双丁二酮化合物、铕配合物、含该配合物的组合物及其用途的制作方法

专利名称：双丁二酮化合物、铕配合物、含该配合物的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型双丁二酮化合物、含该化合物作为配位体的铕配合物以及含该铕配合物的组合物。本发明还涉及所述组合物在化学发光免疫分析中的用途。
背景技术：
迄今为止，生物体内微量生物活性物质的免疫测定方法已经历了由放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(FIA)、酶联免疫分析(EIA)，以及化学发光免疫分析等诸阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的需求的不断提高而决定的。
正如放射免疫(RIA)分析技术当年从发明到应用的推陈出新的历程一样，化学发光免疫定量检测法成为现今取代放射免疫分析的有力分析手段和技术。在国际领域内，化学发光免疫定量检测法已成为临床检验的一个非常重要的新技术和检测手段，并将延展至临床检验的各个领域，这也是临床检验界的一致共识。
化学发光免疫分析法是一种利用化学发光物质发射的光波进行检测的方法。化学发光物质作为标记应用于核酸检测与免疫检测中。例如，可通过多种途径将特异结合对中的某一分子与发光物质结合形成发光复合物。该复合物可与样品中被检测物(特异结合对中的另一分子)反应，分配于固相与液相中，且分配比例与检测物的量相关。通过测定固相或液相中发光量，即可得出样品中检测物的相应浓度。
具体地说，在均相条件下，将包被有活性分子并且内部带有染料的感光微球(纳米级)以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和有可能含有目标分子的检测样品混合。此时包被有活性分子的纳米感光微球和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉目标分子，纳米感光微球、纳米发光微球和目标分子一起形成近距离的夹心复合物。经激发光照射，纳米感光微球中的染料被诱导激活并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物。发光微球中的发光化合物可于数微秒后在零背景无干扰的情况下释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子并通过电脑将光子数量换算为目标分子浓度，光子数量的多少即精确地反映了目标分子的浓度。
美国专利5,709,994公开了一种测定目标分子的方法，它包括对可能含有目标分子的组合物进行光辐照的步骤，所述组合物包括非颗粒基质或颗粒基质，所述基质包被有经光辐照会产生单线态氧的光敏剂和可被所述单线态氧活化的化学发光化合物。它还具体公开了所述化学发光化合物选自9-亚烷基-N-甲基吖啶、烯醇醚和烯胺，所述光敏剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。但是，这种光敏剂和化学发光化合物形成的特异结合对具有发光效率低的缺点。
美国专利5,780,646公开了一种组合物，它包括(a)一种至少六配位的金属鳌合物和(b)一种具有两个芳基的带双键的化合物。它还提到所述化合物(b)可具有如下通式 其中，X′是S；D和D′各自选自CH3和(CH2)9CH3，R′为(CH2)6CH3或者(CH2)7CH3。
所述金属鳌合物(a)可具有下列通式 (3a)
(3b)它还公开了在上式(3a)和(3b)中的一个TTA可被一个下述分子所代替 或者，上式(3a)和(3b)中的两个TTA可各自被选自下列分子的基团所代替
(3n) (3o) (3r) 或者，三个TTA可各自被选自下列分子的基团所代替
与现有技术相比，美国专利5,780,646通过加入铕配合物极大地提高了发光效率，从而提高了检测灵敏度。但是，这种方法还存在如下缺点由于现有的铕配合物鳌合度不够，金属铕离子会鳌合在纳米微球的表面，造成纳米微球表面包被容量下降。并且降低了发光效率。在将这种含所述金属鳌合物(a)和所述具有两个芳基的带双键的化合物(b)的组合物置于纳米级发光微球中以后，发现发光微球的包被容量下降最高达40％；发光效率下降了30％-40％。
因此，需要开发一种新的、具有很强的鳌合力的金属鳌合物，它可以避免金属铕离子与纳米微球表面基团的反应，从而避免了纳米微球表面包被容量以及发光效率的下降。
发明的内容鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的一个目的是提供一种新型的发光组合物，它不会影响发光颗粒的包被容量并且显著提高了发光球的发光效率，尤其提高了检测信号值。
本发明的另一个目的是提供一种用于免疫分析的双丁二酮化合物。
因此，本发明提供一种具有如下通式的双丁二酮化合物 其中X是具有1-5个碳原子直链烷基或者具有下式的芳基，其中Y是1-5个碳原子的直链或支链烷基取代基 或者 本发明还提供一种化学发光组合物，它包括
1)带有本发明双丁二酮化合物作为配位体的铕配合物；2)具有下列通式的含烯键化合物 其中，X′是S或NR，R是具有1-10个碳原子的烷基或者6-18个碳原子的芳基；R′是氢原子或者具有1-10个碳原子的烷基；D和D′各自为氢原子或者具有1-20个碳原子的烷基。


图1是光激化学发光免疫分析系统(LICA)检测原理图，其中图1a是包被第一抗体并含有光敏试剂的光敏微球的示意图；图1b是加入检测试样后被检测抗原与第一抗体结合的示意图；图1c是加入包被有第二抗体并含有发光组合物的微球的示意图；图1d是光致发光的示意图。
具体实施例方式
在本发明中，除非另有说明，否则术语“烷基”是指具有1-10个碳原子、较好1-6个碳原子，更好1-4个碳原子的直链或支链烷基，它包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基、壬基、癸基等。
在本发明中，术语“芳基”是指具有6-18个环碳原子的芳香基团，它可以是未取代的，或者被具有1-10个碳原子的烷基所取代。
图1是本发明光激化学发光免疫分析系统(LICA)检测原理图。如图1a所示，纳米级的微球10中带有光敏剂，该微球表面包被有第一抗体1。如图1b所示，当将包被有第一抗体1并含有光敏剂的纳米微球加入含被检测抗原2的试样中以后，第一抗体1会与抗原2相结合。如图1c所示，发光微球20是含有发光组合物的纳米微球，它表面包被有第二抗体3。当将所述发光微球20加入上述试样中以后，该发光微球上包被的第二抗体3也会与已经与第一抗体1结合的抗原2相结合，形成夹合体。如图1d所示，当用激光辐照光敏微球以后，光敏微球中的光敏剂会放出单线态氧，该单线态氧被发光微球中的发光组合物俘获后，会激发发光组合物中的发光化合物，发出特定波长的光线。通过检测该波长的光线就可测定抗原的量。
下面结合附图更详细地说明本发明。
一.光敏微球用作本发明光敏微球10的纳米级微球基质是本领域已知的微球基质，例如，它可以是例如羧基改性的乳胶颗粒。这种颗粒的详细情况可参见美国专利5,709,994与5,780,646(该文献在此全文引为参考)。
用于光敏微球中的光敏剂无特别的限制，它可以是本领域已知的光敏剂，其非限定性例子有例如美国专利5,709,994公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。
在光敏微球中光敏剂的载带量无特别的限制，它可以是本领域常用的量。适用于本发明的光敏微球以及第一抗体的包被方法可例如参见美国专利5,709,994与5,780,646。
用于将光敏剂加入纳米微球的方法以及包被该光敏微球的方法可以是本领域常用的任何方法。这种方法可例如参见美国专利5,709,994与5,780,646。
二.发光微球1.基质用作本发明发光微球20的纳米级微球基质是本领域已知的微球基质，它可以与所述光敏微球基质相同或不相同。例如，它可以是例如羧基改性的乳胶颗粒。这种颗粒的详细情况可参见美国专利5,780,646和5,709,994(该文献在此全文引为参考)。
2.发光组合物本发明发光微球中所含的发光组合物包括一种带双丁二酮化合物作为配位体的铕配合物和一种含不饱和烯键的化合物。这两种组分的含量无特别的限制，只要能使该组合物的发光效率满足最终免疫分析即可。在本发明的一个较好实例中，所述铕配合物占10-400mg/g微球，较好占50-200mg/g微球，更好占100mg/g微球；所述含不饱和烯键的化合物较好占50-500mg/g微球，更好占100-300mg/g微球，最好占200mg/g微球。
a.含烯键的化合物适用于本发明组合物的含烯键的化合物具有如下通式 其中，X′是S或NR，R是具有1-10个碳原子的烷基或者6-18个碳原子的芳基；R′是氢原子或者具有1-10个碳原子的烷基；D和D′各自为氢原子或者具有1-20个碳原子的烷基。
在本发明中，X′可以是NR，其中R是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基或者6-18个碳原子的取代或未取代的芳基。在本发明的一个较好实例中，所述R基团是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，较好为1-4个碳原子的直链或支链烷基。在本发明的另一个较好的实例中，所述R基团是具有6-18个碳原子的芳基，它选自例如苯基、被具有1-10个碳原子的烷基取代的苯基；所述烷基取代基的例子有甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、己基、庚基、辛基、异辛基等。
在本发明的一个较好实例中，所述含烯键的化合物具有如下通式 其中，D和D′各自选自氢原子或者具有1-20个碳原子的直链或支链烷基，较好为具有6-20个碳原子直链或支链烷基、更好为具有6-15个碳原子的直链或支链烷基，优选为(CH2)5CH3或者(CH2)13CH3；R′为氢原子或者具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，较好为具有1-6个碳原子直链或支链烷基、更好为具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，优选为(CH2)6CH3或者(CH2)7CH3。
在本发明的另一个较好实例中，所述含烯键的化合物具有如下通式
其中，D和D′各自选自(CH2)5CH3或者(CH2)13CH3；R′为氢原子、(CH2)6CH3或者(CH2)7CH3。
在本发明再一个较好的实例中，所述含烯键的化合物是如下化合物 其中各取代基的含意见下表A表A化合物 XArAr′1O 2S 3S 4S
5S 6 7 本发明上述含烯键的化合物的合成方法是本领域众所周知的。例如，它可采用美国专利5,780,646所述的方法合成。
b.双丁二酮配位体适用于本发明铕配合物的双丁二酮配位体具有如下通式 其中，X是具有1-5个碳原子直链烷基或者具有下式的芳基，其中Y是氢原子或者是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基取代基 或者 在本发明的一个较好实例中，所述X基团选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、邻亚苯基、3-甲基-1，2-亚苯基、4-甲基-1，2-苯基、3-乙基-1，2-亚苯基、4-乙基-1，2-苯基、2，3-亚萘基、1，8-亚萘基、4-甲基-1，8-亚萘基、3-戊基-1，2-亚苯基、4-己基-1，2-苯基、5-庚基-2，3-亚萘基、5-(2′-甲基己基)-2，3-亚萘基、4-乙基-1，8-亚萘基、5-甲基-1，8-亚萘基、4-丙基-1，8-亚萘基、4-甲基-2，3-亚萘基、4-乙基-2，3-亚萘基、5-甲基-2，3-亚萘基、4-丙基-2，3-亚萘基。
适用于本发明的双丁二酮化合物的非限定性例子有，例如下列化合物1)1，1-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)甲烷；
2)1，2-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)乙烷；3)1，3-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丙烷；4)1，6-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丁烷；5)4，4′-二(1″，1″，1″-三氟-2″，4″-丁二酮-4″-基)邻联三苯；6)3-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；7)4-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；8)3-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；9)4-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；10)2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；11)5-庚基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；13)4-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
17)1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；18)5-庚基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；13)4-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
以X是苯基为例，在本发明的一个较好实例中，所述配位体是将二苯基取代的X化合物与乙酰卤反应，形成二(对甲基羰基苯基)取代的X化合物，随后再使得到的二(对甲基羰基苯基)取代的X化合物与三氟乙酸乙酯反应，生成本发明双丁二酮化合物。本发明双丁二酮化合物的合成路径如下
c.带本发明双丁二酮配位体的铕配合物本发明铕配合物可用通式Eu2(X″)3(DYE)2表示，其中，DYE是本领域常用的染料，其非限定性例子有例如TOPO(三辛基氧膦)或者DPP。较好是DPP(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉)，它是一类常用的染料，它具有下列结构 该配合物中配位体X″是本发明双丁二酮化合物，而染料DYE可采用本领域常用的方法制得，或从化学公司购得。
3.发光球的制造方法将所述铕配合物放入纳米发光球中的方法以及包被该发光球的方法可以是本领域常用的任何方法。在本发明的一个较好实例中，采用美国专利5,780,646公开的发光球制造方法，只是用本发明带双丁二酮配位体的铕配合物代替其金属螯合物。
在本发明的另一个较好实例中，使用本发明铕配合物形成的新型发光组合物不会影响发光颗粒的包被容量并且显著提高了发光球的发光效率，尤其提高了检测信号值，从而减少了测量误差。
下面，结合实施例进一步说明本发明测试方法1.包被容量取一组不同浓度的葡聚糖标准溶液分别加入1mL蒽酮，在85℃孵育30分钟。冷却至室温后，测定不同溶液在636nm处的吸光光度值(日立U-3000型分光光度计，购自日本日立公司)制得标准曲线。
在样品纳米发光球上包被葡聚糖，随后加入1ml蒽酮，在85℃，孵育30分钟。冷却至室温后，测定其在636nm处的吸光光度值，根据标准曲线计算微球表面的包被容量。
2.发光效率取等体积500μl的包被有抗体的感光球(50μg)与发光球(6.25μg)，加入50μl抗原与100μl作为检测缓冲液的50mM磷酸盐缓冲液(购自Sigma)混合。37度温育15分钟后，利用PMT光子计数器(购自上海朋远泰生物技术有限公司)读取光子数。
合成例1合成含不饱和烯键的化合物(A)将34.4g(0.2mol)溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代十四烷及0.6mol二异丙基乙胺，反应溶液加热到100℃，然后反应12小时。反应的溶液加入300ml二氯甲烷，水洗三次除去DMF。去除二氯甲烷，产物用乙醇重结晶。得到N，N-二取代的对溴苯胺(式I化合物)，反应的产率为70％ D＝D′＝C14H29向一个装有滴液漏斗、温度计和回流冷凝管的I ml圆底三颈烧瓶中加入100ml干燥的THF，随后加入3g金属镁条，在回流条件下加入少量上面得到的N，N-二取代的对溴苯胺产物(式I化合物)以启动反应，并加入少量的碘以帮助反应启动。将0.11mol上述N，N-二取代的对溴苯胺产物(式I化合物)溶解于50ml干燥的THF中，并置于滴加漏斗中，缓缓地滴加此溶液并保持回流。加液完毕后让反应回流1小时。用冰浴冷却反应体系，在℃时缓缓地滴加0.1mol下式(II)化合物(购自Aldrich/Sigma)的50ml THF溶液。让反应在0℃进行30分钟，然后放置于室温2小时。缓缓地加入0.1N HCl溶液以水解生成的镁盐。加入200mlCH2Cl2，然后用水洗涤有机层2-3次。有机层用无水硫酸钠干燥。用硅胶柱分离所需产品。用20％乙酸乙脂80％正乙烷溶液分离产品，产品的Rf值在0.5左右。(20％乙酸乙脂/80％正乙烷/TLC)纯化后的产品(式III化合物)产率为35％。
在一个带有冷凝管的500ml圆底烧瓶中将0.1mol上述式III化合物溶解在100ml甲苯中，加入少量ZnCl2及0.11mol式IV化合物。回流并去除生成的水。反应4小时反应基本完成。用旋转蒸发仪去除多余的甲苯。然后用硅胶柱分离纯化最后的产品(用95正乙烷，5％乙酸乙脂)，得到化合物A，产率为60％。
1H NMR7.0ppm-7.26ppm(多重峰，7H)，6.42ppm-6.44ppm(多重峰，2H)，4.48ppm-4.50ppm(多重峰，2H)，3.16ppm-3.32ppm(多重峰，4H)，1.52ppm-1.57ppm(多重峰，4H)，1.3ppm(多重峰，44H)，0.86ppm(3重峰，6H)。
合成例2合成含不饱和烯键的化合物(B)将34.4g(0.2mol)溴代苯胺溶解在125ml DMF中，加入0.6mol溴代丁烷及0.6mol二异丙基乙胺，反应溶液加热到100℃，然后反应12小时。反应的溶液加入300ml二氯甲烷，水洗三次除去DMF。去除二氯甲烷，产物用乙醇重结晶。得到N，N-二取代的对溴苯胺(式1化合物)，反应的产率为70％ 向一个装有滴液漏斗、温度计和回流冷凝管的500ml圆底三颈烧瓶中加入100ml干燥的THF，随后加入3g金属镁条，在回流条件下加入少量上面得到的N，N-二取代的对溴苯胺产物(式1化合物)以启动反应。将0.11mol上述N，N-二取代的对溴苯胺产物(式1化合物)溶解于50ml干燥的THF中，并置于滴加漏斗中，缓缓地滴加此溶液并保持回流。加液完毕后让反应回流1小时。用冰浴冷却反应体系，在℃时缓缓地滴加0.1mol下式(2)化合物(购自Aldrich/Sigm)的50ml THF溶液。让反应在0℃进行30分钟，然后放置于室温2小时。缓缓地加入0.1N HCl溶液以水解生成的镁盐。加入200mlCH2Cl2，然后用水洗涤有机层2-3次。有机层用无水硫酸钠干燥。用硅胶柱分离所需产品。用20％乙酸乙脂80％正乙烷溶液分离产品，产品的Rf值在0.5左右。(20％乙酸乙脂/80％正乙烷/TLC)纯化后的产品(式3化合物)产率为35％。
在一个带有冷凝管的500ml圆底烧瓶中将0.1mol上述式3化合物溶解在100ml甲苯中，加入少量ZnCl2及0.11mol式4化合物。回流并去除生成的水。反应4小时反应基本完成。用旋转蒸发仪去除多余的甲苯。然后用硅胶柱分离纯化最后的产品(用95正乙烷，5％乙酸乙脂)，得到化合物B，产率为60％。
1H NMR 7.0ppm-7.26ppm(多重峰，6H)，6.42ppm-6.44ppm(多重峰，2H)，4.48ppm-4.50ppm(多重峰，2H)，3.16ppm-3.32ppm(多重峰，4H)，2.2ppm(单重峰，3H).1.52ppm-1.57ppm(多重峰，4H)，0.86ppm(3重峰，6H)。1.3ppm(多重峰，4H)。
合成例3合成配位体化合物1
(1)将2.3g邻苯基联苯溶解在20ml干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl(购自Aldrich/Sigma)。滴加完成后让反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到2.6g产物(81％产率)。
1H NMR7.1-7.9ppm(多重峰，12H)，2.3ppm(单重峰，6H)(2)将1.6g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇钠)及2g CF3-C(O)OEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.6g产物(产率80％) 1H NMR 7.1-7.9ppm(多重峰，12H)，4.5ppm(单峰，4H)合成例4合成配位体化合物2
(1)，1.7g二苯甲烷溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到1.4g产物(70％产率) 1H NMR7.6-7.9(双重峰，4H)，3.1(单重峰，2H)，2.3(单重峰，6H)(2)上述1.3g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇纳)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.2g产物(产率80％) 1H NMR7.6-7.9(双重峰，4H)，4.5(单重峰，4H)，3.1(单重峰，2H)。
合成例5合成配位体化合物3(1)，2.5g甲基邻苯基联苯溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94g AlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到1.4g产物(70％产率) 1H NMR7.6-7.9(多重峰，7H)，2.1(单重峰，3H)，2.3(单重峰，6H)
(2)上述1.7g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇纳)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.6g产物(产率80％) 1H NMR7.6-7.9(多重峰，7H)，4.5(单重峰，4H)，2.1(单重峰，3H)。
合成例6合成配位体化合物4(1)，2.9g邻二苯基萘溶解在20干燥的CH2Cl2溶液中，加入2.94gAlCl3，然后冷却到0℃。在剧烈的搅拌下加入2g的CH3C(O)Cl。滴加完成后反应在室温反应1-2小时。有机溶液用水洗三次，然后用无水硫酸钠干燥。去除溶剂后得到1.4g产物(70％产率) 1H NMR7.3-7.9(多重峰，10H)，2.3(单重峰，6H)(2)上述1.9g上述产物溶解在20ml的无水乙醚中，加入1g的CH3ONa(甲醇纳)及2g CF3-COOEt(三氟乙酸乙酯)。让反应在室温下搅拌2-3小时。然后用水洗三次。有机层用无水硫酸钠干燥，除去有机溶液后得到1.8g产物(产率80％)
1H NMR7.3-7.9(多重峰，10H)，4.5(单重峰，4H)。
实施例1合成带双二丁酮配位体的铕配合物将2.932克EuCl3·6H2O与6.39克上面制得的配位体化合物1混合，加入40mL无水乙醇溶解。搅拌加入2mL NH3·H2O，pH为8左右。室温搅拌1小时。将溶液加入到800mL去离子水中，过滤溶液，收集沉淀，为10.3g。真空干燥后得到Eu(配位体化合物1)2·H2O，纯度约为90％。
取4.0克DPP与120mL乙醇加热溶解，冷却后收集重结晶晶体。称取3.014克Eu(配位体化合物1)2·H2O与0.997克DPP，加入300mL甲苯，62℃搅拌反应一小时。冷却到室温，利用旋转蒸发除去甲苯。真空干燥，收集铕配合物1。
制造发光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg合成例1制得的含烯键化合物A和100mg上面制得的铕配合物1放入200nm的纳米颗粒(购自美国BangsLaboratories，Inc)中，形成发光球Eu-A。
包被抗体取10mL上述制得的发光球(20mg/mL，50mM磷酸盐缓冲液，内部染料为含烯键化合物A与本发明制得的铕配合物1)，加入40mg Amino-Dextran(4％，缓冲体系0.05Mes buffer)，20mg EDAC(4％，缓冲体系50mM磷酸盐缓冲液)。室温搅拌反应过夜。Sorvall SA-600转头4℃离心1小时，转速为15,000rpm。离心后弃上清液，以8mL 50mM磷酸盐缓冲液重悬浮。重复离心清洗三次。
取上述制备得到的发光球(25mg/mL，50mM磷酸盐缓冲液，内部染料为含烯键化合物A与本发明制得的铕配合物1，外部包被有Dextran)0.4ml，加入8.16mgIgG1按美国专利5,780,646实施例1所述制得的本发明发光球。
制造感光球用美国专利5,780,646的实施例所述的方法将200mg叶绿素A放入200nm的纳米颗粒(购自美国Bangs Laboratories，Inc)中，并参照上述包被抗体的方法包被IgG2，形成本法明感光球。
包被容量测定用上面所述的包被容量测试方法测得本发明试样的包被容量，结果列于表1。
用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例2用与实施例1相同的方法制得实施例2的发光球，但是使用合成例2合成的带不饱和烯键化合物B和合成例4制得的配位体化合物2，制得发光球Eu-B。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例3用与实施例1相同的方法制得实施例3的发光球，但是使用合成例1合成的带不饱和烯键化合物A和合成例5制得的配位体化合物3，制得发光球Eu-C。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例4用与实施例1相同的方法制得实施例4的发光球，但是使用合成例2合成的带不饱和烯键化合物B和合成例6制得的配位体化合物4，制得发光球Eu-D。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
比较例1用与实施例1相同的方法制得发光球，但是使用TTA(噻吩三氟丁二酮)代替本发明的双丁二酮配位体制得铕配合物 实施例5用与实施例1相同的方法制得实施例5的发光球，但是使用根据美国专利5,780,646实施例2制得的上表A所列的带不饱和烯键化合物2和合成例6制得的配位体化合物4，制得发光球Eu-E。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例6用与实施例1相同的方法制得实施例6的发光球，但是使用根据美国专利5,780,646实施例3制得的上表A所列的带不饱和烯键化合物3和合成例5制得的配位体化合物3，制得发光球Eu-F。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例7用与实施例1相同的方法制得实施例7的发光球，但是使用根据美国专利5,780,646实施例4制得的上表A所列的带不饱和烯键化合物5和合成例4制得的配位体化合物2，制得发光球Eu-G。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例8用与实施例1相同的方法制得实施例8的发光球，但是使用根据美国专利5,780,646实施例5制得的上表A所列的带不饱和烯键化合物6和合成例3制得的配位体化合物1，制得发光球Eu-H。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
实施例9用与实施例1相同的方法制得实施例9的发光球，但是使用根据美国专利5,780,646实施例6制得的上表A所列的带不饱和烯键化合物7和合成例3制得的配位体化合物1，制得发光球Eu-I。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
为进行比较，表1还给出了空白微球(200nm，25mg/mL，50mM磷酸盐缓冲液，内部无染料，外部包被有Dextran)的包被容量，结果列于表1。
实施例10用与实施例1相同的方法制得实施例10的发光球，但是使用TOPO取代DPP制得发光球Eu-J。
使用与实施例1相同的感光球和包被容量试验方法测得试样的包被容量，结果列于表1用上面发光效率试验方法测得试样的发光效率，结果列于表2。
表1

表2

由试验结果可见，用本发明发光组合物填入纳米微球以后，该微球的包被容量与空白球相当，而采用现有的铕配合物包被纳米微球以后，其包被容量明显下降。另一方面，由表2可见，如果将现有的发光球的发光效率定为1，则本发明发光球的发光效率分别为1.5和1.4，明显高于现有的发光球的发光效率。上述试验证明，本发明通过改变铕配合物的配位化合物，极大地改进了纳米微球的包被容量和发光效率，取得了意想不到的效果。
在不偏离本发明发明思想的情况下，本领域的普通技术人员可容易地对本发明进行各种变化和改进。本发明包括在所附权利要求范围内的各种变化和改进。
权利要求
1.一种具有如下通式的双丁二酮化合物 其中X是具有1-5个碳原子直链烷基；或者具有下式的芳基，其中Y是1-5个碳原子的直链或支链烷基取代基 或
2.如权利要求1所述的双丁酮化合物，其特征在于所述X基团选自具有1-3个碳原子的直链烷基、 或者 其中，Y是氢原子或甲基。
3.如权利要求1或2所述的双丁酮化合物，其特征在于x选自亚甲基或邻亚苯基。
4.如权利要求1所述的双丁酮化合物，其特征在于它选自1)1，1-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)甲烷；2)1，2-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)乙烷；3)1，3-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丙烷；4)1，6-二(对(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)丁烷；5)4，4′-二(1″，1″，1″-三氟-2″，4″-丁二酮-4″-基)邻联三苯；6)3-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；7)4-甲基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；8)3-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；9)4-乙基-1，2-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)苯；10)2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；11)5-庚基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；13)4-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。17)1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；18)5-庚基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；12)5-(2″-甲基己基)-2，3-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；1 3)4-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；14)4-乙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；15)5-甲基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘；16)4-丙基-1，8-二(4-(1′，1′，1′-三氟-2′，4′-丁二酮-4′-基)苯基)萘。
5.一种化学发光组合物，它包括a)铕配合物，该铕配合物带有权利要求1-4中任一项所述的双丁二酮化合物作为配位体；2)具有下列通式的含烯键化合物 其中，X′是S或NR，R是具有1-10个碳原子的烷基或者6-18个碳原子的芳基；R′是氢原子或者具有1-10个碳原子的烷基；D和D′各自为氢原子或者具有1-20个碳原子的烷基。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于X′是硫原子。
7.如权利要求5或6所述的组合物，其特征在于R′是1-4个碳原子的烷基。
8.如权利要求5或6所述的组合物，其特征在于D和D′各自选自氢原子或者具有4-14个碳原子的烷基。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于D和D′各自选自氢原子、丁基或者十四烷基。
10.如权利要求5所述的组合物，其特征在于含烯键的化合物是具有如下结构的化合物 其中各取代基选自
11.一种铕配合物，它含有权利要求1-4中任一项所述的化合物作为配位体。
12.如权利要求11所述的铕配合物在免疫分析中的用途。
全文摘要
公开了一种化学发光组合物，它包括1)式I的铕配合物，其中X是具有1－5个碳原子直链烷基或者芳基和2)式II的含烯键化合物，其中，X′是S或NR，R是具有1－10个碳原子的烷基或者6－18个碳原子的芳基；R′是氢原子或者具有1－10个碳原子的烷基；D和D′各自为氢原子或者具有1－20个碳原子的烷基。还公开了所述化学发光组合物在免疫分析中的用途。
文档编号C07C49/00GK1696093SQ200510023820
公开日2005年11月16日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者何元 申请人:上海朋远泰生物技术有限公司