应物肽可以是配置为容纳给定反应体积的板。实例包括，但不仅限于，96孔板、384孔板、1536孔板等。在一些实施方案中，本发明方法所用的效应物肽可以以微阵列模式提供。
在一些实施方案中，对本发明方法所用的固定的效应物肽加以配制，使其可以在孔内或者在微阵列模式中冻干，而且维持其在再水化时结合活化Rho GTP酶蛋白质的能力。
在一些实施方案中，被固定的肽是Rho GTP酶蛋白质，其产生效应物或效应物-HRP偶联物的靶标。在此情况下，将所述模式设计为筛选抑制或提高这两种蛋白质之间相互作用的配体。在此模式下，该测定方法可用于发现在药物发现中有用的配体。
在一些实施方案中，测定(方法)包括将活性Rho结合肽或其片段固定(连接)于微量滴定板的孔。在一些实施方案中，该方法包括冻干孔内的结合蛋白质从而产生高度稳定和稳健(robust)的蛋白质基质(matrix)；将固定的结合性蛋白与来自澄清或未澄清的细胞裂解物或组织样品或重组来源的活化Rho GTP酶蛋白质共温育；和用Rho GTP酶特异抗体对结合活化RhoGTP酶蛋白质的效应物的量进行定量。
本方法与先前用于确定Rho GTP酶蛋白质和其它小G蛋白活化状态的基于效应物的方法相比具有很多优点。首先，本测定方法可产生附接于微量滴定孔或微阵列上的活化Rho GTP酶结合肽的稳定冻干制剂，从而整个活化测定可以在单孔模式下进行，无需不断地操作样品，从而实现稳健性大大提高的测定。其次，在一些实施方案中，本方法不需要对含有Rho GTP酶蛋白质的细胞裂解物进行预澄清，从而可以更加容易地处理多个样品，最大程度地减少GAP活性所造成的Rho活化的低估。第三，本测定方法比现有测定方法更加灵敏，可以使用更少量的细胞裂解物或总蛋白，这在可用的原始材料极少和需要高通量测定的情况下可能是相当重要的。
在一些实施方案中，本发明提供了对样品(例如生物(组织、血液等)或细胞培养物)进行高通量筛选以定量其活化G蛋白状态的方法。本发明还提供了抑制或增强或促进小G蛋白与其效应物蛋白之间的相互作用的化合物或生物分子的高通量筛选方法。所述方法的实例包括，但不仅限于，抑制或增强RhoA-Rho激酶相互作用、RhoA-Dia相互作用、RhoC-Rho激酶相互作用、Rac1-Pak相互作用、Cdc42-Pak相互作用的化合物。
在一些实施方案中，本发明涉及基于固体支持物(例如微量滴定板或微阵列)ELISA的活化Rho GTP酶蛋白质检测方法。该方法包括使对活性Rho GTP酶特异的结合肽附接于固体支持物(例如微量滴定板或微阵列基质(matrix))的孔上，将该固定的活性Rho GTP酶结合肽与含有一种或多种活化Rho GTP酶蛋白质的样品(例如细胞裂解物)共温育，及使用对特定Rho GTP酶蛋白质的抗体(例如非特异或特异的)定量活化Rho GTP酶蛋白质。
在一些实施方案中，本发明方法所使用的抗体是Rho GTP酶蛋白质的单克隆、重组或多克隆抗体。这些抗体可以对一个家族成员或多个家族成员特异。这些抗体的实例包括，但不仅限于，小鼠单克隆抗RhoA抗体(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz CA)、小鼠单克隆抗泛-Rho(pan-Rho)抗体(BD Transduction Laborataries，San Diego CA)、鸡多克隆抗RhoA抗体(Genway，Inc.San Diego CA)、小鼠单克隆抗Rho A，B，C抗体(CytoskeletonInc.)、小鼠抗RhoA抗体(Cytoskeleton Inc.)等。
在一些实施方案中，本发明方法所使用的抗体可以是与酶或可检测生物分子偶联的单克隆、重组或多克隆第一抗体。这些可检测的偶联抗体避免了使用第二抗体，从而提高了反应的特异性。偶联抗体的实例包括，但不仅限于，HRP偶联的第一抗体、AP偶联的第一抗体、预先与链霉抗生物素蛋白-HRP偶联物混合的生物素偶联的第一抗体。
在一些实施方案中，本发明方法使用的抗体可以是针对Rho GTP酶蛋白质的特定效应物的单克隆、重组或多克隆抗体。
“对特定Rho GTP酶蛋白质特异的抗体”是指仅对一种Rho GTP酶蛋白质具有特异性，而不会与另外的Rho GTP酶蛋白质反应或检测另外的RhoGTP酶蛋白质的抗体。在一些实施方案中，抗体可以是双特异性的，从而它能够结合或检测两种Rho不同的Rho GTP酶蛋白质。在一些实施方案中，抗体识别一种或多种Rho GTP酶蛋白质。在一些实施方案中，使用能够检测和结合超过两种Rho GTP酶蛋白质的非特异性抗体。抗体可以对特定的Rho GTP酶蛋白质具有特异性，但是在一些实施方案中，抗体也可以仅识别活化形式的Rho GTP酶蛋白质，非活性形式的Rho GTP酶蛋白质，或者在一些实施方案中，抗体能够同时识别活性或非活性形式。
在一些实施方案中，本发明提供了一种基于固体支持物(例如微量滴定板或微阵列)ELISA的活化重组Rho GTP酶蛋白质检测方法。该方法可包括将Rho GTP酶特异性的结合肽(例如效应物肽)连接到微量滴定板孔或微阵列基质(matrix)的孔上；将固体的效应物肽与一种或多种活化的重组RhoGTP酶蛋白质共温育；并使用对特定Rho GTP酶蛋白质特异性的抗体对活化Rho GTP酶蛋白质进行定量。
在一些实施方案中，Rho GTP酶蛋白质是Rho GTP酶的重组突变体形式和/或组成型活性突变体。本领域技术人员可以创造Rho GTP酶蛋白质的组成型活性突变体。在一些实施方案中，可以将效应物蛋白质或肽和固定的Rho GTP酶蛋白质共温育，并使用效应物特异性抗体对Rho GTP酶效应物相互作用进行定量。
在一些实施方案中，本方法包括对活性Rho GTP酶蛋白质的量进行定量。
如这里所使用的，“效应物特异抗体”是指仅结合一种效应物，而不能检测或结合其它效应物的抗体。
在一些实施方案中，将细胞裂解物或样品配制成含有缓冲组分的溶液，其pH为5-10，大约7.5，或者大约6-大约8，大约6-大约9，大约7-大约8，或大约7的pH。在一些实施方案中，含有效应物肽或Rho蛋白质的样品可以包含去垢剂组分。去垢剂组分可以是，例如，非离子去垢剂，例如但不仅限于，Triton X-100。去垢剂的最终浓度可以是例如大约0.1、大约0.2、大约0.3、大约0.4、大约0.5、大约0.6、大约0.7、大约0.8、大约0.9、大约1.0、大约1.5、大约1-大约2、大约1-大约3、大约0.5-大约1.5、大约.75-大约1.25、大约1-大约5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、1-2、1-3、0.5-1.5、0.75-1.25、或1-5％。在一些实施方案中，细胞裂解物或样品含有氯化镁。在一些实施方案中，氯化镁的最终浓度可以是例如大约5-大约80、大约10-大约50、大约15-大约25、大约20、5-80、10-50、15-25或20mM。
样品或裂解缓冲剂还可以包含盐组分。盐组分的实例包括，但不仅限于，氯化钠、氯化钾等。盐组分的最终浓度可以是例如大约10-大约700、大约100-大约500、10-700或者100-500、100、200、300、400、500、大约100、大约200、大约300、大约400、大约500mM。
在一些实施方案中，样品或细胞裂解物中总蛋白的量是大约1-大约300、大约20-大约50、大约1-大约200、大约1-大约100、大约1-大约75、大约1-大约50、大约1-大约25、大约1-大约10、大约20、大约50、小于100、小于75、小于50、小于25、小于10、小于300、或者小于200μg。
在一些实施方案中，样品包含大约103-大约106、103-大约105、103-大约104、104-大约105、小于106、小于105、或者小于104个细胞，或者用此处所示相同数目的细胞制备而得的细胞裂解物。
检测Rho GTP酶结合肽与Rho GTP酶蛋白质(例如活化的或非活化的)之间的相互作用(例如结合)，可以使用任何可用于检测该相互作用的方法或仪器来进行。例如，该检测可以利用荧光、发光、吸光度的差异及其组合等。
在本发明的一些实施方案中，在检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质之前，添加抗原提呈缓冲剂(APB)(也称作“抗原提呈增强剂”)。抗原提呈缓冲剂包括一种或多种能够降低固体支持物上活化Rho GTP酶蛋白质的损失的化合物或处理。在一些实施方案中，抗原提呈缓冲剂包括热变性；干燥变性；尿素处理；交联剂如SMCC和戊二醛；乙醇或甲醇；或三氯乙酸；或其任意组合或亚组。在一些实施方案中，固体支持物上活化的Rho GTP酶蛋白质的损失减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。在一些实施方案中，三氯乙酸的最终浓度为大约0.5-大约15％v/v。在一些实施方案中，TCA的最终浓度为大约0.5％-大约10％，大约0.5％-大约7.5％，大约0.5％-大约5％，大约0.5％-大约4％，大约0.5％-大约3％，大约0.5％-大约2％，大约0.5％-大约1％，大约0.5％，或者大约1％，小于10％，小于5％，小于4％，小于3％，或者小于2％v/v。
在一些实施方案中，在检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质之前，添加结合缓冲剂(也称作“蛋白蛋白相互作用增强剂”)。在一些实施方案中，结合缓冲剂使Rho GTP酶结合肽与Rho GTP酶蛋白质的结合亲和力比没有结合缓冲剂时提高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，提高到2倍，3倍，或者超过3倍。在一些实施方案中，结合缓冲剂包括水溶性聚蔗糖、葡聚糖或聚乙二醇，或者其任意组合或亚组。在一些实施方案中，聚乙二醇是PEG 4000或PEG 8000，最终浓度为大约2％-大约40％v/v。在一些实施方案中，PEG的最终浓度为大约2％-大约40％，大约2％-大约30％，大约2％-大约25％，大约2％-大约20％，大约2％-大约10％，大约2％-大约5％，大约2％，大约10％，大约20％，大约30％，大约40％。
在一些实施方案中，本方法进一步包括对样品中的活化Rho GTP酶蛋白质的量进行定量。对蛋白的量进行定量的方式对于本方法而言并不特定，任何定量方法均可使用。合适的方法包括，但不仅限于，荧光、发光或吸光度的差异。
在一些实施方案中，本方法进一步包括使样品与测试剂接触，并确定测试剂是否调节活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽的结合。在一些实施方案中，测试剂将提高所述结合，在其他的实施方案中，测试剂将降低所述结合。测试剂可以是任何化合物或组合物，例如蛋白质、肽、有机小分子、碳水化合物等。如果测试剂抑制结合，则认为测试剂是抑制剂。可以将存在和不存在测试剂时Rho GTP酶蛋白质与Rho GTP酶结合肽的结合进行比较，以确定测试剂是否调节该结合。可以使用任何方法对该结合加以检测或定量，包括这里描述的那些方法。
在一些实施方案中，本发明提供一种检测活化Rho GTP酶蛋白质的方法，包括使固体支持物与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，其中经过修饰的Rho GTP酶结合肽与固体支持物连接，并且其中经过修饰的RhoGTP酶结合肽与活化Rho GTP酶蛋白质的Kd低于(即结合亲和力大于)未经修饰的Rho GTP酶结合肽与Rho GTP酶蛋白质的Kd；和检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质。在一些实施方案中，经过修饰的Rho GTP酶结合肽是寡聚化的Rho GTP酶结合肽或突变的Rho GTP酶结合肽。经过修饰的肽可以是任何如本文所描述的、且为本领域技术人员已知的肽，包括但不仅限于经修饰的Rho靶蛋白、经修饰的ROCK1、经修饰的PAK1、经修饰的POSH、或经修饰的WASP。
在一些实施方案中，本发明提供了检测活化Rho GTP酶蛋白质的方法，包括使微量滴定板或微阵列与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，其中活化Rho GTP酶特异性的抗体与微量滴定板或微阵列连接；和检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质。
在一些实施方案中，本发明提供了鉴定活化Rho GTP酶结合肽的方法，包括在可选地存在抗原提呈缓冲剂的条件下，使测试剂与活化Rho GTP酶蛋白质接触；和检测Rho GTP酶蛋白质与测试剂的结合，其中检测到结合表明测试剂是活化Rho GTP酶结合肽。
在一些实施方案中，本发明提供的方法进一步包括使固体支持物与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，其中固体支持物与测试剂连接；和检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质。
在一些实施方案中，本发明提供了确定抗原提呈缓冲剂是否有利于检测活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽的结合的方法，包括使固体支持物与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，其中Rho GTP酶结合肽连接于固体支持物；和以不同的时间间隔检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质，其中不同时间间隔的检测结果降低表明抗原提呈缓冲剂是有利的。
在一些实施方案中，本发明提供了确定测试缓冲剂是否是抗原提呈缓冲剂的方法，包括使固体支持物与测试缓冲剂和活化Rho GTP酶蛋白质接触，其中活化Rho GTP酶结合肽连接于固体支持物；和以不同时间间隔检测活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽的结合，其中如果存在测试缓冲剂时没有观察到检测结果与不存在测试缓冲剂相比降低，则测试缓冲剂是有助于检测活化Rho GTP酶结合肽与活化Rho GTP酶蛋白质之结合的抗原提呈缓冲剂。如果不存在测试缓冲剂时，检测结果降低，而测试缓冲剂的存在防止检测结果的降低，则测试缓冲剂是APB。
在一些实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包括固体支持物；抗原提呈缓冲剂；活化的Rho GTP酶蛋白质；和活化Rho GTP酶结合肽或经过修饰的Rho GTP酶结合肽。
在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括固体支持物和活化Rho GTP酶结合肽，其中活化Rho GTP酶结合肽可选地连接于固体支持物；和可选的抗原提呈缓冲剂。在一些实施方案中，该试剂盒包括共价连接于固体支持物的Rho GTP酶结合肽。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括阳性对照，其中阳性对照包括能够结合Rho GTP酶结合肽的活化Rho GTP酶蛋白质。在一些实施方案中，该试剂盒包括抗原提呈缓冲剂，其含有三氯乙酸(TCA)。在一些实施方案中，该试剂盒包括结合缓冲剂，例如葡聚糖、水溶性聚蔗糖、PEG、或其组合。
在一些实施方案中，该试剂盒包括Rho GTP酶结合肽，其是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH或WASP。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包括关于实施活化Rho GTP酶蛋白质检测的指导。
在一些实施方案中，该试剂盒包括用于检测Rho GTP酶结合肽与活化Rho GTP酶蛋白质之间结合的因子(agent)，其中该因子为发光性、荧光性或放射性。在一些实施方案中，该试剂盒包括的固体支持物是微量滴定板、微阵列、或载玻片，其中固体支持物可选地用马来酰亚胺活化或者以其它方式活化或者如本文所述地包被，以便于Rho GTP酶结合肽结合固体支持物。
为了使这里公开的发明被更加有效地理解，下文提供了实施例。应当理解，这些实施例只是出于举例说明的目的，不可解释为对本发明有任何方式的限制。在所有这些实施例中，除非特别说明，否则分子克隆反应和其他的标准重组DNA技术是根据下文描述的方法使用可商购的试剂进行的Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor出版公司(1989)。
实施例 实施例1用于G-LISA测定的效应物-GBD肽的制备 一些序列基序是Rho GTP酶效应物的多个亚群之间共有的，例如，Cdc42/Rac相互作用性结合(CRIB)基序存在于许多，虽然不是所有的Rac和Cdc42结合性蛋白中(Burbelo et al.，1995，J.Biol.Chem.，27029071-29074)，并且已经发现它对于效应物结合而言是必要但非充分的(Rudolph et al.，1998，J.Biol.Chem.，27318067-18076)。另一种常见的Rho效应物基序是在PRK1和PRK2中发现的Rho效应物同源性(REM)以及在效应物如rhophilin和Rho靶蛋白中发现的HR1重复基序(Flynn et al.，1998，J.Biol.Chem.，2732698-2705)。然而，有大量效应物不含有任何目前已经鉴定的GTP酶结合基序。这些包括POSH、PI3K和DAG效应物(Bishop et al.，2000，Biochem.J.，348241-255)。这类蛋白质纯粹是基于其可区分结合GTP(活化)和GDP(非活化)形式的Rho GTP酶的功能上的能力才归类为Rho效应物的(Tapon，1998，EMBO J.，171395-1404；和Kobayashi et al.，1998，J.Biol.Chem.，273291-295)。因此，本领域技术人员公认，目前Rho效应物是通过其选择性识别结合GTP(活化)形式的Rho GTP酶，而不识别非活化的GDP形式的GTP酶的功能上的能力来定义的(Vetter et al.，2001，Science，2941299-1304；Blumenstein et al.，2004，J.Biol.Chem.，27953419-53426；Martin et al.，1995，EMBO J.，141970-1978；Leung et al.，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.，1025685-5690；Bishop et al.，2000，Biochem.J.，348241-255；和Fujisawa etal.，1998，J.Biol.Chem.，27318943-18949)。
这里提供的实施例采用了6种被表征最多的Rho效应物，或者更具体地说，Rho效应物-GTP酶结合域(GBD)肽。表1详细描述了效应物以及效应物对活化Rho家族蛋白的特异性。
表1活化Rho家族蛋白质的效应物识别 材料和方法 效应物cDNA克隆 这里作为实例提供的所有效应物蛋白质和效应物GTP酶结合域(GBD)，先前均已描述了全长哺乳动物cDNA(见表2)。使用表2所示的引物和cDNA来源，通过PCR克隆了效应物-GBD肽。表2中的核苷酸编码相应于Genbank的提交编码方案。GTP酶结合域(GBDs)是根据鉴定效应物活化Rho结合域的已公开数据选择的(见表1)。
表2效应物克隆信息 *下划线表示半胱氨酸密码子 本文中表2以及任何其他地方提供的GenBank登录号的序列均全部引用并入本文。
修饰效应物-GBD DNA序列以便定向共价结合于马来酰亚胺活化板 在效应物-GBD肽共价连接于马来酰亚胺活化板的场合(见本实施例下文及表3)，对效应物-GBD肽DNA进行修饰，使之在羧基末端含有单个半胱氨酸残基。将半胱氨酸密码子工程化到ROCK1、PAK1和WASP的引物设计中(见表2，3’引物中的半胱氨酸密码子用下划线表示)。在POSH的场合，利用了邻近羧基末端的半胱氨酸密码子(351位)。
Rho靶蛋白的效应物-GBD含有3个内部半胱氨酸残基(表2和图1)。为使Rho靶蛋白-GBD可以定向结合于马来酰亚胺板，化学合成Rho靶蛋白-GBD(Entelechon GmbH，St.Veit-Weg 2，93051 Regensburg，Germany)，除去3个内部半胱氨酸，并分别用谷氨酸(aa# 43)、亮氨酸(aa# 49)和丝氨酸(aa# 65)代替。将一个半胱氨酸密码子置于修饰的Rho靶蛋白-GBD的羧基末端，紧邻在终止密码子的上游。合成Rho靶蛋白-GBD序列的设计用Leto 1.0基因优化软件执行，该软件是基于一种专有权所有的遗传算法(Entelechon GmbH，St.Veit-Weg 2，93051 Regensburg，Germany)。序列设计可以使密码子用法、同源GC含量、mRNA二级结构、密码子和基序重复以及限制性位点得到优化。合成的Rho靶蛋白-GBD DNA由Entelechon GmbH在pUC18克隆载体中提供。根据制造商说明书(Promega Corp.，Madison，WI)用限制性酶BamH1和EcoR1切割该DNA，将含有修饰Rho靶蛋白-GBD的273 bp DNA片段直接克隆到表达载体pGEX-4T的BamH1和EcoR1位点中，形成在氨基末端与谷胱甘肽S转移酶标签融合、且在羧基末端含有独有的(unique)半胱氨酸残基的Rho靶蛋白-GBD域。全部分子生物学操作均根据MolecularCloning，A Laboratory Manual，1998，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress.，Ed.Sambrook等中概述的一般原则进行。
表达质粒载体骨架和纯化标签 这里描述的实施例采用表达载体pRSET-A(Invitrogen Corp.，GrandIsland，NY)，其含有一个N-末端组氨酸标签(His-tag)，和pGEX-4T(GEHealthcare(Pharmacia Inc.)，Piscataway，NJ)，其含有一个N-末端GST-标签。位于带GST-标签的构建体与感兴趣的效应物-GBD肽之间的凝血酶蛋白酶位点允许通过凝血酶切割除去GST标签。表3记载了实施例中使用的各种效应物-GBD的克隆所用的载体。表3还记载了用于效应物-GBD肽纯化的标签以及将肽连接于微量滴定板的方法。微量滴定板包被的细节在实施例2中提供。
表3效应物纯化标签和板结合标签 效应物蛋白质表达 在加有合适抗生素(典型的是50μg/ml的氨苄青霉素)的培养基(典型的是LB培养基)中培养含有表达构建体(例如表2中描述的质粒)的细菌培养物(例如BL21(DE3)或BL21)。培养物在37℃、200rpm震荡条件下生长，直到OD600达到大约0.6。为了诱导蛋白质产生，添加IPTG至0.2mM，室温下继续震荡(典型地12小时)。在诱导之前，收集少量细菌样品(典型地1ml)并保存在-20℃。在诱导之后，收集少量所述细菌的样品(典型地1ml)并保存在-20℃。通过以6,000g离心沉淀细菌收获剩余的培养物。细菌沉淀可以保存在-20℃直至加以处理。使用上面提到的1ml细菌样品通过比较诱导与未诱导的细菌沉淀中的重组蛋白质的水平来确定重组蛋白质的诱导效率，典型地，该分析通过在SDS-PAGE系统中进行蛋白的考马斯染色来实施。
效应物蛋白质纯化 将细菌沉淀重悬在裂解缓冲剂(典型地每升培养物20ml)中。用于带His标签的蛋白质的裂解缓冲剂典型地为50mM Tris pH 7.5、50mM NaCl、0.5mM MgCl2和5mM咪唑。用于带GST标签的蛋白质的裂解缓冲剂典型地为50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和2mM EDTA。使重悬的细胞通过4层粗棉布除去细胞碎片，再通过高压微射流设备(Model M-110L，Microfluidics)裂解细胞。裂解物通过60,000g离心步骤加以澄清。
带组氨酸标签的蛋白通过固定化金属亲和色谱(IMAC)(Bornhorst et al.，2000，Methods in Enzymology，326245-254)加以纯化。简而言之，将裂解物与金属螯合的珠子(典型地是镍或钴珠子，每升细菌培养物1ml珠子)共温育。将珠子/裂解物混合物在4℃温育30-60分钟。用含有10mM-30mM浓度的咪唑的清洗缓冲剂(50mM Tris pH 7.5，0.5mM NaCl)清洗珠子。在3-5珠子体积的洗脱缓冲剂(500mM咪唑，200mM NaCl，50mM Tris pH 7.5，1mM MgCl2)中洗脱重组效应物蛋白质，并保存在-70℃。
通过谷胱甘肽亲和色谱纯化带GST标签的蛋白质(Smith，2000，Methodsin Enzymology，326254-270)。简而言之，将裂解物与谷胱甘肽珠子(典型地，每升细菌培养物1ml珠子)在4℃温育1小时。然后用等体积的裂解缓冲剂清洗珠子3次，再用3-5珠子体积的洗脱缓冲剂(裂解缓冲剂加10mM还原谷胱甘肽)洗脱重组带GST标签的效应物蛋白质，并保存在-70℃。
带GST标签的效应物-GBD肽的凝血酶切割 规程遵循Meth.Enz.1995，256178中概述的程序。简而言之，将结合在谷胱甘肽珠子上的带GST标签的蛋白在加有1％Triton X-100的PBS中清洗3次，在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和2.5mM CaCl2中清洗3次。最后将珠子重悬在等体积的钙缓冲剂中。向珠子添加牛α凝血酶(Sigma)，每mg蛋白30个单位。在4℃回旋条件下进行2-5小时的切割。通过离心除去珠子，保留经过切割的蛋白质，并保存在-70℃。
沉降测定 将经修饰的GST Rho靶蛋白-GBD肽结合于谷胱甘肽珠子，将20μg结合于珠子的效应物添加到500μl(250μg)澄清的负载GTPγS或GDP的(GTPγ S or GDP loaded)血小板提取物中(裂解物制备见实施例2)。将混合物在4℃回旋温育1小时。然后将珠子在清洗缓冲剂(50mM Tris pH 7.5，100mMNaCl，和30mM MgCl2)中清洗2次，重悬在1珠子体积的SDS样品缓冲剂(75mM Tris pH 6.8、2％SDS、10％甘油、5％β-巯基乙醇和2mg/ml溴酚蓝)中，并进行SDS-PAGE(4-20％梯度)。将蛋白质转移到PVDF膜(批号IPVH304F0，Millipore，Bedford，MA)，之后用0.25μg/ml抗RhoA(批号ARH01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，0.25μg/ml抗Rac1(批号ARC01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，1μg/ml抗Cdc42(批号ACD01，CytoskeletonInc.，Denver，CO)进行Western印迹。用特异识别RhoA蛋白质的第一抗体和山羊抗小鼠第二抗体(Jackson Labs.，批号115-035-068)检测活化RhoA蛋白质条带。测定至少执行8次。
结果 效应物-GBD克隆 确证了表2所述的全部效应物-GBD cDNA序列均与公开的Genbank序列匹配。此外，也确证了ROCK1、PAK1和WASP构建体中工程化的羧基末端半胱氨酸密码子的存在。
图1B详细描述了合成Rho靶蛋白-Cys-GBD域的序列。合成的与野生型Rho靶蛋白-RBD序列的比较证实，合成构建体中全部3个内部半胱氨酸残基均被除去，并替代为谷氨酸(aa# 43)、亮氨酸(aa# 49)和丝氨酸(aa# 65)。序列分析也确证了为定向结合马来酰亚胺板的目的而引入的羧基末端半胱氨酸的存在(图1B)。利用表2中引物所记载的限制位点克隆cDNAs。野生型和修饰Rho靶蛋白-Cys-GBD的DNA和氨基酸序列。野生型和Cys突变体效应物-GBD之间的氨基酸残基改变用粗体和下划线表示。
效应物表达和纯化 典型的效应物-GBD肽纯度为70-80％，这是通过对SDS-PAGE凝胶上依分子量分离并经考马斯染色的肽进行密度扫描测定而确定的(图1A)。简而言之，将PAK1-GST(30μg)、ROCK1-His(10μg)、WASP-His(20μg)、POSH-His(20μg)、Rho靶蛋白-Cys-无标签(用凝血酶切去GST标签)(10μg)、Rho靶蛋白野生型GBD-GST(20μg)和Dia1-GST(15μg)的经过纯化的GBD域加载到SDS-PAGE上，用考马斯蓝对蛋白质凝胶染色。
效应物-GBD生物活性的确证 针对全部效应物-GBD肽，通过GST沉降(Figure 1C显示修饰Rho靶蛋白-Cys，数据未显示)或G-LISA测定(数据未显示，见实施例2)来确定效应物-GBD肽的选择性结合活化Rho蛋白质的能力。简而言之，将50μg纯化的Rho靶蛋白-Cys GBD突变体珠子与500μg负载GDP或GTPγS的血小板提取物共温育，对珠子沉淀的RhoA-GTP进行SDS-PAGE，并用抗RhoA抗体对其进行Western印迹分析。
讨论 目前Rho家族有21个成员，如Wennerberg et al，2005，J.Cell Sci.，118843-6和Schnelzer et al.，2000，Oncogene，193013-3020定义的。它们是RhoA，RhoB，RhoC，RhoD，Rnd3，Rnd1，Rnd2，Rif，RhoG，RhoH，Rac1，Rac1b，Rac2，Rac3，Cdc42，TC10，TCL，Wrch-1，Wrch-2，RhoBTB1和RhoBTB2。
本实施例使用的效应物-GBD肽的组合能够选择性结合21个Rho家族成员当中的13个，或者说全部Rho家族成员中62％的活化形式(见表1)。这包括表征最全面的Rho蛋白质，即RhoA，Rac1和Cdc42，如PubMed引用数所表明的(1996-2006年PubMed引用数RhoA(2467)，Rac1(1931)，Cdc42(2455)，RhoB(283)，RhoC(117)，RhoD(187)，Rnd3(23)，Rnd1(31)，Rnd2(15)，Rif(作为Rif小G蛋白检索)(5)，RhoG(83)，RhoH(26)，Rac2(219)，Rac3(85)，TC10(70)，TCL(作为TCL小G蛋白检索)(6)，Wrch-1(6)，Wrch-2(4)，RhoBTB1(4)，RhoBTB2(6)，Rac1b(22))。因为任何给定的效应物通常都会结合超过一种Rho GTP酶，所以针对特定内源Rho GTP酶的检测和定量的测定特异性依赖于效应物-GBD和Rho GTP酶特异性抗体的组合。使用效应物和抗体组合获得Rho GTP酶特异性，使本测定方法与其他仅利用效应物“特异性”的活性Rho GTP酶检测系统(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)相比具有优势。
在剩余的所有实施例中均将述及此处提出的效应物，然而本领域技术人员理解，这里公开的方法、测定法等同样适用于任何Rho效应物-GBD。当认为Vetter et al.，2001，Science，2941299-1304，“Effectors for GTP-bindingproteins are operationally defined as molecules interacting more tightly with theGTP-bound than with the GDP-bound form”中限定的Rho效应物的定义被本领域技术人员公认为Rho GTP酶效应物的实际定义时尤其如此。还应当理解，本发明的实施方案完全依赖于Rho GTP酶效应物的实际操作上的定义。
实施例2共价连接的效应物-GBD板在G-LISA测定中的效用 本领域中描述了许多用于将特定肽连接于微量滴定板或微阵列的化学(Dent et al.，1998，Bioconjugation，Macmillan Reference Ltd，Chapter8505-556)。在最广泛的意义上，连接可以分成共价和非共价模式。这两种连接类型在这里均有展示(见非共价连接，实施例7)。这里描述的实施例详细描述了通过马来酰亚胺活化的板进行共价连接的方法。
肽通过活化的表面基团与微量滴定板的共价连接在原子共享电子而生成化学键时发生。虽然形成这些键的反应在理论上总是可逆的，但是实际上发生逆反应的概率很低，以致可以认为产物是永久性的(Dent et al.，Bioconjugation，Macmillan Reference Ltd，1998，p.218-342)。肽连接的实质上的不可逆性，具有形成非常稳定的、不会发生生物分子的损失、置换或表面迁移的效应物-GBD基质(matrix)的潜在优势(Larsson et al.，1987，J.Immunol.Meth，98129135；Dent et al.，1998，BioconjugationProtein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences，Chapter 8，Other Categories of proteinCoupling，p.505-556)。出于这个原因，我们决定深入探讨共价连接模式(但也参见实施例7的非共价连接)。
有多种类型共价连接板化学可以用来将肽与板连接，包括但不仅限于，共价偶联伯胺基团的N-琥珀酰亚胺酯(NOS)表面(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)和与脂肪族碳-氢键反应的Univer-BINDTM板(Corning，Inc.，NY)。本实施例中描述的板化学是马来酰亚胺板，它们可商购，并设计成通过可用的-SH部分(其通常来自偶联肽内的半胱氨酸残基)来固定生物分子。马来酰亚胺活化的微量培养板的实例包括，但不仅限于，聚苯乙烯微量培养板如Costar’s巯基结合板和条(Costar’s Sulfhyryl Binding Plates and Strips，Corning，Inc.Corning，NY)，Reacti-BindTM马来酰亚胺活化板(PierceBiotechnology，Inc.Rockford，IL)，和马来酰亚胺活化微孔板--巯基-TRAPTM(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)。通过半胱氨酸残基的连接为工程化产生含有单个半胱氨酸从而可以在板上定向的肽提供了机会(见实施例1)。预计均一的效应物定向可产生重复性更高、整体变异系数更低的板(Dent et al.，1998，BioconjugationProtein Coupling Techniques forthe Biomedical Sciences，Chapter 8，Other Categories of protein Coupling，p.505-556)。
材料和方法 效应物GBD肽共价附接于马来酰亚胺板 将效应物-GBD肽(ROCK1，POSH或WASP，见表2)在包被缓冲剂(PBSpH 7.2加1mM EDTA)中稀释到最终浓度为0.05mg/ml，并将5μg肽添加到马来酰亚胺板(Corning Inc.，批号2510)的孔中。将板在21℃温育2小时，在PBS pH 7.2中清洗2次。将板在室温下用牛奶(典型地为0.1-5％，取决于效应物-GBD)封闭1小时。用PBS(pH 7.2)清洗2次后，向每个孔添加冻干缓冲剂(5％蔗糖和1％葡聚糖)，将板冻干并干燥贮存在4℃。
组成型活性重组Rho蛋白质 Rho A第63位氨基酸或者Rac1和Cdc42第61位氨基酸由谷氨酰胺突变成亮氨酸，将产生不能水解GTP而成为组成型活性的肽(Xu et al.，1994，J.Biol.Chem.，26923569-23574；and Nobes et al.，1994，Curr.Op.Gen.Dev.，477-81)。所述突变体蛋白可作为带组氨酸标签的肽商购(Cytoskeleton Inc.批号R6301(组成型活性的RhoA)、R6101(组成型活性的Rac1)和C6101(组成型活性的Cdc42)。典型地，将组成型活性蛋白质在细胞裂解缓冲剂(50mMTris pH 7.5，300mM NaCl，2％IGEPAL，0.01％SDS，和10mM MgCl2)中稀释到0.2ng/μl，一次G-LISA测定中使用1-5ng蛋白质。
体外制备负载核苷酸的细胞裂解物 可以使细胞裂解物负载GTP、GTPγS或GDP，并广泛用作标准沉降测定的对照(Knaus et al.，1992，J.Biol.Chem.，26723575-23582)。人工负载的裂解物也可为给定G-LISA测定的开发提供稳健的底物。将细胞裂解缓冲剂(50mM Tris pH 7.5，300mM NaCl，2％IGEPAL，0.01％SDS，和10mM MgCl2)中4mg/ml的人血小板提取物通过4℃ 8,000g离心3分钟进行澄清。添加EDTA至终浓度15mM。向不同等份的澄清裂解物中添加GTPγS、GTP或GDP至终浓度1mM。将每种裂解物在室温下温育15分钟，以容许向Rho蛋白质交换(加载)核苷酸。添加60mM MgCl2终止加载反应。将裂解物在细胞裂解缓冲剂中稀释至0.5mg/ml，并用于G-LISA测定。典型地，每次G-LISA测定使用7-15μg负载的血小板细胞裂解物。在本实施例中，将负载有GTP的血小板称作不稳定(labile)GTP提取物。
G-LISA测定 将活性Rho蛋白质(典型地，7-15μg总细胞裂解物或1-5ng组成型活性重组蛋白质)直接添加到结合有效应物的G-LISA板(Rac1和Cdc42G-LISAs)，或者用等体积的结合缓冲剂(20％PEG 8000，Sigma，St.Louis，MO)稀释后添加到结合有效应物的板(RhoA G-LISA)。将反应物于4℃在微量滴定板摇床上温育30分钟，之后用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％ Tween-20)清洗孔1次，并立即用200μl抗原提呈缓冲剂(1％三氯乙酸(TCA))室温处理孔2-5分钟。然后，将孔用PBST清洗3次，每次200μl，再添加第一抗体，典型地为1μg/ml(RhoA特异)、0.25μg/ml(Rac1特异)、1μg/ml(Cdc42特异)，并在室温温育45分钟(4℃温育得到相似的结果)。将孔用PBST清洗3次，每次200μl，再与合适的第二抗体在室温下温育45分钟(4℃温育得到相似的结果)。对于RhoA和Rac1反应，使用2μg/ml山羊抗小鼠第二抗体，对于RhoA，B，C反应，使用0.5μg/ml驴抗鸡第二抗体，对于Cdc42反应，使用0.5μg/ml山羊抗绵羊第二抗体。将孔用PBST每次200μl清洗3次后，利用吸光度或发光检测法来检测活化的Rho蛋白质，如下文所述。
用吸光度或发光测定法测量G-LISA测定 添加50μl OPD底物(Sigma批号P9187)，在37℃保持15分钟，随后添加50μl终止缓冲剂(1M硫酸)，之后用分光光度计(SpectraMax 250，Molecular Devices)测量OD490的吸光度。添加50μl lumigen试剂(LumigenInc.，批号PSA-100)，典型地设置为100-150增益和10-100ms积分，用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)测量发光。
抗体 在本实施例中用于G-LISA测定的第一抗体和第二抗体，以及当在其他实施例中被提及用于G-LISA测定时的第一抗体和第二抗体，是下列抗体抗-RhoA(批号BK124中的克隆384或Part#GL01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，抗-RhoA，B，C(批号BK120中的克隆419或Part#GL04)，抗-Rac1(批号BK122h中的Part# GL06，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，抗-Cdc42(批号ACD02，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，山羊抗小鼠和驴抗绵羊抗体(批号115-035-068和313-005-045，Jackson ImmunoResearch labs.Inc.，West Grove，PA)。
结果 效应物-GBD马来酰亚胺板对于检测特异性Rho GTP酶的效用 对于给定的Rho GTP酶的细胞水平，已公开的估计值典型地为每个细胞1 x 10-4ng的范围(2003，J.Immunol.，1705652-5657；和Quinn et al.，1993，J.Biol.Chem.，26820983-20987)。而且，根据公开的数据可以假定，一种特定Rho GTP酶中典型地有大约2-10％会响应于任何特定的刺激而活化(Ren etal.，1999，EMBO J.，18578-585；Bernard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；和Werner et al.，2002，J.Cell Biol.，158357-368)。进一步，根据公开的数据，一个标准沉降测定典型地需要1 x 106-1 x 107个细胞或300-800μg总细胞蛋白(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272；和Werner et al.，2002，J.Cell Biol.，158357-368)，这个量的裂解物相当于大约100-1000ng的特定Rho蛋白质(活化和非活化构象合起来)。因此，假定有2-10％的特定Rho GTP酶响应于特定刺激而活化，则在标准沉降测定中关注相应于2-100ng范围的活化RhoGTP酶的信号。
考虑到上面的计算，使用5ng重组组成型活性Rho GTP酶进行G-LISA初始试验。该蛋白量被认为接近于沉降测定的较低检测水平(lower levels ofdetection)，并且，由于希望最终使用的细胞裂解物远少于300-800μg，所以应设计初始试验以获得相当严格的检测水平。使用组成型活性形式的RhoGTP酶是初始试验的合理选择，因为它们是明确且易于解释的系统。
典型地，Rho效应物与活化Rho蛋白质的多于一种同型(isotype)结合(见实施例1，表1)。例如，ROCK1(和ROCK1-GBD)识别RhoA、RhoB和RhoC以及RhoE/Rnd3的活化形式(Fujisawa，1996，J.Biol.Chem.，27123022；和Riento et al.，2003，Mol.Cell.Biol.，234219)。因此，特定G-LISA测定的特异性取决于效应物和抗体二者的选择。所以，在一个ROCK1-GBD板的实例中(图2A)，RhoA特异性是通过组合使用ROCK-GBD板与RhoA特异抗体(克隆384)来提供的。
参考图2A，按照“材料和方法”中的详述，对仅裂解缓冲剂(空白)，5ng RhoA(63L)、Cdc42(61L)或Rac1(61L)进行RhoA G-LISA测定，并按照“材料和方法”中描述的发光测定法(luminometry)检测RhoA信号。图2A显示，组合使用ROCK1-GBD马来酰亚胺板(ROCK板)和RhoA特异抗体(克隆384)，以5ng组成型活性RhoA产生的信号是背景(仅缓冲剂)的6倍高。对于该板，组成型活性Cdc42和Rac1未产生高于背景的信号。因此可以得出结论，该ROCK1-GBD板能够结合活性RhoA，且该RhoA抗体能够特异地检测到高于背景的该水平的蛋白质。抗体384对RhoA特异，如图7A所证实的。经测试，Rho靶蛋白-Cys效应物-GBD选择性结合RhoA。这种经修饰地效应物-GBD对于组成型活性RhoA所产生信号是背景的6倍高(数据未显示)。
参考图2B，按照“材料和方法”中的详述(实施例2)，对仅裂解缓冲剂(空白)，5ng Rac1(61L)或RhoA(63L)进行Rac1G-LISA测定，并按照“材料和方法”中的描述，通过490nm吸光度来检测Rac1信号(实施例2)。类似地，图2B显示，组合使用Rac1特异性抗体(GL06，批号BK122h)和结合POSH的马来酰亚胺板(POSH板)，以5ng组成型活性Rac1给出的信号是背景的9倍高。正如预期的那样，组成型活性RhoA给出的信号几乎不高于背景。
参考图2C，按照材料和方法中的详述对仅裂解缓冲剂(空白)，5ngCdc42(61L)或Rac1(61L)进行Cdc42G-LISA测定(实施例2)，并按照如材料和方法中的描述通过490nm吸光度来检测Cdc42信号(实施例2)。图2C显示，与Cdc42特异抗体(批号ACD02，Cytoskeleon Inc.，Denver，CO)组合使用的WASP结合马来酰亚胺板(POSH板)对5ng组成型活化Cdc42发出的信号是背景的5倍。正如预期，组成型活化Rac1给出的信号不高于背景。
总之，图2中的数据证明，连接马来酰亚胺的效应物-GBD保持识别其靶标活性Rho GTP酶的能力。而且，与合适的抗体组合后，能够检测低纳克水平的特定活性Rho GTP酶。
效应物-GBD马来酰亚胺板对于区分活化和非活化Rho GTP酶的效用 G-LISA不但应该检测特定的活化Rho GTP酶，它们还必须能够区分特定Rho蛋白质的活化(GTP结合)和非活化(GDP结合)状态。使用人工负载的血小板提取物，对效应物-GBD马来酰亚胺板进行了测试(详见“材料和方法”)。本实施例中的人工负载提取物的内源GTP酶已经在体外被加载了GTPγS(一种可缓慢水解的GTP类似物)或GDP。因为GTPγS是基本上不可水解的，所以来自活化样品的信号非常稳定。这与正常的细胞裂解物相反，在正常细胞裂解物中，Rho GTP酶容易发生由GTP酶活化蛋白(GAP)增强的GTP水解并因此失活(Moon et al，2003，Trends Cell Biol.，1313-22)。本领域技术人员公认，在需要稳健的Rho活化(典型地>10％活化)同时有限地涉及Rho水解的场合，含有人工负载的固定活化状态的内源Rho蛋白质的裂解物是有用的(Liseti et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
参考图3A，将仅裂解缓冲剂、25μl GDP或GTPγS标记的血小板提取物(0.5mg/ml)(或15μg)与相同体积的结合缓冲剂混合，并进行标准RhoAG-LISA测定。按照“材料和方法”所述通过发光测定法检测RhoA信号。使用ROCK-GBD马来酰亚胺板。结果显示，ROCK板的结合性质使得清晰区分活性RhoA(GTPγS)和非活性(GDP)RhoA成为可能，在此测定中活性RhoA的信号是非活性RhoA的7倍高。
参考图3B，按照“材料和方法”中的详细叙述，对50μl的仅裂解缓冲剂，GDP或GTPγS标记的血小板提取物(0.5mg/ml)(或15μg)进行Rac1G-LISA测定。按照“材料和方法”所述通过490nm吸光度检测Rac1信号。使用POSH-GBD马来酰亚胺板。结果显示，POSH板的结合性质使得清晰地区分活性Rac1(GTPγS)和非活性(GDP)Rac1成为可能，在此测定中活性Rac1的信号是非活性Rac1的30倍高。
总之，图3中的数据表明，马来酰亚胺连接的效应物-GBD保持了区分特定Rho GTP酶的活性形式与非活性形式的能力。而且，活性Rho GTP酶信号可以利用基于发光测定法(图2A)或吸光度(图2B)的方法加以检测。
实施例3用于G-LISA的抗原提呈缓冲剂的开发 最初尝试在RhoA:ROCK和Rac1:POSH G-LISA测定中检测活性RhoGTP酶没有成功，因为无法获得在这两种测试的任一种中显著高于背景的信号(图5A(未处理)和5B(无APB))。最初的一种策略是按照与原本的沉降测定法基本上类似的规程来开发基于ELISA的测定法，其中原本的沉降测定法是Benard等描述的用于Rac1:PAK沉降测定(1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)的沉降测定法，以及Ren等和Kranenburg等描述的用于RhoA:Rho靶蛋白沉降测定的沉降测定法(分别为1999，EMBO J.，18578；和1999，Mol.Biol.Cell，101851-1857)。相同的程序还被用于利用ROCK、Citron、Dia和WASP的沉降测定(Kimura et al.，2000，J.Biol.Chem.，27517233-17236，和Edlund et al.，2002，Mol.Biol.Cell，13902-914)。简而言之，用效应物包被马来酰亚胺板，将溶于标准沉降裂解缓冲剂(对于RhoA测定是50mM Tris，pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，500mM NaCl，10mM MgCl2；对于Rac1和Cdc42是50mM Tris，pH 7.5，10mMMgCl2，200mM NaCl，1％Nonidet P-40，5％甘油)中的活性Rho GTP酶导入孔内，并在4℃震荡(400rpm)温育1小时，然后用标准沉降清洗缓冲剂(对于RhoA测定是50mM Tris，pH 7.2，1％Triton X-100，150mM NaCl，10mMMgCl2；对于Rac1是25mM Tris，pH 7.6，1mM DTT，30mM MgCl2，40mMNaCl，1％Nonidet P-40)清洗孔，分别用Rho GTP酶特异性第一抗体(对于RhoA是批号ARH01，Cytoskeleton Inc.，对于Rac1是批号ARC01，Cytoskeleton Inc.)和抗小鼠或抗兔第二抗体(Jackson Labs)对反应物进行显色。在TBST中清洗3次后，利用吸光度或发光检测对反应物进行显色。添加50μl OPD底物(Sigma批号P9187)在37℃保持15分钟，随后添加50μl终止缓冲剂(1M硫酸)，再用分光光度计(SpectraMax 250，Molecular Devices)测量OD490吸光度。添加50μl lumigen试剂(Lumigen Inc.，批号PSA-100)后用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)测量发光，典型的设置是100-150增益和10-100ms积分。应当注意，使用了基于ELISA的抗体浓度优化的标准棋盘滴定(Crowther，2001，Meth.Mol.Biol.，14983-113)。此外，这些G-LISA测定中使用的抗体已被证明在沉降测定中工作非常良好(它们是CytoskeletonPull-Down Assay Kits，批号BK034(Cdc42)，BK035(Rac1)和BK036(RhoA)中的组分)。还对各种阻断剂、反应缓冲剂、温育温度和抗体稀释缓冲剂进行了广泛的试验。G-LISA不能在已应用于所有沉降测定的标准条件下工作，表明这两种测定模式之间存在一种或多种根本性的差异。
不受限于任何特定的理论，G-LISA方法在标准沉降条件下失败的一个可能的原因，可能是使用了极低浓度的与板结合的效应物——这将在下一个实施例中(在G-LISA中使用结合缓冲剂)加以讨论。还有可能是，在沉降测定的Western印迹分析中能够识别信号的抗体在G-LISA模式中不能识别Rho GTP酶——这种可能性在实施例5中(用于G-LISA测定的优化抗体的开发)加以讨论。还有一种可能，同时也是本实施例在这里讨论的主题，是G-LISA效应物GTP酶复合体在G-LISA测定的温育过程中被损失。
沉降测定用结合了效应物的珠子或盘来捕获活性Rho GTP酶，经过清洗步骤后，必须将活性Rho GTP酶从珠子上洗脱下来，以便通过Western印迹检测加以分析(Benard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；Renet al.，1999，EMBO J.，18578；Kranenburg at al.，1999，Mol.Biol.Cell，101851-1857；和Sun et al.，2006，Microcirculation，13237-247)。Rho GTP酶沉降测定与G-LISA测定之间的一个主要差异是，G-LISA测定依赖于在整个测定中与结合效应物的固体支持基质(例如但不限于微量滴定板)联结的Rho GTP酶。本文公开的实施例中的实验的一个目的是a)确定在整个G-LISA中是否有GTP酶从固体基质的任何解离，和b)如果有需要，确定防止Rho GTP酶损失的方法，从而为Rho GTP酶活化获取定量的结果。
材料和方法 G-LISARho GTP酶效应物结合的Western分析 使用组成型活性RhoA GTP酶蛋白质(R63)和能够水解GTP的GTP负载血小板提取物来检查效应物GTP酶的随时间的解离。G-LISA测定如下进行将R63蛋白质(每个测定10ng)或GTP负载血小板提取物(25μg)与结合于马来酰亚胺板的ROCK-GBD效应物共温育，温育在4℃、400rpm震荡下进行30分钟。用200μl TBST清洗反应物2次以除去未结合的Rho GTP酶。此时，用SDS缓冲剂(5％SDS，63mM Tris pH 6.8，5％巯基乙醇，10％甘油)从数个孔洗脱样品，合并用于后面的western分析。将剩余的反应物在第一抗RhoA抗体(克隆384)中室温400rpm震荡下温育45分钟。在TBST中清洗3次后，如上所述地用SDS缓冲剂洗脱数个孔内的样品并保存用于后面的分析。剩余的反应物在第二抗鸡抗体中室温400rpm震荡温育45分钟。在TBST中清洗3次后，如上所述地从数个孔将样品洗脱在SDS缓冲剂中并保存用于后面的分析。使用抗RhoA的小鼠单克隆抗体进行Western分析。
Rho抗原提呈缓冲剂试验 用等体积的结合缓冲剂(20％ PEG 8000，Sigma，St.Louis，MO)稀释负载有GTPγS或GDP核苷酸的血小板细胞裂解物(每个测定10μg总细胞裂解物)，然后加到ROCK效应物结合板中。将反应物于4℃在微量滴定板摇床温育30分钟，之后用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％ Tween-20)清洗孔1次，并立即用如下的化学/物理处理之一进行处理在200μl PBS存在下微波3分钟；干燥微波3分钟；在200μl 8M尿素存在下微波3分钟；200μl甲醇2分钟；200μl乙醇2分钟；200μl 0.5％ SDS 2分钟，室温下200μl 10％三氯乙酸(TCA)2分钟。然后将孔用PBST清洗3次，每次200μl，再添加RhoA第一抗体(B384)至1μg/ml，室温温育45分钟。将孔用PBST清洗3次，每次200μl，再与抗小鼠第二抗体(Jackson Labs)室温温育45分钟。将孔每次用200μl PBST清洗3次后，用发光检测法检测活化Rho蛋白质。发光是在添加50μl lumigen试剂(Lumigen Inc.，批号PSA-100)后，用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)进行测量的。
TCA在Rac1G-LISA中益处的测试 将溶于细胞裂解缓冲剂中的组成型活性重组Rac1(5ng)，或者仅细胞裂解缓冲剂，直接添加到POSH效应物结合G-LISA板上。将反应物于4℃在微量滴定板摇床上温育30分钟，之后用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％Tween-20)清洗孔1次，并立即在室温下用200μl抗原提呈缓冲剂(1％三氯乙酸(TCA))处理2-5分钟。然后将孔用PBST清洗3次，每次200μl，并添加第一Rac1抗体至1μg/ml，在室温下温育45分钟。将孔用PBST清洗3次，每次200μl，然后在室温下与抗小鼠第二抗体温育45分钟。将孔用200μl PBST清洗3次后，用吸光度检测法来检测活化的Rho蛋白质。吸光度的测量如下添加50μl OPD底物(Sigma批号P9187)，在37℃保持15分钟，然后添加50μl终止缓冲剂(1M硫酸)，用分光光度计(SpectraMax 250，Molecular Devices)测量OD490。
结果 为了检查在允许GTP水解的系统中GTP酶与效应物的解离，在ROCK包被的马来酰亚胺板中对25μl GTP标记的血小板提取物(2mg/ml)进行了标准RhoA G-LISA。在G-LISA测定的不同阶段用SDS缓冲剂洗脱结合的活化RhoA。在G-LISA测定的不同阶段(在ROCK板中温育30分钟后(泳道1)，第一抗体温育45分钟后(泳道2)，第二抗体温育90分钟后(泳道3))用SDS缓冲剂洗脱结合的RhoA。然后对洗脱的Rho进行SDS-PAGE，并用抗RhoA抗体进行Western印迹。为了检查在不允许GTP水解的系统中GTP酶与效应物的解离，对10ng RhoA(63L)进行标准RhoA G-LISA。在G-LISA测定的不同阶段(在ROCK板中温育30分钟后(泳道4)，第一抗体温育45分钟后(泳道5)，第二抗体温育90分钟后(泳道6))用SDS缓冲剂洗脱结合的RhoA(63L)。然后对洗脱的Rho进行SDS-PAGE，并用抗RhoA抗体进行Western印迹。上图和下图相同，只是显影底片的曝光长度不同。较短的曝光允许更加定量地观察63L信号，而较长的曝光更宜于观察内源RhoA样品中的信号损失。由于63L上存在His标签，63L重组组成型活性RhoA蛋白质比内源RhoA上行更高。
图4的结果显示，来自水解缺陷突变体RhoA蛋白质(L63)的活性RhoA信号在第一抗体温育后减少10％(图4，比较泳道4和5)，在第二抗体温育结束时减少40％(图4，比较泳道4和6)。负载GTP的RhoA样品的信号在第一抗体温育后降低60％(图4，比较泳道1和2)，在第二抗体温育后降低>90％(图4，比较泳道1和3)。GTP样品中信号损失的增强很可能是由于测定期间的GTP酶水解(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359)。在这点上，负载有GTP的血小板提取物的信号随时间的损失也显著高于负载有非可水解GTPgS的血小板样品(数据未显示)。综合考虑，该数据强烈支持这一点，即该测定中的RhoA信号损失是简单解离和由GTP水解所致的RhoA失活引起的解离二者所造成的。在这点上，尝试了通过在4℃进行抗体温育和使所有缓冲剂保持在4℃来减慢解离，但未能改善测定的信噪比(数据未显示)。
总之，需要开发防止或使反应中GTP酶的损失最小化的测定条件。
我们对数种抗原复合物稳定性物理(热变性)和/或化学处理进行了评估。在初始研究中，我们选择了交联剂如戊二醛，蛋白沉淀试剂如甲醇、乙醇和三氯乙酸(TCA)，离液剂如尿素，和变性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)。
参考图5A，对仅裂解缓冲剂(未处理)、15μg GDP-或GTPγS-标记血小板提取物进行了RhoA G-LISA测定。在温育提取物后，用MW+PBS，MW/干燥，MW/8M尿素，甲醇，乙醇，0.5％ SDS，10％TCA对板进行处理或不处理，然后进行抗体温育和发光检测。MW＝5分钟微波处理。白色条形显示GDP信号，灰色条形显示GTPγS信号。参考图5B，对仅裂解缓冲剂(空白)或5ng Rac1(61L)按照“材料和方法”中所述进行Rac1 G-LISA测定，只是测定使用或者不使用抗原提呈缓冲剂处理(分别为“1％TCA”或“无APB”)，按照“材料和方法”中所述通过490nm吸光度检测Rac1信号。
我们发现，数种化学和/或物理处理，例如在8M尿素存在下组合使用微波(热变性)，显著地改善了G-LISA测定中活性RhoA蛋白质的检测(MW+尿素8M，图5A)。在PBS中微波产生的GTPγS结合信号大大增加。然而，高cv值是这种方法的一个问题(MW+PBS，图5A)。无缓冲剂存在下微波，GTPγS和GDP样品间的区分较差(MW+干燥，图5A)。在所测试的其它处理方法中，戊二醛(数据未显示)和乙醇对于活性RhoA给出高于背景的持续正信号(图5A)。用甲醇或0.5％SDS处理对活性RhoA则没有给出任何高于背景的显著信号。用200μl 10％TCA在室温下将板处理2分钟，给出的GDPRhoA信号是GTPγS RhoA信号的大约8倍高(10％ TCA，图5A)。
通过进一步的研究，我们发现，在所测试的包括乙酸(数据未显示)在内的数种酸性条件中，用1％ TCA在室温下将效应物GTP酶复合物(清洗之后)处理2分钟是用于RhoA:ROCK和Rac1:POSH G-LISA测定的抗原提呈缓冲剂处理的合适选择。图5B中显示了抗原提呈缓冲剂在Rac1:POSH G-LISA中的益处。在抗原提呈缓冲剂中温育2分钟，产生7倍于背景的组成型活性Rac1(5ng)的信号。省略抗原提呈缓冲剂则导致测定法不能检测到高于背景(仅细胞裂解缓冲剂)的活性Rac1。
讨论 在测试的所有G-LISA模式中均发现在抗体温育期间有信号损失发生，然而损失的程度随被分析的效应物GTP酶对而有所不同。例如，当不存在TCA时，RhoA:ROCK，Rac1:POSH，Rac1:PAK1(图9)损失>80％的信号，而Rho-Dia1仅损失大约50％，Cdc42:WASP的信号仅损失20％(数据未显示)。Rho效应物-GBD肽可显著减慢Rho蛋白质GTP水解的本征速率，但并不阻止该过程(Leonard et al.，1997，Biochem.，361173-1180；和Bernard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)。因此，GTP酶解离发生的程度取决于，除了其他因素之外，特定效应物对其活性GTP酶靶标的亲和力，以及效应物防止其GTP酶靶标的GTP水解的能力。
预计可提高Rho GTP酶信号损失的另一个因素是GTP酶的高本征水解速率。在这点上，Ras GTP酶的GTP水解本征速率大大低于Rho GTP酶(Nealet al.，1989，J.Biol.Chem.，26110963；和Self et al.，1995，Meth.Enz.，25667-76)。因此，对于基于Ras的G-LISA测定而言，水解造成的信号损失问题可能不会这么大。例如，公开的Rac1:PAK和Ras:Raf1的亲和力均大约为20nM。因此，可以预知，尽管效应物亲和力相似，Ras测定对于抗原提呈缓冲剂的依赖性，将大大低于明显受益于该步骤的Rac1:PAK测定(图9)。
我们测试了数种化学和物理处理降低Rho GTP酶损失的能力。尽管其中的许多处理，例如8M尿素结合热处理，提供了更高的信号，但是发现，用1％(60mM)TCA在室温下对复合物处理2分钟，似乎是复合物稳定化的合适方法。
我们用多种效应物GTP酶组合，包括RhoA:Rho靶蛋白、RhoA:Dia1、RhoA:ROCK、Rac1:PAK和Rac1:POSH，对TCA处理进行了测试。在测试的全部实例中，TCA处理均提高了信号。一些G-LISA，例如RhoA:ROCK和Rac1:POSH(图5A和5B)，显示对TCA抗原提呈缓冲剂有很大益处，而其他的G-LISA，例如RhoA:Dia1，在用TCA处理时则给出更高的RhoA信号(数据未显示)。还发现抗原提呈缓冲剂对于采用PAK-GST和Rho靶蛋白-GST非共价板的G-LISA测定同样具有益处(见图9，和数据未显示)。这表明，Rho GTP酶损失不大可能受到特定板化学的影响，因此可能是G-LISA测定模式的一个普遍特征。
这里的发现预示，通过抗原提呈缓冲剂或类似物处理降低Rho GTP酶从G-LISA固体支持物上的损失，在开发任何特定的Rho G-LISA测定的过程中均为一项重要参数。就该方面而言，解离具有时间依赖性，这一事实也可以在任何效应物Rho G-LISA测定的通用开发方案中加以利用。例如，90分钟温育后的解离(对于组成型活化RhoA是40％，对于野生型RhoA是90％)显著大于45分钟温育后的解离(分别为10％和60％)这一事实，可能提示人们采用这样的方案利用偶联HRP的第一抗体等来最大程度地缩短测定时间。采用这种方案，有可能减少或者不再需要抗原提呈缓冲剂的存在。因此，本领域技术人员可有效地利用这里公开的信息设计任何Rho G-LISA测定。
实施例4在G-LISA中使用结合缓冲剂 正如在前面实施例中提到的，简单地将沉降测定改造适用于ELISA型系统时，G-LISA测定不能工作。在此我们推断，低水平的效应物(<1μg)和蛋白裂解物(6-15μg总裂解物)可能低于效应物GTP酶结合所需的临界浓度。因此，引入能够提高蛋白蛋白相互作用的化合物或试剂有可能将结合平衡推向有利于效应物GTP酶复合物的形成。因此，测试了蛋白蛋白相互作用增强剂，例如聚乙二醇(polyethyethylene glycol)等，在G-LISA反应中的作用(Kozer et al.，2004，J.Mol.Biol.，336763-740；和Ingham，1990，Meth.Enz.，182301-306)。
材料和方法 活化细胞裂解物的制备 在补充有10％胎牛血清的DMEM中培养Swiss 3T3细胞直到50％汇合。然后对它们血清饥饿24小时，再根据实施例8中的详细说明，用100μg/ml钙蛋白酶抑制剂处理30分钟以活化RhoA。根据实施例8中的详细说明用EGF处理HeLa细胞2分钟以活化Rac1。
结果 在本实施例中，评估了向RhoA和Rac1 G-LISA中添加渐增剂量的PEG8000的效果。在RhoA的情形，发现渐增剂量的PEG(最终浓度0-10％)可使获自钙蛋白酶抑制剂处理的Swiss 3T3细胞的活性RhoA信号提高超过一个数量级(图6B，0％PEG比10％PEG)。
参考图6A，将25μl血清饥饿的或钙蛋白酶抑制剂处理(RhoA活化)的Swiss 3T3细胞裂解物(0.5mg/ml)在存在(+)或不存在(-)结合缓冲剂(10％PEG 8000，最终浓度)的条件下在室温水浴中温育0，10或30分钟。然后在ROCK马来酰亚胺板中对样品进行标准RhoA G-LISA测定，通过读取490nm的吸光度进行定量。SS是血清饥饿样品(白色条形)，钙蛋白酶抑制剂标记的RhoA诱导样品(灰色条形)。参考图6B，将25μl血清饥饿的或钙蛋白酶抑制剂处理(RhoA活化)的Swiss 3T3细胞裂解物(0.5mg/ml)用等体积的0％、5％、10％、15％或20％PEG 8000稀释，并立即在ROCK马来酰亚胺板中对样品进行标准RhoA G-LISA测定，样品通过阅读490nm的吸光度加以定量。SS是血清饥饿样品(白色条形)，钙蛋白酶抑制剂标记的RhoA诱导样品(灰色条形)。参考图6C，将25μl血清饥饿的或EGF处理(Rac1活化)的Hela细胞裂解物(1mg/ml)用等体积的0％，5％，10％，15％或20％PEG8000稀释，并立即在POSH马来酰亚胺板中对样品进行标准Rac1G-LISA测定。样品通过读取490nm的吸光度加以定量。SS是血清饥饿样品(白色条形)，EGF标记的Rac1诱导样品(灰色条形)。在所有情况下，AU＝吸光度单位，全部读数均减去了仅缓冲剂的背景。
Rho蛋白质在裂解物中非常不稳定，这是因为存在有大量快速水解Rho蛋白质的GTP酶活化蛋白(GAPs)(Moon et al.，2003，Trends Cell Biol.，1313-22)。因此本领域技术人员可能认为，向含有活性Rho蛋白的裂解物中添加蛋白蛋白相互作用增强剂，更有可能会通过增强Rho:GAP相互作用而增强GTP的快速水解，而不是增强Rho效应物相互作用(Ren et al.，1999，EMBO J.，18578)。令人吃惊的是，这里发现，添加PEG等在室温下10分钟后对RhoA信号的影响并不显著(图6A，+/-10分钟)，室温30分钟后仅造成RhoA信号微小的损失(图6A，+/-30分钟)。图6A中活化RhoA信号随时间逐渐降低是由于GTP水解导致RhoA失活的结果(Benard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)。因此，在RhoA G-LISA中，引入PEG“结合缓冲剂”的步骤有利于产生高度稳健的来自活化RhoA的信号。PEG结合缓冲剂对RhoA G-LISA测定(使用His-ROCK1板)的益处已经在数种不同的细胞系中得到证实，例如3T3细胞、HeLa细胞、Jurkat细胞和MDCK细胞(数据未显示)。
在Rac1的情况下，发现G-LISA测定中逐渐增加的PEG量(最终浓度从0到10％)与活性Rac1信号的降低相关(图6C)。因此，在该情况下，PEG似乎对G-LISA信号有负作用。有人假设这是由于Rac GAP蛋白浓度增加导致活性Rac1上GTP的水解增强造成的。在这点上，已有报道说Rac1的GTP水解本征速度和与GAPs的亲和力均比RhoA高(Liget et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
讨论 引入PEG结合缓冲剂或类似物对给定G-LISA测定的改善或抑制程度，可能取决于多个交杂的参数。这包括结合缓冲剂对特定Rho蛋白的GAP活化GTP水解的作用，特定效应物-GBD对特定活性Rho蛋白的结合常数，和每个孔结合效应物的量。
实施例5用于G-LISA测定的优化抗体的开发 如前面的实施例中提到的，最初在G-LISA测定中实现活化与非活化Rho GTP酶蛋白质之间的差异信号的尝试没有产生阳性结果。先前，通过对从G-LISA板的汇集孔洗脱出的蛋白质进行Western印迹分析确定，效应物-GBD板能够捕获组成型活性Rho GTP酶(见图4)。这促进了用于产生G-LISA优化的单克隆抗体的筛选策略的提出。下面的实施例描述了一种RhoA特异性抗体(克隆384)和一种Rho A，B，C特异性抗体(克隆419)的开发。
材料和方法 RhoA和RhoA，B，C特异抗体的开发如下合成Rho肽(CDEHTRRELAKMKQEPVKPEEGRD；SEQ ID NO110)(Bachem Inc.，Kingof Prussia，PA)，并根据制造商的使用说明，利用Imject试剂盒(Pierce，Rockford，IL 61105；批号0077610)与KLH偶联。根据制造商的使用说明，使用Ellman’s试剂测量游离半胱氨酸(Sigma，St.Louis，MO，批号D8130)，来确定KLH-肽偶联的效率。用50μg KLH偶联肽免疫6周龄小鼠(BALB/c)。随后间隔约10-15天进行注射。用标准ELISA测定和Western印迹测定对血液进行重组RhoA(批号RH01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)测试之后，选择候选小鼠，并静脉内给予盐水溶液进行最后的加强免疫。3天后处死小鼠。将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过ELISA测定抗RhoA和RhoC肽，Western印迹测定抗RhoA、RhoB、RhoC肽和血小板提取物，以及在G-LISA测定中选择杂交瘤细胞。在G-LISA筛选中使用负载GDP或GTPγS的血小板裂解产物(实施例2中描述的方法)。负载GTPγS的Rho信号高于负载GDP的Rho表明抗体在G-LISA测定中可能有用。通过在下列文献中概述的标准程序产生克隆和纯化抗体Harlow and Lane，1988，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。
第二抗体，山羊抗小鼠，从Jackson Immunoresearch Labs.，West Grove，PA(批号115-035-068)获得。
结果 在三种不同的测定中筛选杂交瘤标准ELISA测定，标准Western印迹测定，和Rho G-LISA测定。结果如下文和图7A和7B所示。参考图7A，通过Western印迹对每种抗体(克隆248，362，384，419，465，505，591，603，621，660，733，942，957，977，979，1019，1157，1164，1281，和1324)的标准化稀释物(1:500)进行分析。使用重组Rho A、B和C样品(每个50ng)和20μg血小板提取物作为样品，分析抗体特异性和相对灵敏度(Western分级)。以1:10,000的稀释度使用山羊抗小鼠第二抗体。用化学发光检测(Pierce westDura)对印迹进行显影。将来自血小板提取物的最强信号评为等级#1，最低的评为等级10th，N＝在所用条件下没有信号。用重组RhoA或RhoC包被标准吸光度ELISA板，并按照标准的基于吸光度的测定法针对两种抗原测试上述抗体，如下列文献中的描述AntibodiesA Laboratory Manual，Ed.Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Press，1988，第六章，174-194。将对RhoA具有最强ELISA信号的抗体评级为最高。对于G-LISA测定，在标准RhoA G-LISA测定中用抗体检测来自ROCK马来酰亚胺板上12.5μg负载GDP或GTPγS的血小板提取物的信号。所有抗体仅以1:500稀释度进行测试，抗小鼠第二抗体以1μg/ml的终浓度使用。将给出最高的GTPγS对GDP比值的抗体评级为最高。参考图7B，显示了按照图7A的描述产生的原始数据。
克隆362和621给出了最强的ELISA信号，而克隆1157给出的最弱。抗体特异性也可通过这种筛选加以确定，例如克隆362和621在RhoA和RhoC ELISA中均强烈反应，而克隆384和465是RhoA特异的。
Western印迹筛选使用RhoA、RhoB和RhoC重组蛋白和血小板提取物作为抗体组(panel)的潜在靶标。根据从血小板提取物产生的RhoA或RhoA，B，C信号，对图7A中的克隆加以评级。例如，克隆979给出的信号最强(密度测定)，而克隆248，362，384，465，660，733，942，977，1019，1281和1324在血小板提取物中没有给出可检测到的信号。所有的克隆(除克隆1157外)在Western印迹分析中均与一种或多种重组Rho蛋白给出了信号，用该数据来确定Rho特异性(图7A)。
G-LISA测定比较来自负载GDP(非活性Rho)样品和负载GTPγS(活性Rho)样品的Rho信号。根据GTPγS对GDP信号的比值对克隆进行评级，认为比值越高，抗体的希望越大，因此获得的级别相应较高。因此，如图7A所详示的，克隆384在G-LISA测定中评级为第一，其GTPγS与GDP比值为50，而克隆1164等级为第二十，比值为0.7。
讨论 在本开发过程中发现，在Western印迹或ELISA测定中的强反应性，并不预示抗体将在G-LISA测定中良好地工作(图7A和7B)。例如，在20个杂交瘤的G-LISA筛选中表现最好的两种抗体(分别为克隆384和419)，在ELISA测定中仅在20个中排第6和第8。尤其值得注意的是，被预测在沉降测定中工作良好的抗体，也就是在western筛选中评级较高那些的抗体，在G-LISA测定中一般没有良好工作。事实上，来自G-LISA筛选的表现最好的抗体(克隆384)，在使用血小板提取物的Western印迹筛选中没有给出可检测到的信号(图7A)。类似地，在ELISA测定中评级最高的抗体(克隆362和621)在G-LISA测定中表现非常差，在20个中仅排第16和第18(图7A)。
实施例6在G-LISA测定中使用未澄清的裂解物 为了使G-LISA测定在高通量应用中更便于用户使用，人们希望省去澄清步骤，因为这个步骤非常麻烦且不适于HTS模式。在沉降测定的场合，澄清步骤是必要的，因为在清洗步骤中不能清除细胞碎片(珠子会和碎片一起离心沉淀)。同样在沉降测定中，为了进行SDS-PAGE而添加SDS凝胶上样缓冲剂，会产生高度粘稠的样品(由于DNA释放)，使得样品不易处理且western定量困难。基于微量滴定板的测定，例如G-LISA，将不会受到这些缺点的困扰，将能够通过简单的清洗步骤除去细胞碎片。
参考图8，将25μl血清饥饿的或钙蛋白酶抑制剂处理(RhoA活化)的细胞裂解物(0.5mg/ml)直接使用(“未澄清样品”)，或者4℃、8,000rpm离心澄清5分钟(“澄清样品”)。将裂解物立即在ROCK马来酰亚胺板上进行标准RhoA G-LISA测定。按照“材料和方法”中所述，通过读取发光度对样品进行定量。ALU＝任意光单位。所有的读数均减去了仅缓冲剂的背景。
结果 按照“材料和方法”(实施例8)中的概述制备了钙蛋白酶抑制剂处理的和血清饥饿的Swiss 3T3细胞裂解物。取每种裂解物的一半进行澄清，另一半保持未澄清。将全部4种样品同时在一个RhoA G-LISA测定中进行分析(按照实施例2中的概述)。图8的结果清晰地显示，未澄清裂解物产生的活化信号与澄清裂解物相似。
讨论 澄清步骤的需要是沉降测定规程的一个不可或缺的部分(Ren.et al.，1999，EMBO J.，18578-585；Benard.et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；Leung et al.，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10215207-15212；Kimura et al.，2000，J.Biol.Chem.，27517233-17236；Kranenburg et al.，1999，Mol.Biol.Cell，61851-1857；Vouret-Craviari et al.，2002，J.Cell Sci.，1152475-2484；和Subauste et al.，2000，J.Biol.Chem.，2759725-9733)。进行无澄清的沉降测定的尝试结果导致非特异性细胞碎片——例如细胞核和相关蛋白——的积累。由于在此测定中细胞碎片和/或相关蛋白不能与效应物GTP酶复合物分离，样品很可能混有非活性GTP酶。进一步地，尝试省略沉降测定中的澄清步骤将导致在SDS-PAGE和western测定之前添加SDS上样缓冲剂时产生高度粘稠的物料。这种高粘度是细胞核裂解和核酸释放所致。这导致SDS-PAGE上样不均匀，结果使得western定量结果变异很大。通过例如DNA酶处理或剪切力可以降低黏度，但操作增加使测定更加复杂，并增加样品间的变异性的可能。更进一步地，在沉降测定中必须引入澄清步骤，导致在GTP酶对GTP水解高度敏感的时刻(也就是，在效应物添加之前)增加了额外的处理步骤。具有高本征水解速度RhoGTP酶，例如Rac和Cdc42 GTP酶，都特别容易受这个潜在问题的影响(Ligeti et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
因此，G-LISA测定能够省去澄清步骤，相对于沉降测定而言是非同一般的重要改进。它在GTP酶对由GTP水解导致的失活最敏感的时刻减少了样品处理时间，从而提高了测定的可重复性。在此点上，本领域技术人员已知沉降测定具有高cv值(我们的结果是40-60％，数据未显示)。省去澄清还使样品处理简单，并且适于高通量测定，例如诊断和药物发现中将使用的高通量测定。沉降测定不适合于这些应用。
实施例7效应物-GBDs与谷胱甘肽板的非共价附接 如所有这些实施例所公开的，将效应物-GBD肽连接到板上的方法之一是通过共价附接(covalent attachment)。还研究了非共价附接的使用。这里的实施例描述了与谷胱甘肽板连接的带谷胱甘肽S转移酶标签的效应物-GBD肽的使用。
材料和方法 将效应物-GBD非共价附接于板上 将PAK-GBD-GST肽在包被缓冲剂(PBS；140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸钠(二碱价)，1.76mM磷酸钾(一碱价)pH 7.2)中稀释到终浓度为0.02mg/ml，并将50μl(1.0μg)蛋白质添加到GST-Trap谷胱甘肽包被板(NoAb Biodiscoveries，Ontario，Canada)的各个孔中。将板在室温温育1小时。将板在PBS中清洗2次，添加含0.1％BSA的PBS pH 7.2室温封闭1小时。
参考图9，按照上文的概述将PAK-GBD-GST肽包被到谷胱甘肽板(NoAb Biodiscoveries)上。使用上述(实施例2)的标准Rac1 G-LISA测定对GDP、GTPγS和组成型活性Rac1L61进行测定。按照“材料和方法”所述(实施例2)通过490nm吸光度检测Rac1信号。所有读数均减去了仅缓冲剂的背景。
结果 使用PAK-GBD-GST连接板以G-LISA模式(如实施例2中详述的)对负载了组成型活性Rac1、GTPγS-或GDP-1的血小板进行了测定。图11中的结果显示，非共价G-LISA模式能够鉴定高于背景的组成型活性Rac1(仅缓冲剂)。组成型活性Rac1信号是背景的8倍，与从共价结合POSH效应物的马来酰亚胺板的产生的信号(图2B，实施例2)相似。非共价PAK-GST测定能够区分负载活性与非活性Rac1蛋白质(图9，GTPγS(活性)和GDP非活性)的血小板提取物。尽管本测定相当灵敏(8倍活化)，但是没有POSH连接的马来酰亚胺板G-LISA(30倍，图3B，实施例2)那样稳健。非共价PAK-GST测定在不存在抗原提呈缓冲剂的条件下没有给出高于背景的信号(图9，GTPγS无抗原提呈缓冲剂)。
讨论 本实施例证明了非共价板模式对于开发G-LISA测定的效用。可以看出，通过下面的G-LISA开发规程，利用连接于谷胱甘肽板的PAK-GST效应物可获得良好的信号(图9)。有趣的是，对于该测定而言，使用抗原提呈缓冲剂(APB)有利于获得活性Rac1信号(图9，GTPγS+ABP与-APB比较)。
实施例描述了GST谷胱甘肽连接的使用，由PAK-GST谷胱甘肽板产生的GTPγS信号小于由POSH马来酰亚胺板(图3B)和PAK马来酰亚胺板(数据未显示)产生的GTPγS信号。由于这个原因，并且由于共价板结合蛋白质通常更加稳定，我们进一步考察了共价马来酰亚胺板模式。然而，本文已经证明，GST谷胱甘肽板在G-LISA中可良好工作，预期也可以使用其他的非共价连接，例如聚组氨酸镍、聚组氨酸钴、生物素链霉抗生物素蛋白、生物素抗生物素蛋白等。每种板模式的优化均可遵循在这些实施例中概述的方法。
实施例8G-LISA测定的检测限和验证 目前，所有公开的对细胞或组织样品中Rho GTP酶的活化(或失活)水平的估计值均使用由标准Rho GTP酶沉降测定产生的数据(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；和Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272)。由于该测定方法清楚明确，并且在本领域被公认为定量的金标准，所以我们期望通过证明G-LISA产生的活化估计值与在沉降实验产生的估计值相当来验证G-LISA。因此，我们希望证实，虽然G-LISA测定与Rho GTP酶沉降测定相比具有速度大大提高、重复性更好、样品通量增加、样品操作更简单以及样品量更小等优势，这两种测定对活化Rho GTP酶的实际定量结果却是相似的。
材料和方法 通过钙蛋白酶抑制剂诱导产生活化RhoA细胞裂解物 将HeLa细胞接种在含有10％FBS的DMEM(Gibco.批号10313-021)中。令细胞生长到50-70％汇合度，随后使之血清饥饿24小时。然后用钙蛋白酶抑制剂(100ng/μl)处理细胞30分钟。将细胞收集在裂解缓冲剂中，用裂解缓冲剂使裂解物的蛋白质浓度等量为4mg/ml。然后相应地对裂解物进行稀释，并进行RhoA GLISA测定。
通过EGF诱导产生Rac1和Cdc42细胞裂解物 将HeLa细胞接种在含有10％FBS的DMEM(Gibco.批号10313-021)中。令细胞生长到50-70％汇合度，随后使之血清饥饿24小时。然后用10ng/ml表皮生长因子(EGF)(Sigma.批号E9644)处理细胞2分钟，将细胞收集在裂解缓冲剂中。用裂解缓冲剂使来自血清饥饿板和EGF处理板的裂解物的浓度等量为1mg/ml。然后对裂解物进行RAC1或Cdc42 G-LISA测定。
沉降测定 测定根据Ren等所述进行。将修饰的GST Rho靶蛋白-GBD肽与谷胱甘肽珠子结合，将20μg结合于珠子的效应物添加到500μl(250μg)澄清的负载GTPγS或负载GDP的血小板提取物中(裂解物制备见实施例2)。将混合物在4℃回旋温育1小时。然后，将珠子在清洗缓冲剂(50mM Tris pH 7.5，100mM NaCl，30mM MgCl2)中清洗2次，并进行SDS-PAGE(4-20％梯度)和Western印迹程序。用特异识别RhoA蛋白的第一抗体和山羊抗小鼠第二抗体(Jackson Labs.，批号115-035-068)检测活化的RhoA蛋白质条带。测定最少执行4次。
参考图10，将25μl血清饥饿的或钙蛋白酶抑制剂处理的(RhoA活化的)、浓度为4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06mg/ml的Hela细胞裂解物，与相同体积的结合缓冲剂混合，并进行RhoA G-LISA测定，随后进行吸光度检测。同时对500μg相同的裂解物进行GST-Rho靶蛋白-RBD沉降测定，随后用抗RhoA抗体进行Western印迹。所有的读数均减去了仅缓冲剂的背景。
参考图11，将25μl的仅裂解缓冲剂(0)、0.01、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2ng RhoA(63L)与相同体积的结合缓冲剂混合，并进行RhoA G-LISA测定，随后进行吸光度检测。所有的读数均减去了仅缓冲剂的背景。
参考图12，根据“材料和方法”(实施例7)中的概述制备PAK包被的GST板。PAK包被的谷胱甘肽珠子来自Cytoskeleton公司(批号PAK02)。针对来自血清饥饿的3T3细胞(SS)或EGF处理的3T3细胞(用于活化Rac1)的不同量的总细胞裂解物(实际量标识在柱状图和Western印迹下面)，如实施例2所述利用标准Rac1 G-LISA测定法进行测定，或如Benard等(J.Biol.Chem.，1999，27413198-13204)所述利用标准PAK-GST珠子沉降测定法进行测定。如前文所述通过490nm吸光度对G-LISA测定定量。Rac1沉降通过Western印迹化学发光信号的密度测定加以定量。化学发光检测试剂是Supersignal West Dura Extended Duration Substarte(Pierce)。用于沉降的抗Rac1抗体由Cytoskeleton公司在其Rac1沉降测定用商业试剂盒(BK035)中出售。附图显示，Rac1:PAK G-LISA的检测限是Rac1:PAK沉降测定的大约18-30分之一低。
参考图13A，对50μl仅裂解缓冲剂、血清饥饿的或EGF处理的Hela细胞裂解物(0.5mg/ml)进行Rac1 G-LISA测定，随后进行吸光度检测。参考图13B，如前文所述地对50μl血清饥饿的或EGF处理的Hela细胞裂解物(0.5mg/ml)进行Cdc42 G-LISA测定，并如前文所述地通过发光测定法进行定量。平行地用500μg相同裂解物进行Cdc42沉降测定。此测定中使用的抗体与G-LISA中使用的相同(批号ACD01，Cytoskeleton公司)。通过对化学发光显影的底片的密度测定来定量活化倍数(fold activation)。参考图13C，利用脂质转染胺试剂(lipofectamine)，用5μg载体、p115RhoGEF或p190RhoGAP转染Hela细胞，转染16小时后，在细胞裂解缓冲剂中裂解细胞。然后对25μl仅裂解缓冲剂、载体、p115RhoGEF、载体、p190RhoGAP转染的细胞(1mg/ml)进行RhoA G-LISA测定，并通过吸光度检测加以定量。平行地用500μg相同的裂解物进行Rho沉降测定，通过对化学发光显影底片的密度测定来定量活化倍数(对p115RhoGEF)或抑制倍数(foldinhibition)(对p190GAP)。
结果 RhoA G-LISA的检测限 在本实施例中用两种方法来确定利用基于吸光度的测量法检测活性RhoA的G-LISA的检测限。首先，确定细胞裂解物中内源活性(钙蛋白酶抑制剂诱导的)RhoA的检测限。其次，确定纯重组组成型活性RhoA的检测限。
用钙蛋白酶抑制剂处理30分钟诱导血清饥饿HeLa细胞中的RhoA活化(Schoenwaelder et al.，1999，J.Biol.Chem.，27414359-14367)。用500μg的每种裂解物(1mg/ml裂解物浓度)进行标准沉降测定(图10中的插图)。Western印迹结果的密度测定定量显示，RhoA(图4插图中的钙蛋白酶抑制剂泳道)活化为血清饥饿裂解物(图4插图中的SS泳道)的大约2倍。正如预期的，这与公开的数据非常一致(Schoenwaelder et al.，2000，Current Biol.，101523-1526)。
在平行G-LISA测定中，将血清饥饿裂解物和钙蛋白酶抑制剂裂解物连续稀释到给定的蛋白质浓度，分别为4、2、1、0.5、0.25和0.125mg/ml，取25μl裂解物在RhoA G-LISA中测试。与血清饥饿样品相比，浓度为0.25mg/ml-2mg/ml的裂解物(总细胞裂解物分别为6.25μg和50μg)使钙蛋白酶抑制剂处理样品活化了大约2倍(图10，活化倍数示于钙蛋白酶抑制剂滴定曲线上方)。因此，对于低至0.25mg/ml或6.25μg总细胞裂解物的蛋白浓度，RhoA G-LISA结果与公开的数据以及本实施例显示的沉降测定数据非常一致。
在0.5-2mg/ml的蛋白浓度(典型的细胞裂解物浓度)，cv为11-8％。甚至在低至6.25μg总细胞裂解物的蛋白量，16％的cv值也是可以接受的。在更低的蛋白浓度(0.125mg/ml或3.1μg总细胞裂解物)，cv值将变得过高而不能给出Rho测定中有意义的结果(>50％)，而在最高的蛋白浓度4mg/ml(100μg裂解物)，cv值为11％，然而活化水平则略微低于2倍(1.7倍)。4mg/ml时活化倍数降低最有可能是由于活性RhoA读数正在接近吸光度测定的饱和点(2.5吸光度单位)。有趣的是，图12显示，Rac1:POSH测定可以从少达3μg的总细胞裂解物中的检测到活化Rac1，cv值为12％。
为了确定对于重组组成型活性RhoA的G-LISA吸光度检测的极限，向ROCK-GBD马来酰亚胺板上的8个孔内各自添加0.01、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0和4.0ng蛋白质。在整个RhoA G-LISA测定过程中取样，并以OD490读数对蛋白质浓度作图。图11的结果显示，吸光度G-LISA的线性范围是0.1ng(cv＝6％)到2ng(cv＝6％)。重组组成型活性RhoA的信号似乎在蛋白量超过4ng时开始饱和。
为了进一步比较G-LISA测定与沉降测定，用相同的细胞裂解物平行地进行两种测定。按照“材料和方法”部分所述，用表皮生长因子(EGF)刺激HeLa细胞。已有充分证据显示，EGF瞬时活化Rac1，且活化为未刺激细胞的2倍到5倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。两种测定均使用PAK-GST效应物，且两种测定分别根据实施例2和3中描述的标准方法来进行。从图12可以看出，从使用3μg-12.5μg总裂解物的G-LISA蛋白检测到了大约2倍的活化，而沉降测定在100μg样品中检测到了信号，在50μg总细胞裂解物中则没有(大约2.5倍活化)。因此说，沉降测定中的检测极限似乎是G-LISA可得的极限的大约18-30倍高。另外值得注意的是，本申请的发明人的沉降测定技术非常熟练，并曾经用这一技术开发过商业化产品。因此，沉降和G-LISA的一对一比较结果显示，两种测定可给出相似的Rho活化定量(大约2倍)，结果清楚地证明G-LISA是更好的测定方法。G-LISA的优势不仅限于灵敏度更高，尽管这是主要的优势，G-LISA还更加迅速(<3h，相比于>10h)，需要的样品量少得多，且适合于HTS应用。
活性Rho GTP酶的Rac1和Cdc42 G-LISA测定定量与沉降定量的比较 为了进一步考察G-LISA对Rho GTP酶体内活化的效用，我们以多有报道的Rac1和Cdc42活化为例，比较了沉降数据与G-LISA测定数据。
EGF已被证明在数种细胞系中使Rac1活化为血清饥饿水平的2-5倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。图13A显示了使用500μg细胞裂解物的沉降测定和使用25μg细胞裂解物的Rac1G-LISA的比较结果。沉降测定的Western印迹的密度测定定量结果显示Rac1活化了4倍。平行进行的Rac1G-LISA结果与该活化倍数一致，是血清饥饿的细胞裂解物的4倍(图13A)。
文献中已充分证明，EGF可以使Cdc42活化为血清饥饿Cdc42的水平的2-3倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。图13B显示了使用500μg细胞裂解物的沉降测定和使用25μg细胞裂解物的Cdc42 G-LISA的比较结果。沉降测定的Western印迹的密度测定定量结果显示Cdc42活化了2倍。平行进行的Cdc42 G-LISA结果与该活化倍数一致，是血清饥饿细胞裂解物2.2倍高(图13B)。
将外源DNA转染到细胞培养物中，随后观察蛋白表达对Rho GTP酶活化的影响，是细胞和分子生物学中的一种常用手段(Klooster et al.，2006，J.Cell Biol.，1172759-769；和Cheng et al.，2004，J.Biol.Chem.，27912786-12793)。因此，评估了G-LISA检测下述对象的能力用Rho GTP交换因子p115RhoGEF转染HeLa细胞时，内源Rho GTP酶的活化；或者用GTP酶活化蛋白p150RhoGAP转染HeLa细胞时，Rho的失活(Wells et al.，2001，J.Biol.Chem.，27628897-28905；和Arthur et al.，2001，Mol.Biol.Cell，122711-2720)。
图13C中的结果证实，G-LISA能够如实地检测转染实验中Rho GTP酶活化的提高(p115RhoGEF)或降低(p150RhoGAP)。而且，活性Rho GTP酶相对于仅有载体的样品的定量结果在沉降与G-LISA测定之间是一致的。讨论 实施例3中公开的结果证实，从给定Rho GTP酶获得的活化水平在沉降测定和G-LISA测定之间高度相似。在血清饥饿的HeLa细胞中，对这两种测定法针对RhoA的钙蛋白酶抑制剂活化(图10)、Rac1的EGF活化(图13A)和Cdc42的EGF活化(图13B)的定量进行了比较。在所有情况下，两种测定方法间的Rho GTP酶活化都是相似的(典型地为2-4倍活化)，且与公开数据一致(Kazuo et al.，2004，Mol.Biol.Cell，151003-1010)。还比较了用p115RhoGEF(活化子)或p190RhoGAP(去活化子)(图13C)转染的细胞系中Rho的活化与失活。结果再次显示，就活化倍数测量结果而言，沉降测定和G-LISA测定是相似的。在这些测定中对数种不同的细胞系(例如Swiss 3T3，Jurkats，MDCK细胞)进行了分析，在所有情况下，G-LISA定量结果均与公开的沉降测定估计结果一致(数据未显示)。
图10-13的数据清楚地显示，G-LISA测定的效用在于从少量样品中对RhoA活化进行定量。因此，这种测定方法的线性范围大约为6.25-50μg细胞裂解物(图10)。这相当于0.04-1.7ng活性RhoA的估计值(理由可见实施例2，“结果”部分)。发现纯重组组成型活性RhoA的线性范围为0.1-2ng(图11)，这支持了根据细胞裂解物样品的估计值。还应当注意，本实施例中描述的测定方法是用于基于吸光度的G-LISA。对此，基于发光测定的G-LISA测定方法比基于吸光度的版本更加灵敏，将测定的灵敏度提高到低于0.04ng(数据未显示)。
与G-LISA相反，人们一般认为，在标准沉降测定中内源活化Rho GTP酶的定量典型地需要1 x 106至1 x 107个细胞，或300-800μg总细胞蛋白质(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；和Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272)。文献中进一步承认，当样品有限时，这样的裂解物量可能使实验无法进行(Gottig et al.，2006，Eur.J.Immunol.，36180-189)。对此，直接比较了PAK-GST沉降测定和PAK-GST G-LISA测定(图12)。结果显示，G-LISA比沉降测定灵敏大约18-30倍。
需要使用少量裂解物的场合包括原代细胞系的分析。其它场合包括在小生长室(growth chamber)中，例如12孔板(典型地4 x 105个细胞)，24孔板(典型地2 x 105个细胞)或96孔板(典型地3 x 104个细胞)中培养的高通量样品的处理。G-LISA能够检测来自少至6μg的总细胞裂解物，相当于2x 104个细胞的活性RhoA信号，因而这种测定方法即使在只能获得有限量样品的场合下，例如原代细胞系、临床样品和高通量应用，也适用于Rho GTP酶活化研究。
实施例9用冻干法稳定效应物-GBD板 效应物-GBD肽的稳定化产生可长期干燥保存在4℃的板，从而为本测定模式提供了一种优势。参考图14，将冻干的ROCK-RBD包被的微量滴定板在4℃和>10％的湿度下保存标示的时间。使用血清饥饿或钙蛋白酶抑制剂处理的细胞裂解物，通过标准RhoA G-LISA测试该板的活性。特别地，如实施例2所述地用效应物-GBD包被板。在封闭和清洗步骤之后，向每个孔添加50μl冻干缓冲剂(5％蔗糖，1％葡聚糖，于PBS pH 7.2中)。将板冷冻到-70℃，并用如下的程序冻干 稳定冷冻干燥机架温(shelf temperature)到-40℃，5分钟； 开始抽真空到<100 mtorr； -26℃抽真空4小时； -10℃抽真空4小时； 0℃抽真空4小时；和 30℃抽真空4小时。
然后将板从冷冻干燥机移出并封装在含有干燥剂包的容器内。将板保存于4℃及湿度小于10％的条件。按图14所示的时间间隔，用L63组成型活性RhoA(每孔5ng)在标准Rho:ROCK G-LISA中对板进行分析。对每个板相对于0时间测定的板活性(100％活性)的％活性作图。结果发现，在这些条件下，板在至少120天内保持非常稳定。让其变潮湿的板在1-2小时后丧失活性(数据未显示)。
讨论 配制稳定的G-LISA板具有许多优点，包括容易保存和在HTS模式中容易操作。由于此测定还以试剂盒的形式提供，所以将板的内含物冻干，就可以在没有干冰等的情况下进行运输。
实施例10G-LISA测定在药物发现中的应用 文献中已充分证明，Rho家族蛋白及其效应物蛋白参与了多种人类疾病，包括癌症和肾病(Fiordalisi et al.，2006，Canc.Res.，663153-3161；Fritz etal.，2006，Curr.Cancer Drug Targ.，11-14；和Wakino et al.，2005，Drug NewaPerspect.，18639-643)。因此，建立能够鉴定直接Rho GTP酶调节因子和直接调节Rho GTP酶与效应物的相互作用的化合物的筛选方法是非常有价值的。因此，此处将G-LISA技术的应用扩展到包括这些筛选方法。
参考图15，对仅裂解缓冲剂(空白)或5ng Rac1(61L)进行标准Rac1:POSH G-LISA。PAK-GST包含在该测定的裂解物温育阶段的反应中。PAK肽可能是POSH结合Rac1 GTP酶的竞争抑制剂，从而降低G-LISA信号。在一些反应中，ROCK-GST包含在阴性对照“抑制剂”中。PAK-和ROCK-GST肽的摩尔值以μM给出。正如预期的那样，PAK肽是Rac1:POSH反应更高效的竞争物(IC50 0.1μM，相比于8μM)。
结果 图15所示的实施例显示了来自与POSH-GBD马来酰亚胺板结合的5ng组成型活性Rac1(61L)的G-LISA数据。G-LISA如前所述进行，只是在存在或者不存在可能充当Rac1:POSH结合的竞争抑制物的PAK-GBD-GST的条件下进行反应，向反应中添加0μM至10μM的PAK-GBD-GST。图15显示，PAK的IC50是大约0.1μM。该测定中也测试了RhoA效应物ROCK-GBD。对这种肽的IC50大约是PAK的80倍(8μM)。这个实施例用于证明G-LISA测定在药物发现中的应用。
讨论 本实施例描述了G-LISA在药物发现中的应用。该测定模式使用纯化的组成型活性Rho GTP酶和纯化的效应物-GBD肽，因此，它是一种明确的、将产生具有直接、机械关联性的结果的系统。应当注意，所述G-LISA测定还适合于鉴定调节内源Rho GTP酶活性的化合物。该测定(或试剂盒)模式可如下实施在合适的适于HTS的容器如96孔板上培养细胞，用化合物库处理细胞(任选在处理前对细胞进行血清饥饿)，将细胞裂解在25μl裂解缓冲剂中(此时可任选地进行蛋白定量)并转移到存在或不存在20％PEG 8000的G-LISA板中。将板在4℃温育30分钟，然后室温清洗，用抗原提呈缓冲剂处理2-5分钟。清洗板，并对孔中的Rho GTP酶进行定量。定量可以使用Rho特异性抗体，或者通过其他方法。HTS方法学也可采用微量滴定板或微阵列常用的机器人系统。
除了本文所描述的以外，本领域技术人员根据前述的说明书可以显见本发明的各种修改形式。这些修改形式也包含在所附权利要求的范围内。本申请引证本文引用每篇参考文献(包括但不仅限于，杂志文献、美国和非美国专利、专利申请公开、国际专利申请公开、gene bank登录号等)的全部内容。本文引证2005年7月5日提交的美国临时专利申请系列No.60/695,844的全部内容。
序列表
<110>西托斯科莱顿股份有限公司(CYTOSKELETON INC.)
Cheng，Li
Davis，Ashley
Middleton，Kim
<120>Rho蛋白质检测
<130>CSKL0005-500WO
<150>US 60/695,844
<151>2005-07-05
<160>110
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>193
<212>PRT
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<213>小鼠(Mus musculus)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
<400>106
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<211>24
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>110
权利要求
1.一种用于检测活化Rho GTP酶蛋白质的方法，包括
使固体支持物与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触，其中该固体支持物与活化Rho GTP酶结合肽连接，并且其中样品中的活化Rho GTP酶与活化Rho GTP酶结合肽结合；和
检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质，其中在检测期间活化Rho GTP酶蛋白质保持与固体支持物联结。
2.权利要求1的方法，其中该样品包括含有内源活化Rho GTP酶蛋白质的细胞裂解物。
3.权利要求2的方法，其中该样品含有少于50μg的总蛋白质。
4.权利要求2的方法，其中该细胞裂解物是从少于105个细胞制备的。
5.权利要求2的方法，其中该细胞裂解物未被澄清。
6.权利要求1的方法，其中在检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质之前，添加抗原提呈缓冲剂，其中该抗原提呈缓冲剂包括一种或多种能够减少活化Rho GTP酶蛋白质自固体支持物的损失的化合物或处理。
7.权利要求6的方法，其中该抗原提呈缓冲剂包括热变性、尿素处理、戊二醛或乙醇，或其任意组合。
8.权利要求1的方法，其中在检测样品中的活化Rho GTP酶蛋白质之前添加结合缓冲剂。
9.权利要求8的方法，其中该结合缓冲剂包括水溶性聚蔗糖、葡聚糖或聚乙二醇，或其任意组合。
10.权利要求9的方法，其中聚乙二醇是PEG4000或PEG8000，其终浓度为大约2％到大约40％v/v。
11.权利要求1的方法，其中使用对一种或多种活化Rho GTP酶蛋白质特异的抗体检测活化Rho GTP酶蛋白质。
12.权利要求1的方法，其中该活化Rho GTP酶蛋白质是组成型活性突变体。
13.权利要求1的方法，其中该样品包含外源GTP、GDP或GTPγS。
14.权利要求1的方法，其中该活化的Rho GTP酶蛋白质是RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Raclb、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1或RhoBTB2。
15.权利要求1的方法，其中该活化Rho GTP酶结合肽结合一种或多种活化Rho GTP酶蛋白质，且其对活化形式的Rho GTP酶蛋白质的亲和力是对非活化形式的亲和力的至少2倍。
16.权利要求1的方法，其中该活化Rho GTP酶结合肽是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH、WASP或Dia1，或者它们的突变体或多聚体。
17.权利要求1的方法，其中该活化Rho GTP酶结合肽与固体支持物共价或非共价连接。
18.权利要求17的方法，其中该共价连接是二硫键连接，且其中该非共价连接是GST连接。
19.权利要求1的方法，其中该活化Rho GTP酶结合肽是冻干的。
20.权利要求1的方法，其中该固体支持物是微量滴定板或微阵列。
21.权利要求1的方法，进一步包括对与活化Rho GTP酶结合肽结合的活化Rho GTP酶蛋白质的量进行定量。
22.权利要求21的方法，其中使用对一种或多种Rho GTP酶蛋白质特异的抗体对活化Rho GTP酶蛋白质的量进行定量。
23.权利要求1的方法，其中活化Rho GTP酶蛋白质的检测是利用吸光度、发光或荧光来检测活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽的之间相互作用而进行的。
24.权利要求1的方法，还包括使样品与测试剂接触，并确定测试剂是否调节活化Rho GTP酶蛋白质与活化Rho GTP酶结合肽之间的相互作用。
全文摘要
本发明提供了通过使固体支持物与含有活化Rho GTP酶蛋白质的样品接触来检测活化Rho GTP酶蛋白质的方法。该固体支持物与活化Rho GTP酶结合肽连接。在检测期间，活化Rho GTP酶蛋白质保持与固体支持物联结。
文档编号C12N9/12GK101501495SQ200680032416
公开日2009年8月5日 申请日期2006年7月5日 优先权日2005年7月5日
发明者利 程, 阿什利·戴维斯, 金·米德尔顿 申请人:西托斯科莱顿股份有限公司