专利名称：一种从龙眼果皮中提取过氧化物酶方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的提取方法，特别是从龙眼果皮中提取过氧化物酶方法。
背景技术：
过氧化物酶是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶，催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应。植物过氧化物酶的研究可追溯到1809年用愈创树脂为底物进行的颜色反应。但直到一个世纪之后才开展此酶的分离和命名。已知的催化反应底物超过200种，以及多种过氧化物和辅助因子。迄今被研究最深入的应首推辣根过氧化物酶。早在1940年，Thorell即用电泳方法从部分纯化的辣根组织中区分出2种不同的辣根过氧化物酶，之后此酶在植物正常和应激反应代谢中发挥重要作用而受到广泛关注，并对此酶进行了大量研究，涉及酶的种类、等电点、氨基酸组成和序列、生理功能，以及基因表达和调控的分子机制等(Fujiyama等1988，Siegel等1993，Van Huyster等1987，Obinger等1996)。迄今此酶作为一种商品化试剂也广泛用于免疫组织化学、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，并成为重要的诊断试剂。
过氧化物酶在果实采后中的生理作用一般认为是不断清除细胞中产生的自由基和活性氧，减少膜脂过氧化，延缓衰老(陈新平等1994)。有研究认为，采后贮藏过程中，过氧化物酶活性是上升的(韩冬梅等2002，许秀淡等1998，陈向明2001，孙秀兰等2001，陈志宏等1997)，也有研究认为采后贮藏过程中，过氧化物酶活性是下降的(叶茂宗等1997，陈彦等2002)，还有的研究认为采后贮藏过程中过氧化物酶活性是随着贮藏时间的延长，伴随着果实的衰老先上升然后下降(陈蔚辉等2000，寇晓虹等2000a，寇晓虹等2000b，文泽富等1998，檀建新等1997，田世平等2001，潘东明等1998 2001，宋虎卫2001)。
过氧化物酶可作为果蔬成熟衰老的生理指标，果实成熟和衰老则过氧化物酶的活性降低。过氧化物酶在果实成熟中的作用也因物种而异。因此，提取和纯化过氧化物酶很有意义。
技术内容本发明的目的是从龙眼果皮中提取过氧化物酶，为利用生物技术培育耐贮藏的龙眼品种提供试验制剂。
本发明以龙眼果皮为原料，经液氮处理3～5min，-20℃保存备用；具体提取方法经粗酶抽提、(NH4)2SO4盐析后，再由以下步骤完成1、Sephadex G-25 Medium柱脱盐，以0.01M pH8.0 Tris-HCl洗脱，流速为2-6ml/min；2、DE-52柱层析，以0～0.3M NaCl梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min；3、羟基磷灰石high resolution柱层析，以0.01M pH7.0磷酸缓冲液洗脱，流速为0.2-0.6ml/min；4、Sephacryl S-200 HR柱层析，以0.05M pH7.0磷酸缓冲液洗脱，流速为0.25-0.6ml/min。
附图为过氧化物酶经Sephacryl S-200 HR柱层析后的电泳检测图。
具体实施例为充分公开本发明的一种从龙眼果皮中提取过氧化物酶方法，现结合具体实施例加以说明。
(1)选取无病虫害的龙眼果皮，洗净，经液氮处理后按照果皮质量Tris-HCl缓冲液体积为1∶6加入4℃的0.1M pH7.0 Tris-HCl缓冲液；按照Trtiton X-100体积Tris-HCl缓冲液体积为1∶1000加入TrtitonX-100；再加入占果皮质量15％的聚乙烯聚吡咯烷酮，匀浆；再用四层纱布过滤，19000×g 4℃离心20min，此时的上清液取名为上清液A(以下类推)，弃去沉淀，获得上清液A即为粗酶液；(2)在上清液A中加入(NH4)2SO4粉末，0℃条件下边加边搅拌至30％饱和度，搅拌0.5h后，19000×g 4℃离心20min，弃去沉淀，获得上清液B；(3)在上清液B中加入(NH4)2SO4粉末，0℃条件下边加边搅拌至80％饱和度，搅拌1h，20000×g 4℃离心20min，弃去上清，获得沉淀物A；(4)将沉淀物A用0.05M pH8.0 Tris-HCl悬浮，15000×g 4℃离心10min，弃沉淀，获得上清液C；
(5)将上清液C上Sephadex G-25 Medium柱，用0.01M pH8.0Tris-HCl以流速3ml/min洗脱，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液A；(6)将洗脱液A上DE-52柱，以0～0.3M NaCl梯度洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液B；(7)将洗脱液B用PEG20000浓缩，获得洗脱液C，再用0.01M pH7.0磷酸缓冲液透析，获得洗脱液D；(8)将羟基磷灰石high resolution柱，以0.01M pH7.0磷酸缓冲液平衡，再将洗脱液D上羟基磷灰石high resolution柱层析，流速为0.5ml/min，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液E；(9)将洗脱液E用PEG20000浓缩，获得洗脱液F，再用0.05M pH7.0磷酸缓冲液透析，获得洗脱液G；将Sephacryl S-200 HR柱以0.05MpH7.0磷酸缓冲液平衡，再将洗脱液G上Sephacryl S-200 HR柱层析，流速为0.5ml/min，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液H；(10)超滤浓缩洗脱液H，即可获得龙眼过氧化物酶的纯酶。
(11)活性检测，其反应混合液由50ml 0.2M PBS(pH6.0)加H2O2(34％)0.028ml再加愈创木酚0.019ml混合而成；测定时取10μL酶液加反应混合液3ml混匀，反应5分钟，用分光光度计测定波长470nm时的吸光值变化以表示过氧化物酶活性。
(12)电泳检测，如附图所示，P为酶染、Q为银盐染色、M为NativeMarker。银盐染色(附图中Q)显示，经Sephacryl S-200 HR柱层析后得到的过氧化物酶酶活组分中，含有4种不同分子量的蛋白质。而酶染(附图中P)的结果也表明，其中含有4条酶带，并且其迁移率与银盐染色(附图中Q)显示的4个组分的迁移率完全一致。说明经Sephacryl S-200HR柱层析后分离得到的过氧化物酶中已没有其他杂蛋白组分存在。
本发明的一种从龙眼果皮中提取过氧化物酶方法，具有取材方便、方法简单、成本低且酶的活性高等优点，可以获得高纯度的过氧化物酶。另外，以罐头厂生产龙眼罐头废弃的果皮为原料，不仅更降低了提取过氧化物酶的成本，而且还减少了废果皮造成的环境污染。
权利要求
1.一种从龙眼果皮中提取过氧化物酶方法，其特征在于由以下方法组成(1)选取无病虫害的龙眼果皮，洗净，经液氮处理后按照果皮质量Tris-HCl缓冲液体积为1∶6加入4℃的0.1M pH7.0 Tris-HCl缓冲液；按照Trtiton X-100体积Tris-HCl缓冲液体积为1∶1000加入Trtiton X-100；再加入占果皮质量15％的聚乙烯聚吡咯烷酮，匀浆；再用四层纱布过滤，19000×g 4℃离心20min，弃去沉淀，获得上清液A；(2)在上清液A中加入(NH4)2SO4粉末，0℃条件下边加边搅拌至30％饱和度，搅拌0.5h后，19000×g 4℃离心20min，弃去沉淀，获得上清液B；(3)在上清液B中加入(NH4)2SO4粉末，0℃条件下边加边搅拌至80％饱和度，搅拌1h，20000×g 4℃离心20min，弃去上清，获得沉淀物A；(4)将沉淀物A用0.05M pH8.0 Tris-HCl悬浮，15000×g 4℃离心10min，弃沉淀，获得上清液C；(5)将上清液C上Sephadex G-25 Medium柱，用0.01M pH8.0 Tris-HCl以流速为2-6ml/min洗脱，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液A；(6)将洗脱液A上DE-52柱，以0～0.3M NaCl梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液B；(7)将洗脱液B用PEG20000浓缩，获得洗脱液C，再用0.01M pH7.0磷酸缓冲液透析，获得洗脱液D；(8)将羟基磷灰石high resolution柱，以0.01M pH 7.0磷酸缓冲液平衡，再将洗脱液D上羟基磷灰石high resolution柱层析，流速为0.2-0.6ml/min，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液E；(9)将洗脱液E用PEG20000浓缩，获得洗脱液F，再用0.05M pH7.0磷酸缓冲液透析，获得洗脱液G；将Sephacryl S-200 HR柱以0.05M pH7.0磷酸缓冲液平衡，再将洗脱液G上Sephacryl S-200 HR柱层析，流速为0.25-0.6ml/min，收集洗脱液，检测并合并有酶活性的洗脱液，获得洗脱液H；(10)超滤浓缩洗脱液H。
全文摘要
一种从龙眼果皮中提取过氧化物酶方法，包括粗酶液的提取、(NH
文档编号C07K1/00GK1488752SQ0315780
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月27日 优先权日2003年8月27日
发明者潘东明, 林琳, 郭志雄 申请人:福建农林大学