专利名称：一种提取荔枝总rna的方法
技术领域：
本发明涉及荔枝的基因克隆、基因功能分析等分子生物学实验，具体涉及一种提取荔枝总RNA的方法，适用于荔枝等富含多糖、酚类化合物植物组织总RNA的提取。
背景技术：
荔枝是我国热带、亚热带地区的著名特色果树，对它的研究已经引起人们的广泛重视。就荔枝遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态学及植物生理方面进行的，逐步已经转向运用分子生物学的方法对其进行分子方面的研究。植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，也是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。利用分离得到的纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于 Northern杂交，mRNA纯化、构建cDNA文库、通过RT-PCR分离基因以及进行蛋白质体外翻译等分子生物学实验操作。常用的植物组织总RNA提取方法有胍法、苯酚法、Tris-硼酸法、 CTAB法、TRIZOL试剂盒法等，这些方法已经被广泛用于许多植物组织总RNA的提取，但有一些植物组织中内含物极为复杂，尤其是在富含多糖、多酚、单宁及一些尚未能确定的次生代谢物等情况下，不利于RNA的分离和纯化，因此能否有效地去除或抑制多糖、酚类等代谢物的干扰是提取高质量植物RNA的成败关键。在完整的细胞内，多酚类化合物、多糖、蛋白质、花色素苷等和一些未知次级代谢产物在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用多糖形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；酚类化合物极易被氧化为褐色物质，然后与RNA不可逆的结合，导致RNA活性丧失及在用氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取荔枝总RNA的方法，操作简单，提取成本低，重复性好，适用性广，能获得高质量、高浓度的RNA，为进一步分子生物学研究奠定了基础，结果准确、有效。本发明所提供的一种提取荔枝总RNA的方法，其具体步骤如下1、将采集的用液氮进行速冻处理的荔枝嫩叶片样品，加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 及液氮进行研磨成细粉后，转入离心管中，加入已于-20°C进行预冷的70%丙酮，混勻，抽提，4°C，8000 13000g，离心10 20min，弃上清液；重复抽提2 3次，保留抽提过的植物材料；2、在步骤(1)抽提后的植物材料中加入于60°C预热的RNA提取液5. 5ml，并于 60 °C 水浴 10-30min ；所述RNA 提取液是由如下组分组成Tris Base 150mmol/L, H3B03 575mmol/L、 EDTA 50mmol/L(pH = 8· 0)、NaCl 0. 5mol/L,SDS4% (质量比)；3、在步骤(2)所得水浴后的植物材料中缓慢加入200 μ 1 β -巯基乙醇、1. 375ml无水乙醇和605 μ 1 5mol/L的KAc (pH = 4. 8)，混勻，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液， 混勻，4°C，8000 13000g，离心30min ；所述氯仿/异戊醇混合液是将氯仿、异戊醇按体积比为M 1的比例混合而成； 4、吸取离心后的上清液，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混勻，40C，8000 13000g,离心30min ；取上清液重复上述步骤2 3次；5、将步骤(4)得到的上清液置入离心管中，加入1/3体积的9mol/L的LiCl溶液，-20°C放置3 5小时；4°C，10000 14000g，离心15 30min，收集沉淀；6、用 1/4 体积的 3mol/L 的 LiCl 洗涤沉淀，4°C，10000 14000g,离心 15 30min,
弃上清；7、将步骤(6)洗涤后的沉淀进行干燥，然后加入DEPC灭菌水溶解沉淀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液进行抽提一次，4°C，10000 14000g，离心15 30min ；8、取上清液，加入4倍于上清液体积的无水乙醇和1/10体积的5mol/L的KAc (pH =4. 8)，-20°C放置 Ih ；4°C，14000g，离心 30min ；9、沉淀用75%乙醇洗涤两次，在室温下晾干后用DEPC灭菌，然后用溶剂将沉淀溶解，在_80°C中保存备用。所述溶剂是RNase-free水或乙醇。本发明与现有技术相比，采用预冷的丙酮连续抽提，去除了荔枝叶片中大量的原花色素等物质，防止其在氧化后和RNA结合，解决了以往在提取后所得沉淀总呈褐色的困扰，利用PVP和β-巯基乙醇防止多酚化合物氧化为醌类，而且β-巯基乙醇作为强还原剂既能防止多酚的氧化，还可以有效地打断多酚氧化酶的二硫键，使之失活。有效地防止多酚化合物与RNA结合，有效地抑制了酚类物质对RNA的影响。采用高浓度LiCl沉淀、低浓度 LiCl清洗的方法，Li+可将未被氧化的酚类化合物去除，也能将部分多糖及次生代谢物留在上清液中，使RNA更易沉淀。同时采用KAc沉淀多糖法，适量的KAc能选择性沉淀RNA，而多糖和蛋白等不沉淀，达到RNA和杂质的分离。本发明与已有的提取方法相比，操作简单，提取成本低，重复性好，适用性广，能获得高质量、高浓度的RNA，为进一步分子生物学研究奠定了基础。同时，该方法还可以用与富含多糖、多酚类物质的其它物种的植物组织总RNA的提取。
图1为琼脂糖凝胶电泳检测荔枝组织总的总RNA，电泳后用凝胶成像系统拍照所记录的实验结果的效果图。
具体实施例方式下面用实施例对本发明作进一步说明。实施例、1、实验药品的配制与实验用品的处理(1)实验药品的配制RNA提取液Tris Base 150mmol/L、H3BO3 575mmol/L、EDTA 50mmol/L(pH = 8· 0)、 NaClO. 5mol/L、SDS 4% ；9M LiCl(用 0· 1 % DEPC-H2O 处理)
5M KAC (pH = 4. 8)(用 0. 1 % DEPC-H2O 处理)75%乙醇(用DEPC处理过的foiase-free的H2O配制)10 X TAE (Tris-乙酸)电泳缓冲液48. 4g Tris, 11. 42ml 乙酸，20ml 0. 5M EDTA (pH = 8. 0)氯仿/异戊醇混合液=氯仿异戊醇(v/v) = 24 1(2)实验用品的处理RNA提取中所有的溶液除含Tris外，均用0. 1 % DEPC-H2O配制，于37°C温浴12小时，并经120-130°C灭菌30-60分钟；含iTris的溶液则用DEPC处理过的foiase-free的H2O, 经高压灭菌后直接配制。玻璃、陶器、金属等能经高温的器皿于180°C连续烘烤8-12小时， 塑料离心管、枪头等均用0. 1% DEPC-H2O浸泡过夜后120-130°C灭菌30-60分钟，电泳槽及加样梳用双氧水室温浸泡15-20分钟，再用无水乙醇搽洗，最后用0. 1% DEPC灭菌水冲洗。2、取材荔枝幼嫩的叶，采集后快速置于用DEPC灭菌处理过的塑料管中，放入装有液氮的容器中速冻，带回实验室后贮于-80°C低温冰箱中保存备用；3、具体操作方法(1)取采集的用液氮处理的荔枝叶片样品约lg，加入PVP (聚乙烯吡咯烷酮)及液氮研磨成细粉后，转入50ml离心管中，加入提前放置_20°C冰箱预冷的70%丙酮(一般按 0. Ig材料/Iml丙酮的比例加入)，振荡混勻，进行抽提，4°C，11000g，离心15min，弃上清液， 重复抽提3次，保留抽提过的植物材料。(2)在步骤⑴抽提后的植物材料中加入已于60°C预热的RNA提取液5. 5ml，并于 60°C 水浴 25min。RNA 提取液可按如下方法配置Tris Base 150mmol/L, H3B03575mmol/L, EDTA 50mmol/L(pH = 8· 0)，NaCl 0. 5mol/L, SDS 4%(3)在步骤( 所得的植物材料中缓慢加入200 μ 1 β -巯基乙醇、1. 375ml无水乙醇和605 μ 1 5mol/L的KAc (pH = 4. 8)，混勻，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混勻，4°C，12000g，离心 30min ；(4)吸取离心后的上清液，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混勻，4°C， 12000g，离心30min ；取上清液重复上述步骤3次；(5)取上清液，转入1. 5ml的离心管中，加入1/3体积的9mol/L的LiCl，_20°C放置3-5小时；4°C，14000g,离心30min,收集沉淀；(6)用1/4体积的3mol/L的LiCl洗涤沉淀，4°C，14000g,离心20min,弃上清；(7)待沉淀干燥后，向试管中加入DEPC灭菌水溶解沉淀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液抽提一次，40C，14000g,离心30min ；(8)取上清液，加入4倍上清液体积的无水乙醇和1/10体积的5mol/L的KAc (pH =4. 8)，-20°C放置 Ih ；4°C，14000g，离心 30min ；(9)沉淀用75 %乙醇洗涤两次，在室温下晾干后用RNase-free水溶解沉淀， 在-80°C中保存备用。4、RNA样品纯度、浓度和完整性鉴定(1)紫外分光光度计检测取1 RNA样品稀释100倍，在紫外分光光度计上测定0拟60、0D280,计算检测RNA的纯度和浓度。
公式RNA 纯度=0D260/0D280公式RNA 浓度(μ g/ μ 1) = 0D260 X 40 μ g/ml X 100 倍 X 10_3ml/ μ 1实验中测得样品RNA的0拟60/0D280在1. 7_2. 0之间，说明RNA样品中没有蛋白质污染和其他干扰物质，纯度较高。如果样品中存在多糖，它会与RNA结合形成胶状复合物， 在230nm和^Onm处有强的光吸收，干扰RNA样品紫外吸收值的测定。(2)琼脂糖凝胶电泳检测取2μ IRNA样品，用1. 0%琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为 1 X TAE,用Goldveiwer染色，在电压是90V的条件下，电泳30min，在紫外凝胶成像仪上观察 RNA分子的大小、完整性、电泳条带的清晰度，并进行拍照，记录实验结果如图1。图1可以看出，用本发明所提取的总RNA可以出现三条带(即28s、18s和&)，其中28s和18s的带型整齐清楚，5s的带非常暗淡，点样孔正常、无发亮拖带现象，说明其多糖去除较干净，此法提取的总RNA完整性较好，降解较少。
权利要求
1.一种提取荔枝总RNA的方法，其特征是包括如下步骤1)、将采集的用液氮进行速冻处理的荔枝嫩叶片样品，加入PVP及液氮进行研磨成细粉后，转入离心管中，加入已于-20°C进行预冷的70 %丙酮，混勻，抽提，4°C，8000 13000g，离心10 20min，弃上清液；重复抽提2 3次，保留抽提过的植物材料；2)、在步骤(1)抽提后的植物材料中加入于60°C预热的RNA提取液5.5ml，并于60°C水浴 10-30min ；所述 RNA 提取液是由如下组分组成Tris Base 150mmol/L, H3B03 575mmol/ L、EDTA 50mmol/L、NaCl 0. 5mol/L、SDS 4% ；3)、在步骤( 所得水浴后的植物材料中缓慢加入200μ 1 β-巯基乙醇、1.375ml无水乙醇和605 μ 1 5mol/L的KAc，混勻，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混勻，4°C， 8000 13000g，离心30min;所述氯仿/异戊醇混合液是将氯仿、异戊醇按体积比为M 1 的比例混合而成；4)、吸取离心后的上清液，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混勻，4°C，8000 13000g，离心30min ；取上清液重复上述步骤2 3次；5)、将步骤⑷得到的上清液置入离心管中，加入1/3体积的9mol/L的LiCl溶液，-20°C放置3 5小时；4°C，10000 14000g，离心15 30min，收集沉淀；6)、用1/4体积的3mol/L的LiCl洗涤沉淀，4°C，10000 14000g,离心15 30min,弃上清；7)、将步骤(6)洗涤后的沉淀进行干燥，然后加入DEPC灭菌水溶解沉淀，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液进行抽提一次，4°C，10000 14000g，离心15 30min ；8)、取上清液，加入4倍于上清液体积的无水乙醇和1/10体积的5mol/L的KAc(pH = 4. 8)，-20°C放置 Ih ；4°C，14000g，离心 30min ；9)、沉淀用75%乙醇洗涤两次，在室温下晾干后用DEPC灭菌，然后用溶剂将沉淀溶解， 在-80°C中保存备用。
2.根据权利要求1所述的提取荔枝总RNA的方法，其特征在于所述溶剂是 RNase-free /K或乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种提取荔枝总RNA的方法，是将采集的用液氮处理的荔枝叶片样品经研磨后用丙酮进行抽提；在抽提过的植物材料中加入RNA提取液进行提取，离心，将上清液用LiCl进行沉淀，离心后收集沉淀；用LiCl溶液洗涤沉淀，离心，弃上清；待沉淀干燥后，用DEPC灭菌溶剂溶解沉淀，在-80℃中保存备用。本发明与已有的提取方法相比，操作简单，提取成本低，重复性好，适用性广，能获得高质量、高浓度的RNA，为进一步分子生物学研究奠定了基础。同时，该方法还可以用与富含多糖、多酚类物质的其它物种的植物组织总RNA的提取。
文档编号C12N15/10GK102191239SQ20101015042
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者印华, 吴志祥, 周兆德, 王令霞, 羊辛凤, 陶忠良 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所