专利名称：：球虫重组卡介苗及制备方法
技术领域：
：本发明提供了一种球虫重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗，同时还公开了其制备方法，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
：鸡球虫病是由艾美尔属的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一，遍及世界各地。长期以来本病防治主要依赖于药物，但由于鸡球虫的抗药性日趋严重，加之普遍存在的药物残留、研制开发新药成本高、周期长，免疫效果差，免疫程序复杂等问题，使人们将目光转向了分子疫苗。加强免疫效果以及对免疫增强剂的研究已成为当前球虫疫苗研究的热点。人们曾尝试过将球虫的抗原基因在不同的表达环境迸行表达，但目前仍没有一种抗原基因能够提供完全的免疫保护，而且受表达系统的限制，以大肠杆菌为原核表达系统的重组蛋白抗原性较差。因此，有必要采用基因工程方法发展一种高效，廉价的新型鸡球虫疫苗。卡介苗是目前世界上应用最广泛、最安全的疫苗。它本身是一种很好的非特异免疫增强剂，能增加机体免疫功能，单次接种即能诱导机体产生完全持久的细胞免疫和体液免疫，并且易于生产，价格低廉，适宜于广大农村。这些优势使卡介苗成为表达重组外源基因的一种非常理想的活菌疫苗载体。
发明内容本发明的目的是提供一种球虫重组卡介苗，包括两种抗柔嫩艾美耳球虫的新型疫苗，即穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。本发明的技术解决方案如下首先获得柔嫩艾美耳球虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到阳性柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。本发明所提供的两种重组卡介苗疫苗菌株，将其命名为rBCGPMV26卜RH0和rBCGPMV361-RHO.本发明以球虫保护性抗原Rhomboid基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建。1、穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备从构建的柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2cDNA表达文库中筛选出l个Rhomboid蛋白家族相关基因，根据己克隆的柔嫩艾美耳球虫Rhomboid新基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆。测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，转入DH5a中，将重组质粒Rho-261电穿孔转化卡介苗中，37。C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45。C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblotting鉴定。将制备好的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV261-RH0以100ug/只的剂量通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，并同时设BCG组和红、白对照组，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，对保护率、相对增重率、0PG、ACI、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO可对抗中等剂量球虫的攻击,试验组和对照组相比，攻虫后卵囊排出量显著减少，体重增长显著增加，盲肠病变较小,保护率达到78.8%以上。各项指标均明显优于对照组(结果见表l)。其中阴性对照组ACI值为90.6，而rBCGPMV261-RHO免疫组ACI值分别为208.1、181.4、167.2，说明使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，而滴鼻点眼和口服组ACI值均达到180以上，以这两种途径免疫抗球虫效果非常有效。BCG免疫的三组其ACI值在154.6171.0之间，效果也明显高于对照组，提示我们单独使用BCG对增强鸡球虫免疫保护力也有一定的效果，其中以口服方式免疫效果更好。穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫，表现为CD4+、CD8+T细胞数量和特异性抗体滴虔明显高于对照组(P〈0.01)。2、整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫Rhomboid新基因序列的开放阅读框设计引物设计引物并引入酶切位点，进行PCR，TA克隆，测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV361整合表达载体进行连接，转入DH5a中，将重组质粒Rho-361电穿孔转化卡介苗中，37t:培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45'C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblotting鉴定。将重组卡介苗rBCGPMV361-RH0以100ug/只的剂量通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，同时进行阴性对照实验，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，对保护率、相对增重率、OPG、ACI、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，其中rBCGPMV36卜RH0滴鼻点眼和口服免疫组ACI值达到188.2和187.8，具有很好的抗球虫效果。整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV361-RHO可对抗中等剂量球虫的攻击，试验组和对照组相比，攻虫后卵囊排出量显著减少，体重增长显著增加，盲肠病变较小，三种免疫途径保护率分别为80%、70.6%、63.5%(结果见表2)。以滴鼻点眼免疫方式效果更为明显。用整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫，CD4+、CD8+T细胞数量和特异性抗体滴度均较之阴性对熙组有不同程度的提高(P〈0.05)。将本发明提供的两种球虫重组卡介苗通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡后，口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，通过保护率、相对增重率、OPG、ACI、体液免疫水平和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。结果显示，球虫重组卡介苗rBCGPMV261-RHO和rBCGPMV361-RHO组均具有明显的免疫促进作用，各指标均强于阴性对照组，能够有效地抵抗柔嫩艾美耳球虫卵囊的攻击，ACI值到达180以上，具有很好的抗球虫效果。本发明的积极效果在于卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫佐剂作用，而且又能高效表达球虫蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防鸡球虫病的目的。并且这一新型疫苗热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验.免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。本发明所用到的Rhomboid基因是我实验室获得的一个柔嫩艾美耳球虫的新基因。Rhomboid蛋白是近年来发现的参与表皮生长因子及表皮生长因子受体信号转导过程的调节器，而且已发现Rhomboid与顶器门原虫的黏附和侵入宿主细胞有关，说明Rhomboid基因作为疫苗候选基因的价值。这样的活载体疫苗既能发挥卡介苗本身较强的细胞免疫佐剂作用，又能使表达的蛋白发挥免疫保护作用，达到更好的预防鸡球虫病的目的。因此这两种疫苗的研制具有非常广阔的前景和应用价值。图l为PMV261-Rho载体构建示意图。图2为PMV361-Rho载体构建示意图。具体实施方式本发明以球虫保护性抗原Rhomboid基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建，并不以任何形式限制本发明。本发明球虫重组卡介苗疫苗的制备实施例l穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备步骤.参照Rhomboid基因DNA序列及穿梭载体pMV261物理图谱设计两对引物并引入酶切位点。上游引物QF1:5、-CTGACTGCAGATGTCGGACATCGAATCCCAGAG-3、；其中5、端含有Pstl位点；下游引物QR:5、-GACTATCGATTTATGCGCATCCCATGGGCAAAGG-3';5、端含有Clal位点。将PCR纯化产物克隆至PMD18-T载体并进行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片段与同样进行酶切的穿梭表达载体pMV261连接，连接产物转化AcoWDH5a感受态细胞后筛选重组质粒，用PstI、ClaI进行双酶切反应，重组质粒命名为PMV261-Rho(如图l所示)。将BCG接种于MB7H9ADC液体培养基中，37t:培养至对数生长期，离心收集菌体，沉淀用10%甘油洗涤，最后重悬lml10%甘油中，用于电转化。取60-80ulBCG感受态菌液加入O.lug重组质粒PMV261-Rho置于电转杯中。电穿参数电压2.5KV，电容25uF，电阻1000Q。电穿孔转化后立即加入MB7H9ADC培养基中，37。C培养2d后涂布于含20ug/mlKanMB7H9ADC培养基平板，约3w后长出转化菌落。从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基(含Kan)，37°C培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45'C水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2XSDS-PAGE上样缓冲液，10(TC5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Westernblotting鉴定。实施例2整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备步骤参照Rhomboid基因DNA序列及穿梭载体pMV361物理图谱设计两对引物并引入酶切位点。上游引物QF2:CTGACAGCTGATGTCGGACATCGMTCCCAGAG;其中5、端含有PvuII位点；下游引物QR:5、-GACTATCGATTTATGCGCATCCCATGGGCAAAGG-3';5'端含有Clal位点。将PCR纯化产物克隆至PMD18-T载体并迸行PCR、酶切及测序鉴定，凝胶回收片断与整合表达载体pMV361连接，连接产物转化￡h'DH5a感受态细胞后筛选重组质粒，用和PvuII、ClaI进行双酶切反应，重组质粒命名为PMV361-Rho(如图2所示)。取60-80ul感受态BCG菌液加入O.lug重组质粒PMV361-Rho置于电转杯中。电穿参数电压2.5KV，电容25uF，电阻1000Q。电穿孔转化后立即加入MB7H9ADC培养基中，37r培养2d后涂布于MB7H9ADC培养基平板。从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基，37。C培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后45"水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2XSDS-PAGE上样缓冲液，100。C5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Westernblotting鉴定。试验例l穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的用途实验动物采用刚出壳的海兰小公雏，雏鸡6日龄时，随机分为8组，每组20只。7日龄时将穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV261-RH0以100ug/只的剂量通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，并同时设BCG滴鼻点眼免疫组、BCG口服免疫组，BCG颈部皮下注射免疫组和红白对照组。红白对照组接种PBS，红对照组最后攻虫，白对照组不攻虫。分三次免疫，每次间隔一周，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊lX104个/只进行攻虫试验，进行以下各项指标判定，包括保护率、相对增重率、0PG、ACI等，免疫后采血，流式细胞仪对CD4+、CD8+进行细胞水平免疫检测，分离血清ELISA方法对体液免疫水平进行检测。攻虫前每组鸡随机取10只逐只分别称重并标号记录，攻虫后每隔一天对对应的鸡逐只称重，观察攻虫后鸡的体重变化情况，以及最后的增重情况，计算相对增重；攻虫后每天检査粪便，并从第五天开始分别收集各组粪便，混匀后，每组各取lg，加入10tnL自来水制成10倍稀释液，取一滴置于血细胞计数板中，在低倍镜下记数球虫卵囊总数；于攻虫后第七天，每组取5只鸡剖杀，观察盲肠病变，按Johnson设计的病变记分法记分。计算ACI二相对增重率+存活率-病变值-卵囊记分。结果显示各项指标均明显优于不免疫攻虫对照组。说明我们所采用的免疫程序是安全有效的，阴性对照组的ACI仅为90.6，而单独使用BCG能不同的提高抗球虫指数，其中BCG口服组ACI达到了171.0，发挥了BCG作为免疫增强剂的效果，效果尤为突出的是本发明所提供的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO，免疫方式采用滴鼻点眼和口服，抗球虫指数ACI值均达到180以上，说明抗球虫效果非常有效。穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO可对抗中等剂量球虫的攻击，试验组和对照组相比，攻虫后卵囊排出量显著减少，体重增长显著增加，盲肠病变较小，保护率达到78.8%以上(结果见表l)。将发明的新型疫苗rBCGPMV261-RHO免疫雏鸡后，于第三次免疫后l周，每组随机各取10只鸡放血处死，取脾脏，力B2mLPBS，在200目筛上研磨，用PBS稀释成细胞悬液(10MVmL)。取100uL细胞悬液，加？1^标记的抗004+和？￡标记的抗008+兔抗鸡单克隆抗体，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入O.5mL荧光保存液，用流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。结果表明免疫组及8〔6组004+、CD8+变量明显高于阴性对照组，而^〔0匿261-朋0滴鼻组鸡的004+、CD8+T淋巴细胞数均升高，与其他个组相比差异均极显著(P〈0.01)。每次免疫前心脏采血，分离血清，用柔嫩艾美耳球虫F2株子孢子蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法对鸡血清中IgG变化情况进行检测。结果一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价，其中，rBCGPMV261-RHO滴鼻组和rBCGPMV261-RHO口服组血清抗体吸光度最高，于其它组相比差异极显著(P〈0.01)。试验例2整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的用途实验动物采用刚出壳的海兰小公雏，雏鸡6日龄时，随机分为8组，每组20只。7日龄时将整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGP匿361-RH0以100ug/只的剂量通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，并同时设BCG滴鼻点眼免疫组、BCG口服免疫组，BCG颈部皮下注射免疫组和红白对照组。红白对照组接种PBS，红对照组最后攻虫，白对照组不攻虫。分三次免疫，每次间隔一周，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊1X10MV只进行攻虫试验，进行以下各项指标判定，包括保护率、相对增重率、OPG、ACI等，免疫后采血，流式细胞仪对CD4+、CD8+进行细胞水平免疫检测，分离血清ELISA方法对体液免疫水平进行检测。攻虫前每组鸡随机取10只逐只分别称重并标号记录，攻虫后每隔一天对对应的鸡逐只称重，观察攻虫后鸡的体重变化情况，以及最后的增重情况，计算相对增重；攻虫后每天检查粪便，并从第五天开始分别收集各组粪便，混匀后，每组各取lg，加入10mL自来水制成10倍稀释液，取一滴置于血细胞计数板中，在低倍镜下记数球虫卵囊总数；于攻虫后第七天，每组取5只鸡剖杀，观察盲肠病变，按Johnson设计的病变记分法记分。计算AO相对增重率+存活率-病变值-卵囊记分。使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，其中rBCGPMV361-RH0滴鼻点眼和口服免疫组ACI值达到188.2和187.8，具有很好的抗球虫效果。整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCGPMV361-RHO可对抗中等剂量球虫的攻击，试验组和对照组相比，攻虫后卵囊排出量显著减少，体重增长显著增加，盲肠病变较小，三种免疫途径保护率分别为80%、70.6%、63.5%(结果见表2)。以滴鼻点眼免疫方式效果更为明显。将发明的新型疫苗rBCGPMV36卜RH0免疫雏鸡后，于第三次免疫后l周，每组随机各取10只鸡放血处死，取脾脏，用PBS稀释成细胞悬液，取100uL细胞悬液，加？11^标记的抗004+和？￡标记的抗008+兔抗鸡单克隆抗体，用流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。结果表明免疫组及8〔0组[04+、CD8+变量明显高于阴性对照组。每次免疫前心脏采血，分离血清，用柔嫩艾美耳球虫F2株子孢子蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法对鸡血清中IgG变化情况进行检测。结果一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价。表l穿梭载体重组卡介苗rBCGPMV261-RHO对E.tenella攻击的保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2整合载体重组卡介苗rBCGPMV361-RHO对E.tenella攻击的保护效果OPG值Xl(f个增重(g)盲肠病变记分ACI分组平均值保护率平均值相对增重平均值相对病变ACI<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种球虫重组卡介苗，其特征在于首先获得球虫保护性抗原基因，进行TA克隆，测序鉴定正确后酶切回收目的片段，再分别与同样进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261或整合表达载体PMV361相连，重组质粒转化到BCG，经抗性和PCR筛选得到阳性球虫重组卡介苗。2、一种穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗，是通过以下步骤制备的从构建球虫杂交虫株F2cDNA表达文库中筛选出1个Rhomboid蛋白家族相关基因，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫Rhomboid新基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，转入DH5ct中，将重组质粒Rho-261电穿孔转化卡介苗中，37'C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45'C热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblotting鉴定。3、一种整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗，是通过以下步骤制备的根据己克隆的球虫Rhomboid新基因序列的开放阅读框设计引物设计引物并引入酶切位点，进行PCR，TA克隆，测序鉴定正确后进行双酶切，切胶回收，与进行同样酶切的pMV361整合表达载体进行连接，转入DH5a中，将重组质粒Rho-361电穿孔转化卡介苗中，37。C培养至对数生长期后，筛选BCG重组子，PCR证实为阳性克隆后进行45"热诱导表达，对基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblotting鉴定。全文摘要本发明提供一种球虫重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫佐剂作用，能高效表达球虫蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防鸡球虫病的目的。疫苗具有非常好的抗球虫效果，热稳定性好，运输和保存较为容易；免疫力持久，单次接种可持续诱导长期对“靶抗原”的免疫反应，可减少接种次数，简化免疫程序，增强对球虫病的免疫效果；基因操作和生产过程较为简单，安全性高，球虫抗原可在BCG细胞壁上持续稳定表达；产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序，大大降低了成本，便于推广。文档编号A61K39/002GK101234196SQ200710056370公开日2008年8月6日申请日期2007年11月30日优先权日2007年11月30日发明者宫鹏涛,张西臣,李建华,举杨,王秋悦申请人:吉林大学