养的状态，从而大规模生产这些 益生菌。
[0081] Vibrio midae 的接种
[0082] 将单个冻存管的Vibrio midae接种于各接种瓶（I. 81，Fernbach)。各接种瓶中的 生长培养基由如下物质组成：lg/l柠檬酸、2. 5ml/l H3P04、3g/l(NH4)2S04、0.4g/l Ca(N03)2、 0.04g/l MnSO4 ·7Η20、0·0328/1 FeSO4 ·7Η20、Κ/1 KCl、30g/l NaCl、2.3g/l MgCl2 ·6Η20、 5g/l酪蛋白水解物、5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨（Biolab)和10g/l葡萄糖。用10v/v% 邮04或25v/v % NH4OH将生长培养基的pH调节至6. 5,然后在121 °C下灭菌15分钟。在接 种后，在定轨摇床（Innova 2300, New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中于 3CTC 和180rpm的速度下将接种瓶孵育4. 5h (OD660nni~2· 0)。Vibrio midae的发酵工艺
[0083] 使用单个接种瓶对各发酵罐进行接种。在工作体积为101的151 Biostat C?发 酵罐（Sartorius BBI系统，Melsungen，德国）中实施发酵工艺。
[0084] 发酵罐中使用的生长培养基含有如下培养基成分：lg/l朽1檬酸、2. 5ml/l H3POzp0. 4g/l Ca(NO3)2^0.0 40g/l MnSO4 · 7H20^0. 032g/l FeSO4 · 7H20^ lg/1 KCU30g/l NaCU 2. 3g/l MgCl2,6H20、54. 4g/l CSL 和 24g/l HTM。将生长培养基的盐、消泡剂（lml/1 Pluriol? P2000,BASF，Ludwigshafen，德国）和CSL加入至初始装载物中并使之达到9. 31。 将初始装载物灭菌后，加入单独灭菌的HTM溶液。发酵温度维持在30°C。将搅拌器速度设 定为500rpm并升高至lOOOrpm，以保持溶解氧高于30 %的饱和度。用ΙΟv/v% H2SO4S 25v/ v% NH4OH将pH维持在6· 5。将通气设定为lv/v/m。
[0085] Vibrio midae菌株的下游工艺
[0086] 使用Sharples-Stokes离心机（Pennwalt，法国）对发酵液进行离心。离心管 的速度为15700g，发酵液的进料速度为301/h。弃去上清液，并将生物质用磷酸盐缓冲液 (0· llm/m% ΚΗ2Ρ04、0· 71m/m% Κ2ΗΡ04、2· 91m/m% NaCl、96. 27m/m% H20,）进行配制。使用 顶置式搅拌器（桨式搅拌器）使液体产品均质化（1000 rpm)。
[0087] 对于挤出的干燥产品形式，将细菌（在磷酸盐缓冲液中配制）与MCC(液体产 品：MCC以质量计为1:1)和海藻糖（5m/m% )在食品混合器（KMX50, Kenwood，London， UK)中进行混合。将混合物通过筛网型挤出机（Nica E-140挤出机，Niro-Aeromatic， Southampton，UK)进行冷挤出，随后使用实验室规模的Aeromatic Fluidised Bed Dryer(Aeromatic AG，德国）将混合物对流干燥至~10m/m%。入口气流量设定为50m3/h 并处于环境温度下。
[0088] 对于鲍鱼饲料而言，将经离心的生物质重悬于人工海水（ASW)缓冲液中。将重悬 的缓冲液加入到鲍鱼饲料中，使用螺杆挤出机进行冷挤出，并在对流烘箱中（30°C)干燥 至~10m/m%的最终水分含量。在30-70°C温度下将所述重悬的生物质挤出。然而，优选在 45°C的温度下将生物质糊状物挤出。
[0089] 结果
[0090] 当在含有24g/l HTM和54. 4g/l CSL的培养基中对Vibrio midae培养6h后，获 得9. 7 X 101°个细胞/ml的最大细胞浓度和11. 1的光密度（图5)。
[0091] 在整个发酵中，将气流量和温度维持在lv/v/m和30°C。用lOv/v% H2SO4S 25v/ v% NH4OH将pH自动控制在6. 5。必要时，通过提高搅拌速度使？02维持高于30%。在本发 酵过程中，实现的最大氧气利用率（OUR)为160mMol/l/h (图6)。
[0092] 测量的关键响应是：生长速度，细胞浓度，细胞产率，以及相对于蛋白而言的细胞 产量（YPP)、相对于糖而言的细胞产量（YPS)和相对于氧气而言的细胞产量（YPO)(图7)。
[0093] 观察到的生长速度为1. Ο/h。通过将Vibrio midae在发酵培养基中进行培养，获 得9. 7 X 101°个细胞/ml的最大细胞浓度以及I. 6 X 10 13个细胞/ml/h的细胞产率。相对于 蛋白、糖和氧气而言，Vibrio midae细胞产量分别是1.8X1013个细胞/g、4. IXlO12个细胞 /g 和 2. OX 101°个细胞/g (图 7)。
[0094] 液体产品具有100天的半寿期（存储于4°C )。配制成初始计数为2 X IoiidCFUAiI 的终产品，储存寿命为669天（至计数为I X 10sCFU/ml的终产品）。
[0095] 挤出产品具有4. 86天的半寿期（存储于4°C )。配制成初始计数为2X IOwCFU/ ml的终产品，储存寿命为31. 5天（至计数为IX 10sCFU/ml的终产品）。
[0096] 鲍鱼饲料具有22. 4天的半寿期（存储于4°C )。配制成初始计数为2 X IOwCFU/ ml的终产品，储存寿命为156. 8天（至计数为IX 10sCFU/ml的终产品）。
[0097] 此前可利用的涉及Vibrio midae的生长、培养和维持的信息非常有限。只有一 篇给予了该生物体生长的信息的文献，该文献由分离该生物体的人提供（Macey和Coyne， 2006)。在其出版物中，他们教导了在22°C的温度下于pH为~7.0下在标准海洋肉汤（MB) 中对Vibrio midae进行培养。
[0098] 另一方面，本发明提供了细菌生长培养基，使Vibrio midae的产率提高27%，并 使生产成本大幅降低（109108% )。
[0099] 此外，Macey和Coyne，2006的教导建议最佳生长温度为22°C，然而发现，将温度升 高到30°C使得细胞产率增加1077倍。进而，当使用所述的细菌生长培养基时，通过将pH调 节至稍微更加酸性的6. 5,使得细胞产率进一步增加333%。
[0100] 通过在最佳pH和温度下使用CSL作为营养源，工艺的性能得到显著改善，并出乎 预料地使细胞浓度增加24%，细胞产率增加2750倍，并使生产成本降低1. 82 X 106%。
[0101] 此外，通过引入HTM作为碳源，该工艺使得细胞浓度增加181%，细胞产率增加 5705倍，并使生产成本降低3. 74X 106%。
[0102] 上述因素的组合使得开发出生产作为益生菌的Vibrio midae的新工艺，该工艺具 有显著提高的产率、浓度和产量，并使该生物体的生产成本大幅降低。
[0103] 相比于此前的生产工艺，利用本实施例的工艺、在本文所述的培养基中对Vibrio midae进行培养的累积效果使得产率提高3117倍。该增高的产出量可归因于新的生长培养 基以及最佳温度和pH的使用。通过将常用的氮源和碳水化合物源替换成CSL和HTM，该工 艺的产率进一步提高83%。在最终的工艺优化步骤中，观察到99%的成本降低。该研究提 供了关于Vibrio midae培养的大量新知识。
[0104] 实施例2
[0105] 作为鲍鱼益生菌的汉逊德巴利酵母的生产
[0106] 汉逊德巴利酵母的接种
[0107] 将单个冻存管的汉逊德巴利酵母（5.9X10sCFU/ml)接种于各接种瓶（1.81， Fernbach)中。各接种瓶中的生长培养基由如下物质组成：2. 5g/l朽1檬酸、16. 3ml/l H3POzp30g/l (NH4)2SO4'8. 2g/l MgSO4 · 7H2S04、0. 8g/l CaCl2 · 2Η20、0· lg/1 NaClUL 3g/l ΚΗ2Ρ04、 l〇g/l酵母提取物和l〇g/l葡萄糖。用l〇v/V% H2SO4S 25v/v% NH4OH将生长培养基的 pH调节至5. 6,然后在121°C下灭菌15分钟。在接种后，在定轨摇床（Innova 2300，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中于 24 °C 和 180rpm 的速度下将接种瓶孵育 22h (0D腳nm~4· 0) 〇
[0108] 汉逊德巴利酵母的发酵工艺
[0109] 使用单个接种瓶对各发酵罐进行接种。在工作体积为101的151 Biostat C?发 酵罐（Sartorius BBI系统，Melsungen，德国）中实施发酵工艺。
[0110] 发酵罐中使用的生长培养基含有如下培养基成分（g/1) :2. 5g/l柠檬酸、16. 3ml/ I H3P04、30g/l (NH4)2SO4'8. 2g/l MgSO4 · 7H2S04、0. 8g/l CaCl2 · 2Η20、0· lg/1 NaClUL 3g/l KH2P04、204g/l CSL以及10g/l葡萄糖或HTM。将生长培养基的盐、消泡剂（lml/l，Pluri〇l? P2000, BASF，Ludwigshafen，德国）和CSL加入至初始装载物中并使之达至9. 31。将初始 装载物灭菌后，加入单独灭菌的HTM溶液。发酵温度维持在24°C。将搅拌器速度设定为 500印111并升高至1000印111，以保持溶解氧高于30%的饱和度。用1(^八％氏304或25￥八％ NH4OH将pH维持在5. 6。将通气设定为Iv/v/m。
[0111] 汉逊德巴利酵母菌株的下游工艺
[0112] 使用Sharples-Stokes离心机（Pennwalt，法国）对发酵液进行离心。离心管 的速度为15700g，发酵液的进料速度为301/h。弃去上清液，并将生物质用磷酸盐缓冲液 (0· llm/m% ΚΗ2Ρ04、0· 71m/m% Κ2ΗΡ04、2· 91m/m% NaCl、96. 27m/m% H2O)进行配制。使用顶 置式搅拌器（桨式搅拌器）使液体产品均质化（1000 rpm)。
[0113] 对于挤出的干燥产品形式，将汉逊德巴利酵母（在液体磷酸盐缓冲液中配制） 与MCC(液体产品：MCC以质量计为1:1)和海藻糖（5m/m% )在食品混合器（KMX50， Kenwood，London，UK)中进行混合。将混合物通过筛网型挤出机（Nica E-140挤出机， Niro-Aeromatic，Southampton，UK)进行冷挤出，随后使用实验室规模的Aeromatic Fluidised Bed Dryer(Aeromatic AG，德国）将混合物对流干燥至~10m/m%。入口气流量 设定为50m3/h并处于环境温度下。
[0114] 对于鲍鱼饲料的配制而言，将离心的生物质重悬于人工海水（ASW)缓冲液中。将 重悬的缓冲液加入到鲍鱼饲料中，使用螺杆挤出机进行冷挤出，并在对流烘箱中（30°C)干 燥至~10m/m%的最终水分含量。在30-50°C的温度下将所述重悬的生物质挤出。然而，优 选在45°C的温度下将生物质糊状物挤出。
[0115] 结果
[0116] 当在含有25g/l HTM和24g/l CSL的培养基中对汉逊德巴利酵母培养22h后，获 得8. 4 X IO9个细胞/ml的最大细胞浓度和37. 9的光密度（图8)。
[0117] 在整个发酵中，将气流量和温度维持在lv/v/m和24°C。用lOv/v% H2SO4S 25v/ v% NH4OH将pH自动控制在5. 6。必要时，通过提高搅拌速度使？02维持高于30%。在本发 酵过程中，实现的最大氧气利用率（OUR)为200mMol/l/h (图9)。
[0118] 测量的关键响应是：生长速度，细胞浓度，细胞产率，以及相对于蛋白而言的细胞 产量（YPP)、相对于糖而言的细胞产量（YPS)和相对于氧气而言的细胞产量（YPO)(图10)。
[0119] 观察到的生长速度为0.3/h。通过将汉逊德巴利酵母在发酵培养基中进行培养，获 得8. 4 X IO9个细胞/ml的最大细胞浓度以及3. 8 X 10 11个细胞/ml/h的细胞产率。相对于 蛋白、糖和氧气而言，汉逊德巴利酵母细胞产量分别是3. 6X IO11个细胞/g、3.