专利名称：落地生根黄酮化合物lef的制作方法
技术领域：
本发明涉及从草本植物落地生根叶中分离制备的落地生根黄酮化合物LEF(Luodishenggen Extract Flavonoids)。
背景技术：
落地生根(Bryophyllum pinnatum LF OKEN)别名土三七、打不死、大还魂和非洲不死，为多年生肉质草本植物，其叶全年可采。国内落地生根广泛分布于广东、广西、福建、台湾和云南等地。
在世界范围内，对落地生根的传统和现代医疗价值有一定的研究，有报道尼日利亚等国对落地生根叶进行了初步的医学价值评估。落地生根叶的传统医疗价值基本上体现在如下几个方面(1)治疗脑部疾病、中风与高血压(2)用于制备抗菌与消炎药剂等(3)治疗感冒(4)治疗呼吸系统疾病(5)治疗头痛(6)治疗皮肤病与过敏症。
国内有机构对落地生根提取物进行研究表明，落地生根的药用价值主要来源于其中的黄酮化合物，认为可考虑以此类化合物作为预防过敏性哮喘和治疗支气管炎的药物。此类化合物一方面能延长肾上腺素对气管的扩张作用，另一方面有明显抑制致敏豚鼠肺组织释放组胺R、SRS-A的作用，其浓度为1×10-4时，抑制组胺R释放率平均为50.7％，抑制组胺SRS-A释放率平均为62.1％。
由国际与国内的研究报道可见，落地生根从传统与现代的角度显示的良好药效，但是针对落地生根黄酮化合物的分离与制备，现在还只是停留在实验室规模。本发明通过对工业化条件的摸索，提供有具有商业价值的工业化的生产条件，并对落地生根黄酮进行HPLC制备，通过质谱，核磁共振，紫外光谱等手段，鉴定出该成分的化学结构。
发明内容
本发明的目的是从落地生根中分离制备出一种落地生根黄酮化合物LEF。
本发明制备的化合物命名为LEF(Luodishenggen Extract Flavonoids)；其分子式为C26H28O15，分子量为580；化学结构式如下 本发明所述的落地生根黄酮LEF的分离方法包括如下步骤(1)经过平行实验筛选到适合分离落地生根黄酮的弱极性大孔吸附树脂841，(2)用乙醇和三氯甲烷1∶1(体积比)比例的溶剂萃取粗品。
(3)将精制的晶体通过聚酰胺层析，在甲醇/水为66/34(体积比)时洗出目标溶液，将其收集后用旋转蒸发器浓缩结晶，得到一种深黄色晶体，其成分主要含有落地生根黄酮。
有益效果本发明首次从落地生根中分离制备出了结构确定的落地生根黄酮化合物LEF，为该药物今后的进一步研究开发打下了良好基础。
下面通过附图和具体实施方式
对本发明作进一步阐述。
图1LEF的HMQC谱2LEF的HMBC谱图具体实施方式
一)制备落地生根黄酮LEF(1)将落地生根叶用粉碎机粉碎，用工业酒精萃取得到黑褐色膏状物，用去离子水溶解上弱极性大孔吸附树脂841柱。用乙醇水溶液(80％)洗脱，得到包含落地生根黄酮的溶液，浓缩得到粗品黄酮。
(2)将乙醇和三氯甲烷以1∶1的比例(体积比)混合配制成溶剂。用配好的溶剂将粗产物溶解后抽滤，滤出的澄清溶液用旋转蒸发器浓缩结晶，得到精制产物黄色晶体。
(3)将精制的晶体通过聚酰胺层析，将精制产物用正丁醇溶解后上柱。分别用去离子水、甲醇/水为30/70(体积比)、甲醇/水为66/34(体积比)溶液洗柱。在甲醇/水为66/34时洗出液用硫酸亚铁比色法测出含有黄酮类物质，将其收集后用旋转蒸发器浓缩结晶，得到一种深黄色晶体，其中主要成分为落地生根黄酮LEF。
二)对落地生根黄酮的结构进行鉴定1.通过质谱图，得到M+1为581，M-1为579，所以得出结论落地生根黄酮分子量580。
2.通过制备色谱制备符合质谱以及核磁共振实验要求的单组分落地生根主要黄酮样品，命名为LEF(Luodishenggen Extract Flavonoids)。
3.通过核磁共振仪得到13C-NMR谱(溶剂为乙醇)和1H-NMR谱(溶剂为D2O)数据，如下表所示。
表1LEF槲皮素结构的碳谱及氢谱数据归属
表2LEF糖基结构的碳谱及氢谱数据归属
4.从1H-NMR谱和碳谱中及HMQC谱图中，得到结论分子式为C26H28O155.从13C-NMR谱和1H-NMR谱及碳氢相关谱图得到结论此化合物骨架为黄酮结构。
6.从1H-NMR谱中的甲基峰中可以得出结论，该化合物中含有甲基且该甲基位于糖基上，所以该糖基为鼠李糖基，通过13C-NMR谱和1H-NMR谱数据得到该鼠李糖为α-L-鼠李糖。
7.又由HMBC谱图得出结论，鼠李糖通过1-3位与槲皮素相连，鼠李糖通过2-1位与五碳糖相连。
8.通过13C-NMR谱及1H-NMR谱数据推测另一个五碳糖为β-D-木糖。
9.得到结论LEF的化学结构为
LEF的化学结构式实施例1.树脂预处理(1)大孔吸附树脂将树脂装入柱中，先用2～3倍(液固体积比)的丙酮淋洗，再用3～4倍(液固体积比)去离子水洗，然后继续用与树脂相同体积的1mol/L盐酸水溶液洗，完成后静置8～12小时，用去离子水将柱洗到中性，继续用1mol/LNaOH溶液洗柱至流出液为强碱性，完成后静置3～12小时后，用去离子水将柱洗到中性。
(2)聚酰胺取聚酰胺粉以1～2倍(固液体积比)体积的90～95％乙醇水溶液浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中。用3～4倍(固液体积比)体积的90-95％乙醇水溶液洗涤，洗至洗液透明并在蒸干后无残渣或极少残渣。在依次用聚酰胺的2～2.5倍(固液体积比)体积的10％醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，备用。
2.大孔树脂吸附与解吸操作条件为床层体积BV＝1527.6mL，原料液体积＝4300mL，原料液中黄酮浓度C0＝3.28mg/mL，进料流量＝0.237BV/h。
上述吸附过程完成后，用去离子水洗至流出液没有颜色。配制2500mL的80％(V/V)乙醇水溶液，以进料流量0.27BV/h进行解吸过程，直到用比色法判断有黄酮流出后开始收集。
流出液流出0.4BV时开始检测到黄酮存在，然后黄酮的含量很快开始急剧上升，并在0.7BV时达到饱和浓度，稳定了一段时间后开始下降，直到1.5BV时流出液里检测不出黄酮存在。在一段时间内，流出液中黄酮含量稳定在一个数值上，说明达到了饱和，饱和浓度是原料液浓度的8倍左右，结果得到解吸乙醇溶液2000mL，总黄酮浓度6.11mg/mL，浓缩洗脱液后得到甲醇萃取物25.5g。
3.萃取大孔树脂吸附过程除去大部分的水溶性杂质，如无机盐类和一部分色素和植物蛋白。但最后得到的粗产物中黄酮含量仍然不是很高，故采用极性较弱的乙醇和极性较强的氯仿混合溶剂，对粗产物再进行一次萃取，乙醇与氯仿之比为1∶1(体积比)，按固液比1∶40萃取甲醇萃取物粗品，浓缩过滤所得滤液，以49.04％(W/W)的产率得含量为35.95％(比色法以槲皮素计)的淡黄色产物，其液相色谱图中LEF峰面积占总峰面积的70.5％。
4.聚酰胺柱层析用正丁醇溶解后上样进行聚酰胺柱层析，以氯仿-甲醇和甲醇-水的混合溶剂，以溶剂极性由小至大的顺序梯度洗脱，分部收集仅在甲醇/水为66/34(体积比)时洗下一种纯度较高的组分，浓缩得成品，其液相色谱图中最大峰的面积占总面积的85.26％，纯度达51.23％(比色法以槲皮素计)，此步产物得率为26％(W/W)。
5.大孔树脂的后处理由于原料的数量较大，一次吸附不能处理光所有的原料，所以要将原料分批处理。当第一批树脂吸附结束后，树脂上还残留着很多乙醇溶液无法洗脱的杂质，不能马上进行下一批吸附，要先将柱洗干净。
具体方法是待解吸(洗脱)过程结束后，用去离子水洗柱。洗至黄色消失后用1M盐酸洗柱，直到流出的液体pH约等于1为止。柱保持酸性静置12小时后，用去离子水将柱洗到中性。继续用1M的NaOH溶液洗柱至洗脱液pH约等于14为止。柱保持碱性静置12小时后，用去离子水将柱洗到中性。处理过的树脂才可以用于下一批吸附。
权利要求
1.落地生根黄酮化合物LEF，其特征在于，所述的黄酮化合物LEF是一种从草本植物落地生根叶中分离制备的，其分子式为C26H28O15，分子量为580；化学结构式如下
全文摘要
本发明涉及一种从落地生根叶中分离制备的黄酮衍生化合物LEF。本发明以落地生根叶子为主要原料，经粉碎、萃取，过滤，大孔树脂吸附，解吸，萃取，聚酰胺层析，得到纯度达51.23％(比色法以槲皮素计)的成品。再经HPLC制备目标化合物纯品，经过紫外，质谱，核磁共振实验得到谱图(如附录)，经过解析谱图，得到结论此化合物为槲皮素－(3→1)－α－L－鼠李糖－(2→1)－β－D－木糖，分子式为C
文档编号C07H17/00GK1680417SQ20051002365
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月27日 优先权日2005年1月27日
发明者徐殿胜, 曹宏, 夏杰, 陈国豪, 陆兵 申请人:华东理工大学