麻风树基因的功能分析的制作方法

专利名称：麻风树基因的功能分析的制作方法
麻风树基因的功能分析相关申请的交叉引用本发明要求于2009年1月9日提交的美国临时专利申请第61/143，484号的优先权，该临时专利申请通过引用并入本文。
背景技术：
本发明涉及基因组规模的麻风树属(Jatropha)基因功能分析领域。更具体地，本发明涉及一种利用病毒诱导性基因沉默来进行基因组规模的麻风树(Jatropha curcas)基因高通量功能分析的方法。本文中用于说明本发明背景或提供有关实施的补充细节的出版物和其他材料并入本文作为参考，并且为了方便起见分别在文献目录中分组。世界面临着化石燃料供给日益减少和温室作用不断恶化的问题。亟需增加可再生能源的产生和消耗。对于许多国家寻找替代能源来说，生物燃料已经公认为国家的优先项目以满足它们的能源安全需要，同时有助于减少造成温室作用的(X)2排放。对生物燃料的需要导致食物生产的压力增加。例如，为了满足德国政府要求的德国2017年的生物燃料需求，该国的全部农用土地都将用于生长生物能作物，而没有留下土地用于食物生产。为了减轻对土地的这种竞争并满足我们对可再生燃料的需要，亟需利用边缘土地来进行生物能产生。麻风树是属于大戟科的小木本植物。麻风树的数种独特性质使其成为用于生物柴油生产的理想植物。这些性质包括其迅速生长、容易繁殖、种子的低成本、高含油量、短孕育期、广泛的适应性、干旱耐受性和在退化土壤上茁壮成长的能力。此外，其植株大小使种子的收集非常方便(Jones, 1991 ；Sujatha et al. ,2008) 但是，麻风树具有几个缺点，这限制了它的广泛应用。植物的产量受到不利的雄花与雌花比的限制，并且其含油量没有通过育种进行优化。该植物对生物应激如病毒 (Narayanna et al.，2007)、真菌和细菌病原体，和非生物应激特别是寒冷和干旱也是敏感的(http colon www dot jatropha dot org)。在植物的种子和叶子中存在数种毒性组分 (例如蛋白毒素、麻风树毒蛋白和致癌剂佛波酯)给麻风树产业的农民和生物加工工人带来健康危害。改善麻风树的农艺和质量性状的一种重要方法是通过遗传修饰。可以产生表达同源或异源基因序列的转基因麻风树属植物。在许多情况下，期望一个或多个确定功能的同源基因的过量表达或通过RNAi沉默。麻风树属的基因序列可以通过cDNA和基因组文库获得，基因的功能可以通过与其他已知功能的植物基因的序列同源性来初步确定。然而，这种确定充其量只是暂时和初步的。功能确定常常由于成员序列高度相关的基因家族的存在而混淆。基因功能可以通过转基因植物中候选基因的过量表达或RNAi介导的沉默来更准确地确定；然而，这样的方法费力费时并且不适用于基因组规模的高通量分析。因此，期望开发基因组规模的麻风树基因高通量功能分析的方法。发明概述本发明涉及基因组规模的麻风树属基因功能分析领域。更具体地，本发明涉及一种利用病毒诱导性基因沉默来进行基因组规模的麻风树基因高通量功能分析的方法。本发明涉及利用病毒诱导性基因沉默(VKS)可靠而迅速，并且以高通量的方式来评价麻风树中的基因功能。在一方面，本发明提供了用于麻风树(J.curcas)中的VIGS 的有效且可重复的系统和方法。在一实施方案中，本发明提供了 DCL4的共沉默以提高VIGS 效率。在另一实施方案中，本发明提供了整个烟草脆裂病毒(TRV)病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方案中，本发明证实这些载体具有与原始载体相似的效率。在另一实施方案中，本发明提供了 TRV VIGS系统在克隆和功能性鉴定几种重要的脂肪酸生物发生途径基因中的用途。这些重要的基因可以用于改善生物柴油的燃料特性，如低温流动特性、氧化稳定性和NOx排放。因此在第一方面，本发明提供了一种麻风树属中的病毒诱导性基因沉默(VIGS) 的方法。根据本发明，所述方法包括(a)将包含待沉默的第一期望基因的序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的载体以产生修饰的TRV RNA2载体；(b)制备土壤杆菌(Agrobacterium)的混合培养物，所述混合培养物包含土壤杆菌，其含有包含TRV RNAl序列的载体；以及土壤杆菌，其含有所述修饰的TRV RNA2载体；(c)将所述土壤杆菌的混合培养物通过真空渗入引入麻风树属的植物组织以产生感染的植物；以及(d)使所述感染的植物生长足够的时间以诱导所述期望基因的基因沉默。在一实施方案中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成植物载体。在另一实施方案中，第一期望基因的序列为所述基因的有义链的序列。在另一实施方案中，第一期望基因的序列为所述基因的反义链的序列。在另一实施方案中， 核酸还包含待沉默的第二期望基因的序列。在一实施方案中，第二期望基因为抗病毒 (virus resistance)基因。在另一实施方案中，抗病毒基因选自核糖核酸酶III切酶样(RNase III Dicer-like) 4 (DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶样2 (DCL2)基因、核糖核酸酶 III 切酶样 3 (DCL3)基因、ARG0NAUTE1 (AGOl)、ARGONA UTE71 (AG07)、依赖于 RNA 的 RNA聚合酶1 (RDRl)、依赖于RNA的RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因(Suppressor of gene silencing) 1 (SGSl)、基因沉默阻抑基因 3 (SGS3)和沉默缺陷(Silencing defective) 3 (SDE3)。在另一实施方案中，核酸包含多于两个待沉默的期望基因的序列。在一些实施方案中，期望基因为脂肪酸生物合成中的候选基因，如β -酮酰基-酰基载体蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)基因和脂肪酸去饱和酶(FAD)基因。在其他实施方案中，期望基因为候选转录因子基因。在一实施方案中，期望基因为小RNA(smRNA)生物合成中的候选基因。在另一实施方案中，期望基因为毒性物质(toxic agent)生物合成中的候选基因。因此在第一方面，本发明提供了一种在麻风树属中分析基因功能的方法。根据本发明，所述方法包括(a)将包含待沉默的候选基因的序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的载体以产生修饰的TRV RNA2载体；(b)制备土壤杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含土壤杆菌，其含有包含 TRV RNAl序列的载体；以及土壤杆菌，其含有所述修饰的TRV
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RNA2 载体；(c)将所述土壤杆菌的混合培养物通过真空渗入引入麻风树属的植物组织以产生感染的植物；(d)使所述感染的植物生长足够的时间以诱导所述候选基因的基因沉默；以及在所述感染的植物上分析所述沉默的候选基因的表型效果。在一实施方案中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成植物载体。 在另一实施方案中，第一期望基因的序列为所述基因的有义链的序列。在另一实施方案中， 第一期望基因的序列为所述基因的反义链的序列。在另一实施方案中，核酸还包含待沉默的第二期望基因的序列。在一实施方案中，第二期望基因为抗病毒基因。在另一实施方案中，抗病毒基因选自核糖核酸酶III切酶样4(DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶样2(DCL2) 基因、核糖核酸酶 III 切酶样 3 (DCL3)基因、ARGONA UTEl (AGOl)、ARG0NAUTE71 (AG07)、依赖于RNA的RNA聚合酶1 (RDRl)、依赖于RNA的RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因 1 (SGSl)、基因沉默阻抑基因3(SGS3)和沉默缺陷3(SDE3)。在另一实施方案中，核酸包含多于两个待沉默的期望基因的序列。在一些实施方案中，期望基因为脂肪酸生物合成中的候选基因，如β -酮酰基-酰基载体蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)基因和脂肪酸去饱和酶(FAD)基因。在其他实施方案中，期望基因为候选转录因子基因。在一实施方案中，期望基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方案中，期望基因为毒性物质生物合成中的候选基因。


图1示例了本发明的用于麻风树病毒诱导性基因沉默(VIGS)的方法。图2A-2E示出对CH42基因的VIGS效果和CH42基因插入长度效果。将携带pTRVl 或pTRV2 (图2A中的载体、图2B中的TRV2-CH42-440和图2C中的TRV2-CH42-680)的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株的培养物按照1 1比例混合。用Iml无针注射器将混合培养物注射入处于2-3叶期植物的麻风树属植物中。CH42酶负责在叶绿素生物合成时将Mg加入卟啉环中。CH42基因的沉默阻断了新出现的叶子中叶绿素的合成，该叶子失去其绿色但因为类胡萝卜素的存在而出现黄色。注意，因为预先形成的叶绿素的稳定性，接种的叶子仍保持绿色。TRV2-CH42S和TRV2-CH42L分别含有440bp和689bp的CH42 基因片段的插入物(insert)。图2D 沉默信号可以从接种的叶子(通过黑色箭头指示)向下移动而在新出现的侧叶(通过白色箭头指示)中产生基因沉默效果。图2E =RT-PCR分析以确定在较长CH42插入TRV-CH42L感染(泳道1)、短CH42插入TRV-CH42S感染(泳道 2-3)和载体对照感染(泳道CK)的已感染麻风树植物上部叶子中麻风树CH42RNA水平。第一链cDNA利用寡聚(dT)引物和反转录酶从分离自沉默和非沉默植物的总RNA产生。第一链cDNA用于使用基因特异性引物的PCR反应中。溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶示出了 30个循环后的RT-PCR产物。用rbcL基因转录物的PCR产物作为加样对照。图3A和:3B示出合成TRV载体的沉默与原始TRV载体效率相似。图3A 使用原始 TRV载体的CH42沉默。图;3B 使用合成TRV载体的CH42沉默。图4A-4G示出了麻风树PDS基因的沉默。用单独的重组TRV(图4A)或携带麻风树PDS基因片段的TRV(图4B、4C、4D)感染麻风树植物。TRV2-PDS-300和TRV2-PDS-700 指将大小为300bp和700bp的PDS基因插入TRV2载体中。感染TRV-PDS-300 (图4C)和 TRV-PDS-700(图4B、4D)使麻风树植物中的内源PDS基因沉默，而类胡萝卜素生物合成的抑制导致了各种光漂白表型。利用费时的土壤杆菌注射(agro-injection)方法，仅小区域 (叶脉)表现出光漂白表型。本文描述的真空渗入方法显著提高了沉默效率(比较图4B和 4D)。此外，处理时间减少为土壤杆菌注射所用时间的1/5。图4E 定量PT-PCR分析以示出图4C和图4D中沉默的麻风树叶子的相对PDS RNA水平。三个独立重复的平均值与误差线一起示出。**表示用TRV-PDS-600沉默的植物与用TRV-PDS-300沉默的植物相比PDS RNA 水平更低。真空渗入在CH42基因沉默中有助于更好的沉默效率(将图4F中土壤杆菌注射的数据与图4G中真空渗入的数据比较)。图5A-5E示出了一个载体中两个基因的共沉默。分生组织特异性基因PCNA单独沉默(图5A)以及CH42和PCNA共沉默(图5B和5C 叶子的近轴侧；以及图5D 叶子的远轴侧)。重组TRV-PCNA或TRV-PCNAco-CH42通过真空渗入感染麻风树植物。TRV-PCNAco-CH42 携带含有麻风树PCNA和CH42基因片段的插入物。通过真空渗入的沉默表现出比基于注射器的土壤杆菌注射沉默更好的沉默效果。图5E 定量RT-PCR分析以示出沉默的麻风树叶子的相对PCNA和CH42 RNA水平。三个独立实验的平均值与误差线一起示出。图6A-6C示出了 DCL4和CH42的共沉默以提高VIGS效率。CH42基因单独沉默 (图6A)以及DCL4和CH42的共沉默(图6B)。图6C 定量RT-PCR分析以示出沉默的麻风树叶子的相对DCL4和CH42 RNA水平。三个独立实验的平均值和误差线一起示出。^"表示CH42和DCL4基因共沉默的叶子中的沉默效率与CH42基因单独沉默的叶子相比更高(ρ < 0. 01)。图7A-7C示出了编码β-酮酰基-酰基载体蛋白合酶II的麻风树属KASII基因通过TRV VIGS的沉默。图7Α =TRV渗入18天后感染不同TRV构建体的沉默的麻风树植物的表型。图(a) 用空TRV载体处理的麻风树植物。图(b)感染TRV:KASII的麻风树植物，其具有轻度微黄色表型。图(c)和(d)感染TRV:KASII的麻风树植物，其具有重度表型。处理的植物表现出新出现的叶子向下卷曲、叶片褐色以及枝条延伸减少。图(e)和(f):麻风树FATBl基因和 KASII基因的拮抗效果。FATIB基因编码酰基-ACP硫酯酶。我们用载体，TRVKASIICo-FATB 1 以共沉默麻风树属KASII和FATBl。感染的植物的叶子显示出沿叶脉的微黄色表型，这与仅感染TRV:KASII的叶子中发现的轻度表型非常相似。比例尺=10mm。图7B 沉默的麻风树叶子中KASII和FATB基因表达水平的定量RT-PCR分析。图 (a)载体对照。图(b) =KASII表达沉默的植物。图(c)图2A中具有重度表型的KASII表达沉默的植物。图⑷与图(b)相同，除了注射的植物表现出重度表型。图(e)和(f)来自KASII和FATB基因表达共沉默的植物的叶子。KASII和FATB的转录水平通过利用基因特异性引物的扩增来定量。未发现载体对照植物与KASII沉默的植物之间FATB基因表达水平有显著差异。图7C:来自沉默的麻风树叶子的脂肪酸甲酯的气相色谱图载体，载体对照； KASII-轻度，来自KASII表达沉默的显示出轻度表型的植物的叶子。这些植物表现出轻度微黄色表型和16:0积累的适度增加(KASII轻度)；KASII-重度，KASII表达沉默但具有重
7度表型的植物，注意16:0积累的显著增加(KAS11重度)；KASII CO FATB, KASII和FATBl 基因表达共沉默的植物。标记了甲酯16:0(峰1)、16:13(峰2)、顺(cis)-16:l9(峰3)、 16:3 (峰4)、18:0(峰5)、顺-18:1 Δ9(峰6)、18:1 Δ 11 (峰 7)、顺-18:29’12(峰8)和顺-18:39,
12’15(峰 9)。图8A-8C示出麻风树中通过TRV VIGS系统的几种去饱和酶表达的沉默。图8A 硬脂酰-ACP去饱和酶(SAD)基因家族单个成员表达沉默的麻风树植物的表型。在渗入18天后分析TRV构建体渗入的植物。图(a):空载体处理的麻风树植物。图 (b)-(d)感染TRV:SAD1的麻风树植物在早期(12dpi)表现出重度表型，(图(b))中示出的向下卷曲、窄叶片和褐色叶脉；以及晚期(18dpi)，示于(图(c)和⑷)中。图(e) TRV:SAD2处理未产生任何明显的表型。图(f)和(g) :TRV:SAD3引起比感染TRV:SAD1的植物弱得多的表型。比例尺=10mm。图8B 感染的麻风树植物中SAD基因表达水平的实时RT-PCR定量。TRV: SADl早期样品(SADl-E)中相对SADl基因转录水平。图8C 脂肪酸甲酯的气相色谱图，其来自三个SAD基因家族成员和三个油酸去饱和酶基因表达沉默的麻风树属植物的叶子样品载体，空载体对照；SAD1-E，来自TRV:SADl 感染早期植物的样品。植物的叶子表型在图3A中示出；SAD1-L，来自TRV:SAD1感染晚期植物的样品；FAD2-1，来自TRV-FAD2-1处理的植物的样品；FAD2-2，来自TRV-FAD2-2处理的植物的样品；FAD6，来自TRV-FAD6处理的植物的样品。注意FAD6位于ER中。标记了甲酯 16 0 (峰 1)、16 I3 (峰 2)、顺-16 I9 (峰 3)、16 3 (峰 4)、18 0 (峰 5)、顺-18 1 Δ9 (峰 6)、 顺-18:29'12 (峰7)和顺-18:39’12’15 (峰8)。未知峰标注为峰9。图9A-9I示出了调控植物发育的关键基因沉默的麻风树植物。图9A 感染TRV VIGS构建体的麻风树植物在27dpi时的表型，除了 i和j是在 42dpi时拍摄的。图(a)-(d)感染TRV:AS1的麻风树植物。来自感染的植物的向下卷曲的叶子的近轴侧(图(a))和远轴侧(图(b))。图(c)处理的麻风树植物叶子上沿叶脉的近轴异位叶片。图(d)处理的麻风树植物叶子中近轴异位叶片和气泡结构的高放大率视野。 图(e)-(j)感染TRV:AG01的麻风树植物的叶子。处理的麻风树植物向上卷曲的叶子的图 (e)近轴侧和图(f)远轴侧。图(g)处理的麻风树植物叶子的沿叶脉的远轴异位叶片的高放大率视野。图(h) :AG01表达沉默的植物的典型锯齿叶表型。图(i)和(j) :AG01表达沉默的植物中异常的叶形状。(k)近轴(m)远轴载体对照叶子。比例尺=10mm。图9B =ASl表达沉默的叶子的扫描电子显微照片。注意近轴异位叶片。PB 初生叶片；EB 异位叶片；ebad 异位叶片近轴；ebab 异位叶片远轴。图9C 显示出栅栏组织(异位叶片栅栏，ebp)和侧脉(异位叶片叶脉，ebv)分化的异位叶片的横切面。图9D =AGOl表达沉默的叶子的扫描电子显微照片。注意沿初生叶脉(V)的远轴异位叶片。图9E =AGOl表达沉默的叶子的横切面。注意异位远轴叶片与下表皮(E)与海绵薄壁组织(SP)相邻。图9F =AGOl表达沉默的叶子的近轴气泡的横切面。注意维管样结构的镶嵌组成 (木质部，χ ；韧皮部，P)和两层栅栏薄壁组织(PP)。
图9G 感染空载体对照的麻风树叶子的横切面。图9H =ASl表达沉默的麻风树叶子中ASl和I类KNOX基因(KNAT1-样)表达水平的实时RT-PCR分析。图91 =AGOl表达沉默的麻风树叶子中AGOl和iPHAVOLUTA (PHAV)表达水平的实时 RT-PCR 分析。比例尺=50 μ m(C，Ε, F，G)，B 禾口 D 中为 200 μ m。图10示出了在麻风树中编码麻风树毒蛋白的基因的沉默。麻风树毒蛋白表达沉默的麻风树叶子的蛋白印迹分析。顶部用抗麻风树毒蛋白抗体检测麻风树毒蛋白。底部 作为加样对照的RUBL(RUBISC0大亚基)的考马斯亮蓝染色。泳道1 空载体感染的植物叶子，泳道2-4，TRV:麻风树毒蛋白感染的麻风树叶子。图11A-11E示出了用sTRV:JcCH42处理的一些推定的宿主植物(对于图11A、11C、 IlD和 IlE 中示出的植物Dinesh Kumar et al. (2007))。图 IlA 花生(Arachis hypogaea)； 图 IlB 绿豆(Phaseolus aureus)；图 IlC 大豆(Glycine max)；图 IlD 菜豆(Phaseolus vulgaris)；图 IlE 蓖麻(Ricinus communis)。比例尺10mm。图12示出了用sTRV: JcCH42或模拟对照处理的一些推定的宿主植物(对于在泳道 1-5、11、12 和 14-17 中示出数据的植物 Dinesh Kumar et al. Q007))的 TRV 病毒 RNA 分析(RNA1和RNA2)。泳道1_5 花生(泳道1_3，用sTRV: JcCH42处理，泳道4和5来自模拟对照)；泳道6-10:绿豆(泳道6-8，用sTRV:JcCH42处理，泳道9和10来自模拟对照)； 泳道11-12和14-19 蓖麻(泳道11-12和14-17，用sTRV:JcCH42处理，泳道18禾口 19来自模拟对照)，泳道13为11Λ DNA ladder标记。“*”表示预期的PCR扩增片段。发明详述本发明涉及基因组规模的麻风树属基因功能分析领域。更具体地，本发明涉及一种利用病毒诱导性基因沉默来进行基因组规模的麻风树基因高通量功能分析的方法。病毒诱导性基因沉默(VIGS)(Ruiz et al.，1998 ；Burch-Smith et al.，2004)系统提供了不需要遗传转化植物就确定基因产物的生物学功能的可能性。RNA和DNA病毒均诱导导致产生病毒相关siRNA的RNA沉默(BaulCOmbe，2004)。可以构建携带候选植物基因的插入的部分序列的重组病毒。这样的重组病毒可以在整个植物中全身移动，产生可以介导内源候选基因转录物降解的siRNA(Brigneti et al. ,2004 ；Burch-Smith et al.， 2004)，从而导致接种的植物中候选基因表达的沉默。VIGS方法提供了几个良机(1)用于基因/基因家族敲低(knock down)的有效反向遗传学工具；(2)迅速和高通量(Liu et al.，2002b)—在不到一个月内敲除整个基因组ORF ；(3)瞬时、可逆和所谓“诱导”敲除表型(Liu et al. ,2002a)；以及(4)适合沉默的不同器官，提供了通过不同感染方法来敲除根(Valentine et al. ,2004 ;Kaloshian，2007)、花(Liu et al. ,2004 ；Chen et al.，2005)、叶子(Liu et al.，2002a ；Liu et al.，2002b ；Burch-Smith et al.，2006)或果实(Fu et al.，2005)中基因的机会。TRV VIGS系统已成功地应用于一些植物中，如拟南芥(Arabidopsis) (Burch-Smith et al. , 2006) > 辣椒(Capsicum annuum) (Chung et al. , 2004) > 番 ^jp (Lycopersicon esculentum) (Liu et al. , 2002 ；Dinesh Kumar et al. , 2007)、矮牵牛(Petunia hybrida) (Chen et al. ,2005)(Nicotiana benthamian) (Liu et
al.，2002)、马铃薯(Solanum tuberosum) (Brigneti et al.，2004)。大部分这些植物经实验证实为一些TRV株的易感宿主(Plant Virus Online,http colon backslash backslash image dot fs dot uidaho dot edu backslash vide backslash descr808 dot htm)。更重要地，不能合理预期这种TRV VIGS系统在所有植物中必然工作。例如，Dinesh Kumar et al. (2007)包含了据称TRV VIGS系统可以工作的植物的列表。然而，这种TRV VIGS系统在花生和大豆中不能工作，因为它们不是TRV的宿主，尽管它们包含在Dinesh Kumar et al. (2007)的列表中。事实上，如本文证实的，TRV VIGS系统并不在所有Dinesh Kumar et al. (2007)或在线病毒数据库中列出的对烟草脆裂病毒(TRV)易感的植物中工作。此外， 用于功能基因分析的TRV VIGS系统要求全身性感染。一些植物可能对TRV局部易感但不是全身性易感，所以TRV VIGS系统不会在这些植物中工作。在本发明之前，未知麻风树属是TRV的宿主或未知其对TRV任何程度的易感，不论局部或全身性。在筛选许多病毒载体后发现麻风树属对TRV易感并且TRV VIGS系统可以用于麻风树属，这是意料之外的。本发明出人意料的特征进一步由TRVVIGS系统不能在对TRV易感或列为TRV宿主植物的所有植物中工作所证实。在一方面，本发明提供了用于麻风树中的VIGS的有效且可重复的系统和方法。在一实施方案中，本发明提供了 DCL4的共沉默以提高VIGS效率。在另一实施方案中，本发明提供了整个TRV病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方案中，本发明证实这些载体具有与原始载体相似的效率。在另一实施方案中，本发明提供了 TRV VIGS系统在克隆和功能性鉴定几种重要的脂肪酸生物发生途径基因中的用途。这些重要的基因可以用于改善生物柴油的燃料特性，如低温流动特性、氧化稳定性和NOx排放。因此在第一方面，本发明提供了一种麻风树属中病毒诱导性基因沉默(VIGS)的方法。根据本发明，所述方法包括(a)将包含待沉默的第一期望基因的序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的载体以产生修饰的TRV RNA2载体；(b)制备土壤杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含土壤杆菌，其含有包含 TRV RNAl序列的载体；以及土壤杆菌，其含有所述修饰的TRVRNA2载体；(c)将所述土壤杆菌的混合培养物通过真空渗入引入麻风树属的植物组织以产生感染的植物；以及(d)使所述感染的植物生长足够的时间以诱导所述期望基因的基因沉默。在一实施方案中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成植物载体。 本文所示的结果和表型数据表明合成STRV-VIGS系统可以和TRV-VIGS系统一样有效地用于诱导期望的内源麻风树基因的沉默。在另一实施方案中，第一期望基因的序列为所述基因的有义链的序列。在另一实施方案中，第一期望基因的序列为所述基因的反义链的序列。 如本文所示，本发明的VIGS系统可以用于快速表征可能分享重叠功能的多基因家族的单个成员。在另一实施方案中，核酸还包含待沉默的第二期望基因的序列。在一实施方案中， 第二期望基因为抗病毒基因。在另一实施方案中，抗病毒基因选自核糖核酸酶III切酶样 4(DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶样2 (DCL2)基因、核糖核酸酶III切酶样3 (DCL3)基因、 ARG0NAUTE1 (AG01)、ARG0NAUTE71 (AG07)、依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶 1 (RDRl)、依赖于 RNA 的
10RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因1 (SGSl)、基因沉默阻抑基因3 (SGS3)和沉默缺陷 3(SDE3)。本文所示的表型和分子分析证实共沉默抗病毒基因可以在处理的麻风树植物中带来更高的VIGS效率。此外，抗病毒系统的共沉默还可以用于增加其他植物物种中其他 VIGS系统的效率。在另一实施方案中，核酸包含多于两个待沉默的期望基因的序列。本文所示的数据表明本发明的VIGS系统可以用于敲低两个或更多个基因的表达，从而允许在功能性冗余事件中破译基因功能。在一些实施方案中，期望基因为脂肪酸生物合成中的候选基因，如β -酮酰基-酰基载体蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)基因和脂肪酸去饱和酶(FAD)基因。在其他实施方案中，期望基因为候选转录因子基因。在一实施方案中，期望基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方案中，期望基因为毒性物质生物合成中的候选基因。本文所示的结果证实本发明的 VIGS系统可以有效地抑制靶宿主基因，并且可以用作分析候选基因在脂肪酸生物合成或毒素基因(toxic gene)生物合成中的作用的快速方法，以及用于研究诸如转录因子基因的调节基因的作用，或涉及小RNA生物发生途径的基因的作用。如本文所示，种子SADl基因的抑制可以用于产生含有高硬脂酸含量的麻风树属油。如本文进一步所示，种子FAD2-1基因和FAD-2基因的抑制可以用于产生含有较高油酸含量和较低16-碳脂肪酸含量的麻风树属油。本文所示的结果和表型数据表明VIGS系统可以成功地用于诱导其他期望的内源麻风树基因的沉默。我们产生了诸如种子和花的几种不同麻风树属组织的表达序列标签 (EST)。这些表达序列标签(EST)为麻风树属的功能基因组研究提供了大量的信息。因此， 本文描述的VIGS法提供了在同源系统中测试麻风树属基因序列功能的方法。利用标准化 cDNA文库，可以用本发明的VIGS系统进行基因功能的大规模筛选。在第二方面，本发明提供了一种在麻风树属中分析基因功能的方法。根据本发明， 所述方法包括(a)将包含待沉默的候选基因的序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的载体以产生修饰的TRV RNA2载体；(b)制备土壤杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含土壤杆菌，其含有包含 TRV RNAl序列的载体；以及土壤杆菌，其含有所述修饰的TRV RNA2载体；(c)将所述土壤杆菌的混合培养物通过真空渗入引入麻风树属的植物组织以产生感染的植物；(d)使所述感染的植物生长足够的时间以诱导所述候选基因的基因沉默；以及在所述感染的植物上分析所述沉默的候选基因的表型效果。在一实施方案中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNAl的载体为合成植物载体。 在另一实施方案中，第一期望基因的序列为所述基因的有义链的序列。在另一实施方案中， 第一期望基因的序列为所述基因的反义链的序列。在另一实施方案中，核酸还包含待沉默的第二期望基因的序列。在一实施方案中，第二期望基因为抗病毒基因。在另一实施方案中，抗病毒基因选自核糖核酸酶III切酶样4(DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶样2(DCL2) 基因、核糖核酸酶 III 切酶样 3(DCL3)基因、ARG0NAUTE1 (AGOl)、ARG0NAUTE71 (AG07)、依赖于RNA的RNA聚合酶1 (RDRl)、依赖于RNA的RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因
111 (SGSl)、基因沉默阻抑基因3(SGS3)和沉默缺陷3(SDE3)。在另一实施方案中，核酸包含多于两个待沉默的期望基因的序列。在一些实施方案中，期望基因为脂肪酸生物合成中的候选基因，如β -酮酰基-酰基载体蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)基因和脂肪酸去饱和酶(FAD)基因。在其他实施方案中，期望基因为候选转录因子基因。在一实施方案中，期望基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方案中，期望基因为毒性物质生物合成中的候选基因。一旦表征了麻风树属基因或多个麻风树属基因的功能，就可以利用常规技术制备转基因植物以改变所述基因或多个基因的表达模式。插入麻风树属植物的DNA(所关注的DNA)对于转化方法不重要。通常，导入植物的 DNA是构建体的一部分。DNA可以是所关注的基因，例如蛋白的编码序列；或者它可以是能够调节基因表达的序列，例如反义序列、有义抑制序列或微小RNA(miRNA)序列。构建体通常包含可操作地连接至所关注的DNA的5’端和/或所关注的DNA的3’端的调节区。含有所有这些元件的盒在本文中也称为表达盒。在表达盒构建体中，表达盒还可以含有5’前导序列。调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或编码信号锚定的多核苷酸对宿主细胞可以是天然的/类似的，或彼此是天然的/类似的。可选地，调节区和/或编码信号锚定的多核苷酸对宿主细胞可以是异源的，或彼此是异源的。参见，美国专利号7，205，453 和美国专利申请
发明者叶健, 曲景, 蔡南海 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司