一种基于hplc的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用高效液相色谱法(HPLC)测定植物体中黄酮类化合物药物的 方法，尤其涉及一种基于HPLC的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 青钱柳是双子叶植物纲(0；[(3(^716(1011636)胡桃科(]1^1311(^〇636)青钱柳属植物， 是我国独有的单种属植物，也是国家重点保护的濒危植物之一。《中国中药资源志要》记载， 青钱柳叶具清热消渴解毒之功效。现代科学实验发现青钱柳叶含多糖、三萜、皂苷、黄酮等 多种重要药效成分，能增强人体免疫力，抗氧化，抗衰老，保肝脂肪肝，具有独特作用，尤其 对糖尿病人群有显著降血糖的功效。目前青钱柳主要以保健茶的形式在市场上销售，对于 其质量缺乏有效的控制方法。
【发明内容】
[0003] 发明目的：青钱柳中黄酮类化合物以槲皮素与山柰素为主，本发明的目的是提供 一种能有效控制产品质量的基于HPLC的青钱柳中黄酮类化合物的含量检测方法。
[0004] 技术方案:为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种基于HPLC的青 钱柳中黄酮类化合物的含量检测方法，该方法包括如下步骤：
[0005] (1)对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品和山柰素对照品适量，以80%甲醇 为溶剂制备成每lml分别含1 Oyg槲皮素和20yg山柰素的对照品混合溶液，；
[0006] (2)供试品溶液的制备:精密称定青钱柳粉末1.5g，置具塞锥形瓶中，精密加80 % 甲醇50ml，密塞，称定重量，置热水浴中加热回流lh，放冷，再称定重量，用80 %甲醇补足减 失的重量，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，精密加入盐酸5ml，摇匀，置热水浴中加热回流1 小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
[0007] (3)用高效液相色谱法测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷 酸溶液按照体积比60:40为流动相;检测波长为360nm;流速为1.0ml/min;理论板数按槲皮 素峰计算应不低于2500;测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相 色谱仪，测定。
[0008] 优选地，步骤(2)中，加热回流的水浴温度为85~95°C。
[0009] 优选地，在步骤(2)中迅速冷却是用流动水冲洗回流用容器外壁，并不断摇晃。
[0010] 有益效果:与现有技术相比，本发明通过对供试品进行特殊制备，然后用高效液相 色谱法采用合适的色谱条件对青钱柳叶中的黄酮类化合物槲皮素与山柰素进行含量测定， 能提高重现性，同时使检验结果更加可靠，从而能更好的控制产品质量。
【附图说明】
[0011] 图1为槲皮素标准曲线；
[0012] 图2为山柰素标准曲线；
[0013]图3为混合对照品图谱；
[0014]图4为供试品图谱。
【具体实施方式】
[0015] 下面通过实施例来进一步阐述本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。
[0016] 1、仪器与试药
[0017] 1.1仪器:高效液相色谱仪，电子天平，恒温水浴锅
[0018] 1.2试剂：甲醇、磷酸为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。
[0019] 1.3对照品：槲皮素，批号（100081-200907)，山柰素，批号（110861-200808)，由中 国药品生物制品检定所提供;精密称取槲皮素对照品和山柰素对照品适量，加80%甲醇制 成每lml含10yg和20yg的对照品混合溶液。
[0020] 1.4供试品:青钱柳药材，购自福建龙岩地区
[0021] 对于青钱柳的质量控制标准为:青钱柳中黄酮类化合物以槲皮素与山柰素的总量 计，每lg不得少于3.4mg。
[0022] 2、色谱条件
[0023]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4 %磷酸溶液(体积比60:40)为流动 相;检测波长为360nm;流速为1.0ml/min;理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500;
[0024] 3、供试品制备方法中提取溶剂的确定试验：
[0025] 取本品粉末1.5g，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，2份为一组，共3组，3个组分 别加入60 %甲醇、80 %甲醇、甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取1小时，放冷，再称定 重量，用同浓度甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密吸取续滤液25ml，加盐酸5ml，90°C水 浴回流1小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用同浓度甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 用上法测得各样品中槲皮素和山柰素平均总含量，结果见表1
[0026] 表1:不同溶剂提取的比较试验
[0027]
[0028] 以上结果表明，用80%甲醇提取的样品中黄酮类化合物的含量最高。故确定以 80%甲醇作为提取溶剂。
[0029] 4、盐酸加入量的确定试验
[0030] 取本品粉末1.5g，共8份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80 %甲醇50ml，密塞， 称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精 密量取续滤液25ml，2份为一组，共4组，4个组分别加25%盐酸3、5、7、10ml，90°C水浴回流1 小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用同浓度甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。用上法测 得各样品中槲皮素和山柰素平均总含量，结果见表2 [0031]表2:不同盐酸加入量水解提取比较试验
[0032]
[0033] 由上表可知，盐酸加入量增大，水解后山柰素和槲皮素总量增加(5ml前），加入5ml 时，指标成分提出率最高，再增加盐酸的量，指标成分的含量不再增加，故决定水解时加入 5ml盐酸。
[0034] 5、加入盐酸水解时间的确定
[0035] 取本品粉末约1.5g，共4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80 %甲醇50ml，密 塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤 过，精密量取续滤液25ml，精密加入盐酸5ml，摇匀，2份为一组，置90°C水浴中加热回流，2个 组分别水解0.5小时和1小时，取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度， 摇匀，即得。用上法测得各样品中槲皮素和山柰素平均总含量，结果见表3。
[0036]表3:盐酸水解时间的确定
[0037]
[0038] 由上表可知，酸水解0.5小时和1小时效果基本相当，1小时略高于0.5小时，故决定 水解1小时。
[0039] 6、稳定性试验
[0040] 取供试品溶液分别于1、2、4、6、8小时进样，测定，结果如表4:
[00411表4:稳定性试验结果 [0042]
[0043]以上结果表明，采用本发明的方法，稳定性好。
[0044] 7、取同一批次产品按本发明的方法中供试品溶液制备的方法制备供试品溶液，测 定槲皮素与山柰素和含量之和，结果如下：
[0045] 表5:重现性试验
[0046]
[0047] 以上结果表明，采用本发明的方法，重现性好。
[0048] 8、线性关系的考察
[0049] 精密吸取不同浓度的对照品溶液注入液相色谱仪，以进样量(yg)为横坐标(X)，以 峰面积值A(mAu.min)为纵坐标(Y)，进行线性回归绘制标准曲线，计算得回归方程，槲皮素 Y = 3737.2X-7.0156r = 0.9999;山柰素 Y = 3904.4X-0.2689r = 0.9998。结果表明槲皮素在 0.0258~0.645yg、山柰素在0.0632~1.58yg范围内呈良好的线性关系。
[0050] 9、结论
[0051] 综上所述，采用本发明，能够使青钱柳药材中槲皮素和山柰素的含量测定稳定性 和重现性好，从而能够更好的保证产品的质量。本发明的方法可以有效应用于青钱柳药材 中黄酮类化合物的测定。
【主权项】
1. 一种基于HPLC技术的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法，其特征在于该方法包 括如下步骤： (1) 对照品溶液的制备:精密称取槲皮素对照品和山柰素对照品适量，以80%甲醇为溶 剂制备成每lml分别含10yg槲皮素和20yg山柰素的对照品混合溶液，； (2) 供试品溶液的制备:精密称定青钱柳粉末1.5g，置具塞锥形瓶中，精密加80%甲醇 50ml，密塞，称定重量，置热水浴中加热回流lh，放冷，再称定重量，用80 %甲醇补足减失的 重量，摇匀，过滤，精密量取滤液25ml，精密加入盐酸5ml，摇匀，置热水浴中加热回流1小时， 取出，迅速冷却，转移至50ml量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得； (3) 用高效液相色谱法测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶 液按照体积比60:40为流动相;检测波长为360nm;流速为1.0ml/min;理论板数按槲皮素峰 计算应不低于2500;测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱 仪，测定。2. 根据权利要求1所述的基于HPLC的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法，其特征 在于，步骤(2)中，加热回流的水浴温度为85~95°C。3. 根据权利要求1所述的基于HPLC的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法，在步骤 (2)中迅速冷却是用流动水冲洗回流用容器外壁，并不断摇晃。
【专利摘要】本发明公开了一种基于HPLC的青钱柳中黄酮类化合物含量的检测方法，该方法包括对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；最后再用高效液相色谱测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(体积比60∶40)为流动相；检测波长为360nm；流速为1.0ml/min；理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得所述青钱柳中槲皮素与山柰素含量之和。本发明通过对供试品进行特殊制备，然后用高效液相色谱法对青钱柳叶中的黄酮类化合物槲皮素与山柰素进行含量测定，能提高重现性，同时使检验结果更加可靠，从而能更好的控制产品质量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105675755
【申请号】CN201610046707
【发明人】杨琴, 付廷明, 武俊明
【申请人】江苏中兴药业有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月22日