蛋白酶抑制剂的肾细胞保护功能及应用的制作方法

专利名称：：蛋白酶抑制剂的肾细胞保护功能及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKD/APP)，特别是涉及rhKD/APP的肾细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗肾的再灌注损伤性疾病的药物中的应用。
背景技术：
：BPTI作为碱性丝蛋白酶抑制剂，具用广谱的蛋白酶抑制活性。在临床上主要用于减少手术后的大出血和炎症反应。但BPTI是一种异源蛋白，具有一定的免疫原性，大量或长期反复使用会产生过敏反应。所以需要寻找一个人源的、分子量较小且具有强抑制活性的BPTI。研究发现，(3淀粉样蛋白前体(APP)包含一段Kunitz型结构域(Kunitzdomain,KD),APP含有57个氨基酸残基，与Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI)有同源性。X-Ray衍射分析，氨基酸序列与Kunitz型蛋白酶抑制剂家族的BPTI有43%同源性。除了第39~41位点的氨基酸残基不同，其主链骨架的氨基酸与BPTI几乎相同。作为一种由61个氨基酸组成的多肽，KD/APP分子量相对较小且结构稳定。KD/APP对丝氨酸蛋白酶家族有广泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、弹性蛋白酶和凝血因子VIIaIXaXaXIaXIIa等(例如参见美国专利6，613，890)。作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和活性药物成分，KD/APP的基本作用在于将病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，缓解与丝氨酸蛋白酶活性升高有关的临床症状，在临床广泛用于手术后的止血及术后并发的炎症反应。由于KD/APP对因子XIa、XIIa抑制作用可以直接抑制外源性的凝血系统。KD/APP的变异体可以抑制多种丝氨酸蛋白酶，通过活性中心及活性中性附近氨基酸的改变可以抑制广谱的蛋白酶如因子VII、X、弹性蛋白酶，3组织蛋白酶G、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、肠激酶等。可用于预防和治疗某些与丝氨酸蛋白酶升高相关的疾病。然而，迄今为止尚未见有关重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKD/APP)对肾脏急性再灌注损伤的保护及其在治疗肾脏再灌注损伤相关疾病中的应用的报道。
发明内容本发明的一个目的是提供KD/APP在生产用于预防和治疗肾再灌注损伤性疾病的药物中的应用。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的KD/APP是以DNA重组技术制备的。根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的KD/APP是人源的。根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的肾脏损伤性疾病选自肾再灌注损伤性疾病和肾再灌注性损伤。本发明的另一个目的是提供一种由KD/APP或其类似物以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，及其在生产用于保护肾细胞、预防和治疗肾再灌注损伤性疾病的药物中的应用。本发明涉及Kunitz型蛋白酶抑制剂(KD/APP)，特别是涉及KD/APP的肾保护功能，及其在生产用于预防和治疗病理性肾损伤相关疾病的药物中的应用。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的KD/APP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。所谓缺血再灌注(I/R)损伤是指机体器官缺血一定时间后再恢复血液灌注，组织损伤反而进行性加重。这种损伤不具有器官特异性，即任何组织器官均可能在缺血后发生再灌注损伤。早期I/R损伤是一个可逆性的损伤，随着时间的推进和损伤的加重，组织细胞发生不可逆的损伤，即细胞的坏死和凋亡。近年来，随着溶栓治疗的开展，血循环重建后再灌注性肾损伤的相关研究己取得了较大进展，当前研究从细胞、分子水平比较深入地阐明了肾缺血再灌注损伤机制。蛋白酶和它们的抑制剂普遍存在于自然界动、植物及微生物中，并且在许多重要的生理体系中起关键性的调控作用。目前已发现的蛋白酶抑制剂很多，其中以Kunitz属的牛胰蛋白酶抑制剂一BPTI研究得最广泛和深入，并已经成功应用于临床治疗急性胰腺炎、手术后器官功能衰竭以及再灌注损伤、早产、肺气肿、肾水肿、肿瘤的浸润和转移等疾病。就rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤的保护而言，目前研究很少。BPTI抑制肾脏激肽释放酶和缓激肽活性，自激肽产生的前列腺素样物质减少。由于激肽释放酶和PGE2、PGI2具有舒张肾脏血管，促进钠排泄的作用，它们的减少可能造成肾血管收縮，加重肾脏的缺血损伤。因此有人推测静脉应用BPTI可能损害肾功能。但最近大多数研究观察到，BPTI治疗，即使是大剂量，也不会影响肾血流动力学和功能。有报导发现心脏手术中应用BPTI可增加围术期尿量，原因与BPTI排泄时增加肾小管内的渗透性和增加钠排出有关。感染性休克或肝硬化患者应用大剂量BPTI可预防血压和体循环阻力下降，维持血浆肌酐清除率和尿钠排泄分数。我们的研究显示，rhKD/APP对大鼠的肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，最主要体现在rhKD/APP可以降低肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)、尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的水平，血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)是临床上评价肾功能的常用指标，尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)是反应肾损伤较为灵敏的指标。检测结果表明rhKD/APP在一定程度上有减轻肾脏缺血再灌注损伤、保护肾功能的作用。根据本发明的优选实施方案，其中所说的病理性肾损伤选自急性或慢性肾病和肾动脉硬化。我们的实验从形态学上也证实了rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用，光镜和透射电镜下可见rhKD/APP组动物的肾脏组织结构的破坏明显轻于对照组。这些结果明确显示，rhKD/APP对大鼠的肾缺血再灌注损伤有良好的保护作用。小、中、大三个剂量的rhKD/APP在干预大鼠肾缺血再灌注损伤时，显示出剂量和药效相关性，这说明在我们选定的这个药物浓度范围内，rhKD/APP均可以发挥治疗作用。可以利用常规的DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKD/APP)。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhKD/APP可以是由原核、真核或酵母表达系统产生的。然而，为了本发明目的，优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统。以下简单地描述使用优化的发酵培养条件，在80L发酵罐中工业化大规模生产rhKD/APP的方法。(1)酵母表达载体的构建以人胎盘组织来源的基因组DNA为模板，使用合成的引物l:5'-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3'(SEQIDNO:l)和引物2:5'-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3'(SEQIDNO:2)，经聚合酶链反应(PCR)扩增得到长度约200bp的产物。酶切后与用同种酶消化的pPICZa载体连接，得到重组质粒pPICZa/pre^w'。然后，分别合成一段寡核苷酸单链5'-TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3'(SEQIDNO:3)和5'-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3'(SEQIDNO:4)(其中包括编码KPI氨基端四个氨基酸和a因子信号肽切割位点Lys-Arg的密码子)。用Pstl和Xhol消化重组质粒pPICZa/preAp/并与退火后的寡核苷酸双链连接，得到重组质粒pPICZa/Ap厶酶切分析和测序鉴定表明，pPICZa/A^'，重组质粒携带了预期的a因子信号肽和hKD/APP基因序列。(2)重组质粒的转化、阳性克隆的筛选和表达采用电转化法将pPICZa/^w'转化到酵母菌株X-33中。在YPDzeocin阳性培养基中28。C培养36小时后，挑取单克隆菌落接种于BMGY培养基中，待细菌处于对数生长期(0D6。。=26)时，重悬于B醒Y培养基中继续培养。每隔24小时补加甲醇至终浓度为0.5%，以诱导rhKD/APP的表达。诱导后，每隔24小时取上清，用胰蛋白酶和底物盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺进行活性测定，筛选相对高表达量的菌株。(3)大规模发酵工艺将高密度的(0D6。。=10)酵母工程菌接种于含甘油(5%，V/V)加痕量盐(4.34mlPTMl/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培养基中，在温度28°C、pH3.3、溶解氧浓度20%、搅拌速度600转/分钟,罐内压力12psi条件下,在发酵罐罐内发酵培养30小时。当湿细胞重量达180220g/L时，以渐增的速度添加含1.2%PTM1的100%甲醇，诱导rhKD/APP的表达，其甲醇补加速率为3.6ml/h/L—7.3ml/h/L—10.9ral/h/L，直至发酵结束。(4)表达产物的纯化:70L发酵液离心取上清，用Na0H(lmol/L)调pH4.0，添加NaAc-HAc缓冲液(终浓度为20誦ol/L)和去离子水稀释后，通过预先用缓冲液A(20mmol/LNaAc-HAc，pH4.0)平衡过的S印haroseSP阳离子交换柱。然后连续加样，检测穿透液的活性，待树脂饱和后用3倍于柱体积的缓冲液A洗柱。用缓冲液B(20國ol/LNaAc-HAc加1mol/LNaCl,PH4.0)洗脱。洗脱液用3000(3K)中空纤维柱除盐和浓縮。(5)表达产物的活性测定以胰蛋白酶活性抑制方法测定表达产物的活性。将如上纯化的rhKD/APP稀释成不同浓度并与同浓度的胰蛋白酶反应，加入底物(盐酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺)后测定残余的胰蛋白酶量。结果可见，如上得到的rhKD/APP对胰蛋白酶有明显的抑制作用。为了深入研究rhKD/APP对大鼠肾细胞缺血再灌注的保护作用，在本研究中，我们观察了rhKD/APP对大鼠急性肾梗塞后再灌注动物模型的血清生化指标(血清尿素氮、肌酐和尿NAG的水平和活力)的影响，同时对各实验组动物的肾组织进行了病理学观察(光镜和电镜观察)和统计学分析。在急性肾缺血再灌注动物模型的实验中发现，与对照组相比，接受rhKD/APP治疗的实验组动物，rhKD/APP低、中、高剂量组与模型组比较，肾功能损伤均可见显著改善(P0.01)，且随着剂量的增加改善明显。基于这些实验结果，我们初步认定重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKD/APP)有可能作为一种新的肾细胞保护剂，用于预防和治疗急性肾缺血后肾细胞损伤。因此，本发明的一个目的是提供Kunitz型蛋白酶抑制剂在生产用于预防和治疗肾缺血后再灌注损伤的药物中的应用。根据本发明的优选实施方案，其中所说的肾缺血后再灌注损伤性疾病选自急性或慢性肾缺血、肾出血、肾动脉硬化和再灌注损伤。根据本发明的优选实施方案，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是人源化的，并且是以DNA重组技术制备的。本发明的另一个目的是提供一种具有肾细胞保护活性的基础上由rhKD/APP及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。用于本发明的AKD/APP可以是具有天然野生序列的生物学活性多肽，但也可以是为改善产物的生物学活性，或为提高产物的产率或药物动力学性质目的而在基因水平上进行了必要的修饰的rhKD/APP类似物或突变体。这里所说的修饰可以是内部或末端个别或部分氨基酸的加入、缺失或取代。本发明涉及的rhKD/APP可以单独使用，也可以作为有各种不同剂型的药物组合物的形式使用。可以使用制药工业领域己知的方法(参见Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPub.Co.,Easton,Pa.,1980)，以适于口服或非口服给药的单位计量形式制备本发明的药物组合物。例如，可将作为活性成分的有效量的rhKD/APP与医药上可接受的载体或赋形剂均匀地混合，制成溶液或悬浮液形式的适于静脉内、肌肉内、器官腔内、皮内和皮下等胃肠道外途径给药的药物组合物；或者也可以制成片剂、胶囊剂、粉末剂、乳剂、颗粒剂等形式的适于经胃肠道途径给药的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其中所使用的医药上可接受的载体或赋形剂将依据所制备的本发明药物组合物的剂型而有不同的选择。适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油和氢化萘等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，以控制活性成分的缓慢释放。在其他适于胃肠道外给药的制剂中，还包括含有水杨酸的直肠给药制剂和含有甘胆酸盐的含服给药制剂。具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、甜味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂。可以使用乳糖和甘露醇等赋形剂，淀粉等崩解剂，明胶等黏结剂，以常规方法制备颗粒剂。或者，可以使用乳糖和蔗糖等赋形剂，以常规方法制备粉末剂。使用明胶、水、蔗糖、阿拉伯胶、山梨醇、甘油、结晶纤维素、硬脂酸镁和滑石等，以常规方法制备胶囊剂。可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，苯甲酸钠，水杨酸钠和氨基甲酸乙酯等增溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，青霉素和链霉素及其他抗真菌剂等抗生素，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备注射剂。在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并且能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分rhKD/APP或其类似物或突变体外，还可含有一种或多种合成的、天然的或重组来源的具有协同或辅助作用的其他活性成分。这些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或调节活性、病毒复制抑制活性、细胞修复活性的其他成分，例如可以是干扰素、白介素、胸腺素、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子等。本发明的药物组合物对功能性肾细胞具有良好的保护作用。虽然有关作用机理目前尚不明确，但我们推测可能与rhKD/APP或其类似物作用于肾脏细胞并抑制细胞内的丝氨酸蛋白酶类有关。基于以上的描述，本领域技术人员完全可以理解到，rhKD/APP除具有其固有的蛋白酶抑制活性并因此可用于治疗丝氨酸活性升高相关疾病外，也可以用于预防和治疗病理性肾脏细胞损伤及相关疾病。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhKD/APP或其类似物通过抑制肾脏细胞的丝氨酸蛋白酶提高肾脏细胞的存活性。一般说来，本发明药物组合物的给药剂量约为0.01-500mg/kg，较好为0.1-100mg/kg。可以以口服、皮下或肌肉注射、腹腔注射、静脉内注射等多种途径给药。当然，本领域技术人员可以理解到，为有效地治疗病人所需的确切的给药剂量，应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重和一般健康状态，所用药物的剂型、病人对所用药物的敏感性和耐受性，以及所使用给药途径等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。图1显示模型组肾组织HE染色，200倍光镜下观察结果，可见模型组肾小管上皮细胞变性坏死较严重，尤其以近曲小管上皮细胞为重，可见细胞明显肿胀，胞浆疏松；上皮细胞内可见明显的玻璃样变性和空泡变性，并有大量蛋白管型形成；肾间质充血及出血明显，伴有炎细胞浸润。图2显示40000KIU'kg—rhKD/APP组肾组织HE染色，200倍光镜下观察结果，可见肾小管上皮细胞损伤较模型组明显减轻，仅小部分细胞出现轻微肿胀，脱落及空泡变性，坏死细胞较少，肾小管形状保持良好。图3显示模型组肾组织6k透射电镜观察结果，可见肾小管上皮细胞膜局部破损，细胞质空化，细胞器(线粒体等)明显减少,细胞核内异染色质趋边，可见大量大小不等溶酶体颗粒。图4显示模型组肾组织10k透射电镜观察结果，可见肾小管上皮细胞核发生固縮，可见较多髓样小体，某些线粒体局部发生空化。图5显示40000KIU'kg"rhKD/APP组肾组织5k透射电镜观察结果，可见肾小管上皮细胞结构基本正常，可见部分溶酶体。图6显示40000KIl>kg"rhKD/APP组肾组织5k透射电镜观察结果，可见肾小球滤过膜与足细胞基本正常，足细胞内可见部分线粒体空化。图7显示模型组肾组织NF-KB免疫组化染色，200倍光镜下观察结果，可见较多阳性细胞。图8显示40000KIU'kg"rhKD/APP组肾组织NF-KB免疫组化染色，200倍光镜下观察结果，可见阳性细胞明显少于模型组。图9显示模型组肾组织TUNEL免疫组化染色，200倍光镜下观察结果，可见较多TUNEL阳性细胞。图10显示40000KIU'kg"rhKD/APP组肾组织TUNEL免疫组化染色，200倍光镜下观察结果，可见TUNEL阳性细胞明显少于模型组。具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。实施例hrhKD/APP对大鼠肾脏急性缺血再灌注损伤的保护和治疗作用1、肾缺血再灌注损伤动物(大鼠)模型的制备、分组和给药平均体重250g-300g的雄性Wistar大鼠(吉林大学实验动物部提供)禁食12小时后，腹腔内注射3%水合氯醛麻醉(0.2ml/50g)。将麻醉后的大鼠仰卧位固定后，打开动物腹腔并暴露双肾、动静脉和输尿管。用无损伤血管夹阻断双侧肾蒂，同时开始记时。阻断双侧肾蒂45分钟后，恢复肾脏供血，观察到肾脏在短时内由暗红色逐渐转变为鲜红色(提示肾脏恢复血供)。造成模型24小时后，分别将各组10只动物放入代谢笼中留取24小时尿液，以测定尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性。24小时后，再次用3%水合氯醛麻醉，切除肾脏，切除的部分肾脏在多聚甲醛液中固定备用；另取一部分肾脏放入戊二醛溶液中固定，置4'C冰箱备用。从腹腔腹主动脉处用无菌5ml注射器抽取3-4ml血进行肾功能测定。取Wistar大鼠60只，随机分为6组，每组10只第1组为伪手术组；第2组为肾I/R损伤模型组(模型组)行大鼠双侧肾动静脉夹闭，暂时阻断手术，制备肾脏缺血再灌注损伤模型；第3组为rhKD/APP低剂量组肾I/R+尾静脉注射rhKD/APP10000KIU'kg";第4组为rhKD/APP中剂量组肾I/R+尾静脉注射rhKD/APP20000KIU'kg-1;第5组为rhKD/APP高剂量组肾I/R+尾静脉注射rhKD/APP40000KIU'kg";第6组为依那普利组(对照组)肾I/R+尾静脉注射对照药物依那普利0.134mg'kg—1。第1~2组动物于造成模型前24小时、模型建立后即刻和模型建立后24小时尾静脉注射生理盐水；第35组大鼠于上述各时间点经尾静脉注射各个剂量的rhKD/APP;第6组大鼠于上述各时间点经尾静脉注射对照药物依那普利。术中维持大鼠肛温在37'C左右，用台灯加热保温。入选的动物在取肾后如双肾颜色未发生变化或于恢复肾动脉供血恢复后肾脏颜色未能由暗红色转变为鲜红色则弃之不用。补充死亡例数、未入选例数、模型未成功例数，每组最终统计入组数经补充后『10。所有的实验数据，包括计量资料和计数资料均值土标准差表示，各组所得的数据均采用单因素方差分析和DunnetT检验进行比较。2、观察指标(1)肾功能检测血清肌酐(SCR)，血清尿素氮(BUN):从腹主动脉处用无菌5m胜射器抽取3-4ml血液，去掉针头，注入无菌非抗凝试管，静置待血清析出后，以3000r/min，离心10min，取上清液以美国BACKMAN—SYNCHRONCX3型全自动生化分析仪测定血清肌酐(SCR)，血清尿素氮(BUN)(由吉林大学第一医院二部检验科生化室协助完成)。肌酐采用Jaffer速率测定法测定，当样品及标准液中的肌酐与碱性苦味酸试剂混和后，生成红色复合物，在波长520nm及560nm处测定吸光度，复合物形成的速率与样品中的肌酐浓度成正比。尿素氮通过BACKMAN—SYNCHRON—CX3型全自动生化分析系统通过操作BACKMAN导电电极测定酶的导电率增长速率，它与样品中尿素氮的浓度成正比。(2)尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性的测定根据南京建成生物工程研究所提供的NAG测试盒说明书进行尿中NAG活性的测定和计算.原理底物在NAG作用下水解，释放出游离的对硝基酚。加入碱性溶液停止反应，并使对硝基酚显色。在400nrn处测吸光度，可计算酶活力单位。计算公式如下酶活力单位(U/L)=(测定管吸光度-对照管吸光度)+(标准管吸光度-空白管吸光度)x标准品浓度(0.6mmol/L)xi/i5><1000(3)肾脏组织病理切片光镜观察①将按规定取好的肾组织标本以多聚甲醛固定。②脱水酒精梯度(75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精)各级酒精，脱水时间2-4h。③透明二甲苯15min。共2次。④浸蜡将透明后组织块浸入融化的石蜡中2-4h。⑤包埋修整蜡块使切面平整。⑥切片切成厚约4-5Nm切片。⑦染色脱蜡至水，苏木素5min，伊红lmin。⑧脱水、透明、封片观察。(4)肾脏组织病理切片电镜观察①初固定(或前固定)将肾组织标本用2.5%戊二醛固定。②漂洗用磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.4，含2.5mmol/L氯化钙)(C洗1小时(其间更换3次以上漂洗液)。(D二次固定(或后固定)1%四氧化锇室温或4"固定1小时。脱水50%丙酮(或乙醇)水溶液，4'C，10-15分钟；70%丙酮(或乙醇)水溶液，4°C，10-15分钟；95%丙酮(或乙醇)水溶液，4"C，10-15分钟；100%丙酮(或乙醇)，4°C，10-15分钟；100%丙酮(或乙醇)，室温，10-15分钟；100%丙酮(或乙醇)，室温，10-15分钟。⑤Epon812环氧树脂包埋标本。⑥制备超薄切片。⑦染色醋酸铀和拧檬酸铅双染色法染色。⑧电子显微镜观察，摄片。3、实验结果(1)rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清尿素氮和肌酐的影响各实验组在肾缺血45min，再灌注48h后，与伪手术组相比较，模型组BUN和SCR，显著升高(P〈0.001);与模型组比较，大剂量组血清的BUN和SCR显著降低(p〈0.0D，中剂量组BUN和SCR明显降低(P〈0.05);小剂量组BUN和Cr较模型组降低，但无显著性差异(p〉0.05);中剂量组与大剂量组对肾脏急性缺血再灌注后大鼠血清BUN和SCR的影响与依那普利组相近，结果见表1。表1rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清尿素氮和肌酐的影响(3f±s，n=l0)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与模型组比较*p〈0.05，**p〈0.01(2)rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠尿NAG的影响各实验组在肾缺血45min，再灌注48h后，与伪手术组相比较，模型组尿NAG明显升高(P<0.01);与模型组比较，中剂量及大剂量组尿NAG明显降低(p<0.01)，小剂量组尿NAG较模型组降低，但无显著性差异(p〉0.05);中剂量组与大剂量组对肾脏急性缺血再灌注后大鼠尿NAG的影响与依那普利组相近。结果见表2。表2rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠尿NAG的影响(i±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>与模型组比较*p<0.05,**p<0.01(3)rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织形态学影响光镜观察伪手术组肾小管上皮细胞无肿胀及变性，形态正常。模型组可观察到肾小管上皮细胞变性坏死较严重，尤其以近曲小管上皮细胞为重，可见细胞明显肿胀，胞浆疏松；上皮细胞内可见明显的玻璃样变性和空泡变性，并有大量蛋白管型形成；肾间质充血及出血明显，伴有炎细胞浸润。小剂量治疗组肾小管上皮细胞变性坏死严重，上皮细胞广泛性脱落、坏死到管腔内，，可聚集形成细胞管型。坏死细胞的细胞核固縮，染色变深，部分细胞核碎裂、溶解消失。残存上皮细胞水肿和玻璃样变性较重，胞浆内可见大量玻璃滴状物，同吋管腔内可见蛋白管型和坏死脱落细胞。肾间质可见大量红细胞，充血及出血较重，伴有炎症细胞浸润。大剂量治疗组可见肾小管上皮细胞损伤较模型组明显减轻，仅小部分细胞出现轻微肿胀，脱落及空泡变性，坏死细胞较少，肾小管形状保持良好。中剂量治疗组较大剂量治疗组病变略重，少部分管腔内可见蛋白管型，余病理变化与大剂量治疗组相仿。阳性对照组中未发现明显的形态学改变，仅个别近曲小管上皮细胞空泡变性及坏死，部分肾小管内可见管型及坏死细胞，其余组织形态未见异常。参见附图1、图2。(4)rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾脏组织超微结构的影响电镜观察伪手术组肾组织细胞形态，结构正常。模型组可观察到肾小管上皮细胞内可见大量大小颗粒不等的溶酶体，细胞核内异染色质趋边凝集，部分核发生固縮，细胞质内发生空化，细胞器减少。小剂量组肾小球结构未见明显改变(无基底膜增厚，厚薄不均，足突融合)，可见部分肾小球血管内皮细胞增生；部分肾小管细胞细胞细胞核固縮，部分肾小管上皮细胞核内异染色质趋边凝集，胞质内可见较多体积较大溶酶体，部分细胞质空化，线粒体中度减少。中剂量治疗组肾小球未见明显改变，肾小管上皮细胞质内可见大小不一的溶酶体，数量，体积与模型组相似，部分细胞，细胞质轻度空化。部分肾小管上皮细胞核固縮，胞质空化(中度)，细胞内可见少量溶酶体，但体积相对较大。大剂量治疗组肾小管上皮细胞核形态基本正常，细胞质内仍可见溶酶体，但数目较模型组明显减少，仍可见线粒体局部空化，部分细胞细胞质内可见轻度空化，髓样小体少见。参见图3、图4、图5、图6。本研究显示rhKD/APP对大鼠的肾脏缺血再灌注损伤确有一定的保护作用，主要体现在rhKD/APP可以降低肾脏缺血再灌注损伤后血清肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)及尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的水平。SCR、BUN是评价肾功能的常用指标。e-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)此酶为溶酶体中一种重要的酶，可作为肾损伤一个极为灵敏的指标。实验结果显示与模型组比较，大剂量组血清BUN、SCR及尿NAG显著降低(p<0.01)，中剂量组血清BUN、SCR及尿NAG明显降低(P〈0.05);与依那普利组比较，中剂量组对肾脏I/R后大鼠血清BUN、SCR及尿NAG的影响与阳性对照组相近，大剂量组对血清BUN、SCR及尿NAG的影响优于对照组。提示rhKD/APP在一定程度上有减轻肾脏缺血再灌注损伤、保护肾功能的作用。本研究从形态学上也证实了rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用，光镜下的冊切片和透射电镜显示伪手术组肾脏组织无明显病理学改变。对照组电镜下可见线粒体明显肿胀变形，形态不规则，排列不整齐，晴稀疏断裂，排列紊乱，有断裂、膜融合，近曲小管细胞微绒毛减少消失，细胞内空泡增多；光镜下可见近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死，肾小管腔扩张，内可见管型和坏死脱落细胞，可见明显管周血管的扩张淤血。而rhKD/APP组(小、中、大三组)也可见部分肾脏组织结构的破坏，但明显轻于对照组。提示rhKD/APP对大鼠的肾缺血再灌注损伤具有明显的抑制作用，因而对肾功能及组织结构起到了明显的保护作用。实施例2:rhKD/APP对肾缺血再灌注损伤大鼠自由基-抗自由基平衡中的保护作用近年来的研究表明急性肾缺血和缺血再灌注过程中，自由基介导的自由基连锁反应具有病理损害作用。自由基引起细胞内DNA、RNA、蛋白质、氨基酸以及多糖高分子物质的氧化、交联、变性和降解，并且使细胞膜上的不饱和脂肪酸形成过氧化脂质。自由基损伤膜性细胞器，导致膜对C^+通透性增加，而钙超载又激活磷脂酶和脂质过氧化反应，这种恶性循环持续进行致使细胞发生不可逆损伤直至死亡。抗自由基治疗可减轻急性脑缺血和再灌注损伤，保护神经细胞及其功能。丙二醛(MDA)是脂质过氧化过程中的代谢产物，机体缺血低氧时产生自由基的多少与MDA含量成正相关。SOD是一种金属蛋白酶，是体内重要的自由基清除酶，其活性高低可反映机体清除自由基的能力。肾近曲小管细胞内含NO合酶(包括组成型和诱生型)，通过(^2+、钙调蛋白依赖或独立的途径生成一氧化氮(NO),NO可很快与02结合，生成反应性更强的过氧化含氮化合物(ONOO-)。NO本身即是一自由基，具有细胞毒作用。再灌注时释放的氧自由基是再灌注损伤的主要原因。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的主要作用是清除氧自由基，防止人体内氧自由基对细胞和亚细胞系统的破坏。本实验采用大鼠双侧肾蒂夹闭方法制备大鼠肾缺血再灌注模型，研究rhKD/APP对肾缺血再灌中MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性的影响，同时研究rhKD/APP干预治疗对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用。1、动物模型的制备和动物分组动物模型的制备参见实施例l。各组大鼠于造模48h后，在规定的时间点再次麻醉、从腹主动脉抽血3-4ml，静置析出血清，以3000r/分，离心10分钟取上清，用于检测MDA、NO含量及SOD、GSH-PX、NAG活性。2、生化指标的测定(1)血清NO测定腹主动脉取血，离心(3000rpm)IO分钟，取血清0.1ml。用南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮测试盒测定一氧化氮含量。原理NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为N(y—和N03—，而NC^又进一歩转化为N03—，本法利用硝酸还原酶特异性将N(y-还原为N02—，通过显色深浅测定其浓度的高低。计算公式如下NO含量(pmol/L)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)+(标准管吸光度-标准空白管吸光度)x标准品浓度x样品测试前稀释倍数(2)血清丙二醛测定使用丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)测定MDA含量。过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成红色产物，在532nm处有最大的吸收峰。血清MDA含量计算方法血清MDA含量二(测定管吸光度-测定空白管吸光度)+(标准管吸光度-标准空白管吸光度)x标准品浓度x样品测试前稀释倍数。(3)血清超氧化物歧化酶活性测定根据超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)进行血清中SOD活性的测定和计算。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的的吸光度值，通过计算可求出被测样品中的SOD活性。计算公式如下血清SOD二(对照管吸光度-测定管吸光度)+对照管吸光度+50%><稀释倍数(4)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性测定使用GSH-PX测试盒(南京建成生物工程研究所提供)进行血清中GSH—PX活性的测定和计算。GSH可促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成水及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH-PX的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶活力。计算公式如下血清GSH-PX活力单位=(非酶管吸光度-酶管吸光度)-(标准管吸光度-空白管吸光度)x标准管浓度(20^mol/L)x稀释倍数x样本测试前稀释倍数所有实验数据均以均数土标准差表示(f±S)表示，各组所得的数据处理采用单因素方差分析和DimnetT检验进行比较。3、结果(1)rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清一氧化氮(NO)的影响各实验组大鼠在肾缺血45min,再灌注48h后，与伪手术组比较，模型组大鼠血清NO含量显著升高(p<0.01)。与模型组相比，大剂量组和中剂量组大鼠血清N0含量显著降低(p<0.01或p〈0.05);小剂量组对血清NO含量影响无显著性差异(p〉0.05)。阳性对照组大鼠血清NO含量明显降低(p〈0.05)。大剂量组对肾缺血再灌注损伤后大鼠血清NO含量的影响优于依那普利组；中剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清NO含量的影响与依那普利组相近。(参见表3)。表3rhKD/APP对大鼠肾缺血再灌注损伤血清NO的影响(X±S，n=10)组别NO(,1/1)伪手术组35.63±8.45**模型组50.19±9.90rhKD/APP10000KIU/kg47.65±7.40rhKD/APP20000KIU/kg40.80±8.87*rhKD/APP40000KIU/kg37.78±12.2广依那普利组42.61±7.36*与模型组比较*p<0,05，**p<0.01(2)rhKD/APP对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清丙二醛(MDA)的影响各实验组大鼠在肾缺血45min，再灌注48h后，MDA含量与伪手术组比较，模型组大鼠血清MDA含量显著升高(p〈0.0D。与模型组比较，大剂量和中剂量组大鼠血清MDA含量显著降低(p<0.01或p〈0.05);小剂量组对血清MDA含量影响无显著性差异(p〉0.05)。大剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清MM含量的的影响优于依那普利组；中剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清MM含量的影响与依那普利组相近。(参见表4)。表4rhKD/APP对肾缺血再灌注损伤大鼠血清MDA的影响(X±S,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>与模型组比较*p<0.05，**p<0.01(2)rhKD/APP对大鼠肾脏缺血再灌注损伤血清SOD的影响各实验组大鼠在肾缺血45min，再灌注48h后，与伪手术组比较，模型组大鼠血清SOD活性较显著降低(pO.Ol)。与模型组比较，大剂量组和中剂量组大鼠血清SOD活性显著升高(p<0.01或p0.05)。大剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清SOD活性的的影响优于依那普利组；中剂量组与小剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清SOD活性的影响与依那普利组相近。(参见表5)。表5rhKD/APP对肾缺血再灌注损伤大鼠SOD的影响(X±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>与模型组比较*p<0.05，**p<0.01(4)rhKD/APP对大鼠肾脏缺血再灌注损伤后血清GSH-PX活性的影响各实验组大鼠在肾缺血45min，再灌注48h后，与伪手术组比较，模型组大鼠血清GSH-PX活性显著降低(p〈0.0D。与模型组比较，大剂量组和中剂量组大鼠血清GSH-PX活性显著升高(p〈0.01或p〈0.05);小剂量组对血清GSH-PX活性影响与模型组比较无显著性差异(p〉0.05)。大剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清GSH-PX含量的的影响优于依那普利组；中剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清GSH-PX含量的影响与依那普利组相近。(参见表6)。表6rhKD/APP对大鼠肾缺血再灌注损伤GSH-PX的影响(X±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>我们的实验结果显示大剂量rhKD/APP组对于肾缺血再灌注损伤后大鼠血清MDA、NO含量活性下调及SOD、GSH-PX活性的上调优于传统肾脏保护药依那普利；中、小剂量组对于肾缺血再灌注损伤后大鼠血清MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性的上调与依那普利类似。(参见表3-6)。这说明rhKD/APP在大鼠肾缺血再灌注时发挥了自由基清除作用。体内活性氧自由基的大量释放，对细胞膜和膜性细胞器的损伤显著，尤其是溶酶体酶释放，蛋白溶解酶激活，势必要导致体内很多丝氨酸蛋白酶的活化反应，而其丝氨酸蛋白酶抑制剂消耗也相应增多。在这种病理状态下，^l体原本维持的各种反馈和动态平衡被破坏，蛋白酶活化和激活占优势，导致活性氧自由基释放的激增和释放。钙超载和氧自由基爆发拉开了局部细胞损伤和凋亡的序幕。丝氨酸蛋白酶抑制剂能够抑制ATP依赖的Na-K-ATPase水解活性，使ATPase水解酶的活性下调而ATP降解速度减慢，钙超载延迟。丝氨酸蛋白酶抑制剂能够拮抗激酶的活性，使次黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶的活性显著降低，显著对抗自由基爆发，因此，体外给予丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以通过拮抗产生自由基网络中的蛋白酶介导的分子生物学事件，发挥一定的代偿和逆转作用，最终结果是减轻了自由基级联放大效应的损伤，从而保护濒死的肾组织细胞。实施例3rMD/APP在肾缺血再灌注的炎症-抗炎症平衡中的治疗作用大量证据表明，在肾脏缺血再灌注中存在着白细胞聚集和浸润等病理现象。再灌注可促进局部炎症反应，加重肾脏的缺血损害。再灌注时活化的白细胞在内皮细胞表面滚动、贴壁、最终渗入周围组织，所以白细胞浸润可加重缺血再灌注损害。缺血组织内白细胞的存在不仅是损伤的病理反应，而且更促进缺血损害。炎症反应是加重肾缺血再灌注损伤的一个重要因素。髓过氧化物酶(MP0)主要存在于中性粒细胞，研究证明MPO可作为中性粒细胞的标记物，因此测定MPO活性己成为研究白细胞浸润的常用方法。肾缺血再灌注炎症反应过程中的一个重要部分是细胞因子，如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)等。在肾缺血再灌注时，受损伤的内皮细胞及激活的白细胞可以产生和释放大量的细胞因子，许多细胞因子又反过来可作为启动因素，引起肾缺血后的炎症反应，加重损伤。核因子NF-KB参与肾脏缺血，再灌注损伤的病理生理学过程。缺血刺激可诱导肾小管细胞内NF-kB的核内转位和激活。此外，NF-kB还可介导缺血诱导的肾小管细胞凋亡。本研究采用大鼠双肾动静脉夹闭法制备肾缺血再灌注模型，预先给予rhKD/APP(10000，20000，40000KIUkg—0后，观察其对大鼠肾缺血再灌注损伤过程中组织MPO、TNF-a和核因子的影响。1、模型制备、分组和给药模型动物的制备及分组参见实施例1和2。2、生化检测(1)MPO活性测定各组大鼠于缺血48h后，再次用3%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血后，取肾脏称重并用生理盐水漂洗。取100mg肾脏组织储存于-7(TC，按肾重与试剂盒(上海森雄科技实业公司)中提供的匀浆介质混合制成5%组织匀浆液。按照试剂盒说明书检测脑组织匀浆中的MPO活性。肾组织MPO活性的计算公式为MPO单位/克湿肾=(测定管OD值-对照管OD值)/11.3/样品量(克)，为了消除水肿因素影响，通常以每克干肾组织中MPO活性来反映中性白细胞的浸润程度，即MPO单位/克干肾二MPO单位/克湿肾x组织湿/干重比。(2)ELISA方法测定TNF-a腹主动脉采血，离心取血清O.lml。按照肿瘤坏死因子测定试剂盒(上海森雄科技实业公司)推荐的双抗体夹心ABC-ELISA方法，检测肿瘤坏死因子。简单地说，用抗大鼠TNF-a单抗包被于酶标板上使标准品和样品中的大鼠TNF-a与单抗结合，然后加入生物素化的抗大鼠TNF-a形成免疫复合物。连接在板上的免疫复合物与辣根过氧化物酶标记的抗生物素与生物素结合后，加入酶底物OPD即出现黄色，然后在492nm处测0D值。大鼠TNF-a浓度与OD值成正比，故可通过绘制标准曲线求出标本中大鼠TNF-a浓度。(3)免疫组化方法测定核因子NF-icB各组大鼠于缺血48h后，再次用3%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血后，取肾脏称重后用生理盐水漂洗。取100mg肾脏组织多聚甲醛液中固定，常规制备石蜡切片。将切片置于3。/。的HA中浸泡10分钟，以灭活内源性过氧化物酶。抗原热修复并用PBS洗涤后，加入一抗(兔抗TNF-a抗体和NF-kB抗体，1:150稀释)4°C保温过夜。然后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗工作液，37C孵育20分钟。PBS冲洗后，用DAB显色5—20分钟。然后进行苏木精复染(5分钟)。用PBS液替代一抗，作阴性对照。HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统，每张切片在镜下(200x)随机选取5个视野，计算阳性血管数，经观察血管内皮细胞被染成棕色者为阳性血管。取均数进行统计。实验数据以；±s表示，各组所得的数据处理采用单因素方差分析和DunnetT检验进行比较。3、实验结果1)rhKD/APP对肾缺血再灌注损伤大鼠血清MPO的影响大鼠肾缺血45min再灌注48h后，各组MPO活性(见表l)。结果表明与伪手术组比较，模型组MPO活性显著增高。与模型组比较，MPO活性，大剂量组显著降低(P<0.01)，大剂量组对肾缺血再灌注大鼠血清MPO活性的影响优于依那普利组；中剂量和小剂量组血清MPO活性有明显降低(P〈0.05)，与依那普利组相近。(参见表7)表7rhKD/APP对肾缺血再灌注大鼠血清MPO的影响(X±S，n=]0)组别MPO(U/L)伪手术组16.53±7.3"模型组34.12±15.8rhKD/APP10000KIU/kg29.63±16.7*,rhKD/APP20000KIU/kg28.82±15.8*rhKD/APP40000KIU/kg25.48±8.9"依那普利组28.57±15.3*与模型组比较*p〈0.05,**p<0.012)rhKD/APP对肾缺血再灌注损伤大鼠血清肿瘤坏死因子的影响大鼠肾缺血45min再灌注48h后，各组TNF-a含量(见表2)。结果表明与伪手术组比较，模型组血清TNF-a显著增高(P<0.01)。与模型组比较，小剂量组、中剂量组、大剂量组血清肿瘤坏死因子均显著降低(P〈0.05或P<0.01)。大剂量组对肾缺血再灌注后大鼠血清TNF-a的影响优于依那普利组；小剂量组、中剂量组与依那普利组相近。(参见表8)表8rhKD/APP对大鼠肾缺血再灌注血清肿瘤坏死因子的影响(X±S，n=10)组别TNF陽a(U/L)假手术组8.53±2.3"模型组41.72±17.8rhKD/APP10000KIU/kg24.67±8.9"rhKD/APP20000KIU/kg28.02±14.8'rhKD/APP40000KIU/kg35.73±15.7*依那普利组27.57±16.3*与模型组比较*p<0.05，**p<0.013)rhKD/APP对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织NF-kB表达的影响大鼠肾缺血45min再灌注48h后，各组NF-KB表达(见表9)。结果表明与伪手术组(图31)比较，模型组(图32)肾组织NF-KB表达显著增多(P〈0.01)。与模型组比较，小剂量组(图33)、中剂量组(图34)、大剂量组(图35)肾组织NF-kB表达均显著下调(P〈0.01)，与依那普利组(图36)相近。(参见表9和图7、图8)表9rhKD/APP对大鼠肾缺血再灌注肾组织核因子(NF-icB)的影响(X土S，n=0)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本实验结果显示，大鼠肾脏MPO、TNF-a活性均显著降低，这说明rhKD/APP抑制了炎症反应的中性粒细胞的活化及炎性因子的释放。同时rhKD/APP各个剂量组的NF-kB的表达均明显降低，说明rhKD/APP通过抑制NF-kB的过度表达发挥了抗炎作用。提示rhKD/APP可能是通过抑制中性粒细胞粘附、聚集、浸润，降低细胞因子、粘附分子的表达、抑制NF-KB的过度表达，抑制或减轻了炎症级联放大效应，对肾缺血再灌注大鼠发挥肾脏保护作用。实施例4:rhKD/APP在肾缺血再灌注凋亡-抗凋亡平衡中的保护作用细胞死亡通常分为坏死和凋亡二类。坏死是一个被动的细胞死亡过程，物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等因素均可导致细胞坏死。细胞凋亡(apoptosis)是细胞接受某种信号后或受到某种因素刺激后一种主动的、由一些相关基因相互作用、以细胞DNA早期降解为特征的自杀过程，又称程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)。凋亡是一个能量相关的过程，因此再灌注能够通过恢复细胞内的能量而加重凋亡的发生。凋亡以细胞染色质致密、核间小体DNA片段形成、胞浆膜发泡、凋亡小体(被周围健康细胞吞噬)出现，不伴炎症反应为特征。缺血后再灌注越早，肾实质细胞坏死和凋亡越轻。另一方面再灌注损伤产生的氧自由基等可以导致氧化性DNA损伤，后者如不能及时修复，积累到一定程度，则可通过启动凋亡程序，引起细胞凋亡。本研究采用大鼠双肾肾蒂夹闭法制备肾缺血再灌注模型，预先给予rhKD/APP(10000，20000，40000KIUkg1)后，观察其对大鼠肾缺血再灌注引起的细胞凋亡的保护作用。1、动物模型的制备、分组和给药模型动物的制备参见实施例l。2、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)法原位检测细胞凋亡在细胞凋亡过程中，基因组DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH断端，这些DNA链缺口，可以利用酶标法来识别。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，可将标记有荧光素的dUTP转移到DNA片段的3'-OH断端，荧光素由结合有辣根过氧化物酶(POD)的Fab段抗体识别。加入底物DAB显色后，即可用光镜检查被染色细胞，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。各组大鼠肾缺血45min再灌注48h后，取肾标本常规制备石蜡切片备用。依照试剂盒说明书进行TUNEL染色。阴性对照为核苷酸混合液代替TUNEL反应混合液。凋亡阳性细胞记数方法采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统，每张切片于高倍镜下(200x)缺血侧皮质区随机采集5个视野，记数每个视野中的凋亡细胞个数，取高倍视野平均阳性细胞数进行统计。实验数据以；±s表示，各组所得的数据处理采用单因素方差分析和DunnetT检验进行比较。3、结果镜下可见，伪手术组大鼠肾小管上皮细胞可见较多的TUNEL阴性反应细胞，核着色浅蓝，细胞疏散且界限较为不清，偶见阳性反应细胞。模型组大鼠肾小管上皮细胞可见大量TUNEL阳性反应细胞即凋亡细胞，胞核固縮浓染，呈深棕色，胞体縮小，形状不规则，凋亡指数显著高于伪手术组(P<0.01)。阳性对照组大鼠肾小管上皮细胞有中等量TUNEL阳性细胞表达。rhKD/APP(小、中、大剂量)组大鼠肾小管上皮细胞的TUNEL阳性细胞均明显减少，着色较浅，rhKD/APP各剂量组凋亡指数，与模型组相比均显著减少(P<0.05)，与依那普利组相近。参见表10和图9、图10)。表10rhKD/APP对大鼠肾缺血再灌注细胞凋亡的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>与模型组比较*p<0.05，**p<0.01体外给予丝氨酸蛋白酶抑制剂rhKD/APP，可以通过几个途径保护细胞免于凋亡，包括拮抗丝氨酸蛋白酶依赖的NF-KB炎症转录途径，抑制了炎症的发生；拮抗丝氨酸蛋白酶依赖的次黄嘌呤脱氢酶诱导的自由基的连锁反应，抑制了自由基损伤；拮抗钠钾ATP酶依赖的钙超载和细胞膜损伤，维持了酪氨酸蛋白酶依赖的NF-kB凋亡抑制信号，从而间接防止细胞的凋亡。由于凋亡的整个过程发生非常复杂，其机制仍需要进一步研究。我们的研究显示，rhKD/APP使肾缺血再灌注损伤中的组织细胞免于凋亡而发挥了器官保护作用。序列表<no>吉林圣元科技有限公司<120>蛋白酶抑制剂的肾细胞保护功能及应用<140><141><160>4<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增引物。<400>1CTCTGAATTCAGGTCTGCAGTGAACAAGCC<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增引物。<400>2GAAGTCTAGATTAAATGGCGCTGCCACACAC<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的PCR扩增引物。<400>3TCGAGAAGAGAGAGGTTGTTAGAGAGGTCTGCA<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>4GACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC权利要求1、Kunitz型蛋白酶抑制剂在生产用于预防和治疗肾缺血后再灌注损伤相关疾病的药物中的应用。2、根据权利要求1的应用，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是以DNA重组技术制备的。3、根据权利要求l的应用，其中所说的Kunitz型蛋白酶抑制剂是人源的。4、根据权利要求1的应用，其中所说的病理性肝损伤选自急性或慢性肾病和肾动脉硬化。5、一种由Kunitz型蛋白酶抑制剂以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。全文摘要本发明涉及重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂(rhKD/APP)，特别是涉及rhKD/APP的肾细胞保护功能，及其在生产用于预防和治疗肾的再灌注损伤性疾病的药物中的应用。本发明进一步涉及由作为基本活性成分的重组人Kunitz型蛋白酶抑制剂及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。文档编号A61K38/57GK101337068SQ200710055839公开日2009年1月7日申请日期2007年7月4日优先权日2007年7月4日发明者韩树海,颜炜群申请人:吉林圣元科技有限责任公司