专利名称：一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测微量氯羟吡啶的器具，特别是涉及一种饲料和动物源性食品中氯羟吡啶残留分析的胶体金层析检测试纸条或卡。
背景技术：
氯羟吡啶(CLOP)，商品名为克球酚，化学名为3，5-二氯-2，6-二甲基-4-羟基吡啶，是一种预防畜、兔球虫病的饲料药物添加剂，长期使用或不按规定用药会造成氯羟吡啶在动物体内和组织中残留，具有一定的致畸性和胚胎毒性。现在，欧盟、美国、加拿大、日本以及中国、中国台湾都规定了各种动物组织中氯羟吡啶残留最高限量标准。我国规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为O. 01mg/kgo组织中氯羟吡啶的检测方法主要采用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和气谱/质谱联用法(GC/MS)等。气相色谱相对麻烦，高效液相色谱法具有简便快速、灵敏的特点，成为分析鸡肉组织中氯羟吡啶残留的主要方法。我国规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为O. 01mg/kg,而相应标准的检测限为O. 05mg/kg，无法满足检测要求。同时，在样品处理过程中，需先经葡聚糖凝胶阴离子交换柱去除干扰杂质，再过碱性氧化铝SPE柱，不仅过程繁琐，而且降低了的回收率。理化分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。酶联免疫吸附法(ELISA)法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定吸光值(OD)值进行结果判定。缩短了检测时间，可以对残留药物进行定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。
发明内容
本发明的目的是研制出特异、敏感、快速、简便的氯羟吡啶残留胶体金层析检测试纸条和试纸卡。一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。所述的氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，所述的隐形检测线和隐形对照线平行排列组合为“ 11 ”。所述的试纸条或卡，所述金标物结合垫为将1: 100 1: 500稀释(体积比)的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，4°c低温真空干燥，制备CLOP金标物结合垫。所述的试纸条或卡，所述胶体金标记抗体制备方法为将稀释后的胶体金和单克隆抗体或多克隆抗体按照不同的浓度倍比，选择胶体金显色红色的最小稀释浓度作为胶体金标记抗体的最佳量，用于胶体金标记抗体的制备。所述的试纸条或卡，所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为Al、氯羟吡啶半抗原的改造亲核取代反应引入酯键，然后在碱、酸的作用下，合成含有羧基的氯羟吡啶半抗原；A2、CL0P-2C-载体蛋白人工抗原的合成采用活泼酯法合成CLOP人工免疫原，称取75mg CLOP半抗原溶解于3mL N, N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺35mg和N-羟基琥珀酰亚胺18mg，在室温下磁力搅拌反应过夜12h，此液为A ;称取20mgBSA溶于2mL0. 01mol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲液溶液中，此液为B ;将反应液B置于磁力搅拌器上，4°C下将反应液A缓慢滴加到反应液B中，搅拌反应过夜。次日将反应液置于经过预处理的透析袋内，在PBS中搅拌透析7天，得到偶联产物CL0P-2C-BSA，分装上清液，冻存于_20°C冰箱中，备用；A3、氯羟吡啶单克隆抗体和多克隆抗体的获得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50ii g/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NStl骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备CLOPmAb ；多抗制备用CL0P-2C-BSA载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50 y g 100 y g/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4 5次，每次间隔4 8周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测其定效价达到IO5以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，_20°C冻存备用。本发明的胶体金层析检测试纸条和试纸卡具有下列各项优点①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条和试纸卡以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体(pAb)为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体或多克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条和试纸卡具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到Ippb lOppb。②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，只要将试纸条插入被检样品或将待检样品滴加在试纸卡上10 20秒钟，在10分钟内即可判定检测结果。③结果显示形象、直观、准确。胶体金层析检测试纸条和试纸卡均以显示棕红色线“ I ”和“ I I ”作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条棕红色线“ I ”时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条棕红色线“ I I ”时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。④节省费用，适用范围广，便于推广。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，比用仪器分析和进口 ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条和试纸卡的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
图1、氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条结构示意图。图2、氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。图3、为本发明的氯羟吡啶半抗原改造的技术路线图。图4、为氯羟吡啶的红外质谱图。图5、为氯羟吡啶改造后的半抗原红外质谱图。
具体实施例方式一种适用于氯羟吡啶残留检测的胶体金层析检测试纸条和试纸卡，它包括检测试纸条或试纸卡、用于检测的试剂，其中试剂包括样品稀释液，样品提取液。要制成氯羟吡啶 胶体金层析检测试纸条和试纸卡，首先需要对氯羟吡啶半抗原进行改造，制备氯羟吡啶偶联载体蛋白，用于制备相应的检测线和抗体；而且需要制备氯羟吡啶金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉。本发明还包括动物可食性组织如肝脏、肌肉、饲料样品预处理方法，将待检动物组织或饲料样研磨捣碎后经乙腈完全提取，烘干后加入适量样品稀释液即可用于本胶体金层析检测试纸条和试纸卡检测；尿样无需研磨捣碎直接按一定比例添加乙腈和稀释液进行检测。本发明的胶体金层析检测试纸条和试纸卡，样品处理简单，适合于大量样品的快速检测和筛选，具有高特异性、高灵敏度、高精确率等特点，最低检测限O. 5μ g/mL。以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1、氯羟吡啶抗原、抗体的制备1.1氯羟吡啶半抗原的改造与鉴定亲核取代反应引入酯键(-C00-基团)，然后在碱、酸的作用下，合成含有羧基的氯羟吡啶半抗原。取5mmoL CL0P，溶于15ml O. 5mol/L NaOH溶液中，待完全溶解后，减压蒸馏除去水分，常温下水洗生成物、抽虑、干燥后，用20mL DMF溶解，滴加O. 56mL溴乙酸乙酯，60°C恒温反应3h，冷却至室温，向反应液中加入150mL蒸馏水，放入4°C冰箱中冷却过夜，抽滤一水洗—抽滤得到含有酯键的CLOP衍生物。然后加入20mL蒸馏水，加热至85°C，滴加Imol/LNaOH溶液使固体全部溶解，冷却至室温，再滴加lmol/LHCI使溶液pH值在4左右，4°C冷却过夜，抽滤、重结晶、干燥得到含有羧基的氯羟吡啶半抗原(CL0P-2C)，合成路线见图3。红外(IR)鉴定取CL0P-2C 2mg,加入干燥KBr约200mg，置于玛瑙乳钵中，在红外灯照射下研磨、混匀，装入压片模具，8t压力下lOmin，制得厚度Imm的透明KBr样品片，上机测试，测试结果见图4、图5。图4中氯羟吡啶分子上的羟基(-0H)、吡啶环骨架在3249. 2133cm_\l561. 3671CHT1处分别有明显的吸收；而与之相比较，图5中吡啶环骨架吸收峰仍然存在(1556. 8925CHT1)，但3249. 2133cm—1处吸收峰消失，说明吡啶环上的-OH消失；同时在1738. 4146CHT1处出现了羰基(-C = O)吸收峰，3442. 9772cm_1处出现峰形宽而钝的吸收峰(由羧基中的-OH产生)，判断生成物中带有羧基官能团，氯羟吡啶半抗原合成成功。1.2CL0P-2C-载体蛋白(BSA)人工抗原的合成
采用活泼酯法合成CLOP人工免疫原称取75mg CLOP半抗原(CL0P-2C)溶解于3mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入二环己基碳二亚胺(DCC) 35mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 18mg,在室温下磁力搅拌反应过夜12h，此液为A ;称取20mgBSA溶于2mL 0. 01mol/LpH 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，此液为B。将反应液B置于磁力搅拌器上，4°C下将反应液A缓慢滴加到反应液B中，搅拌反应过夜。次日将反应液置于经过预处理的透析袋内，在PBS中搅拌透析7天，得到偶联产物CL0P-2C-BSA，分装上清液，冻存于_20°C冰箱中，备用。1. 3氯羟吡啶单克隆抗体(CLOP mAb)和多克隆抗体(CLOPpAb)的获得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50 u g/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇(PEG)-1500作用下与NStl骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株。之后采用体内诱生腹水法制备CLOP mAb。获得的腹水用饱和硫酸铵盐析法纯化。计算该单抗亲和力常数。 多抗制备用CL0P-2C-BSA载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50 y g 100 y g/次，背部皮下分多点注射。首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化；加强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，连续免疫4 5次，每次间隔4 8周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测其定效价达到IO5以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，_20°C冻存备用。实施例2、CLOP胶体金免疫试纸条和试纸卡的制备2.1胶体金层析检测试纸条和试纸卡检测反应原理当胶体金层析检测试纸条或试纸卡测试端加入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标物结合垫中的金标抗体一起向包被膜扩散，并最终渗入手柄端吸水滤纸。在扩散过程中，待测物可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上待测物的抗原结合点，阻止金标抗体与包被膜上偶联载体蛋白抗原的检测线结合，检测线不能显色，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体则可与金标抗体结合，形成一条棕红色对照线“ I ”，为阳性表示。反之样品溶液中无待测物则不能阻止金标抗体与包被膜上偶联载体蛋白抗原的检测线结合，显示棕红色检测线“ I ”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照线“ I ”，这样形成两条棕红色线“ I I ”，为阴性表示。如果包被膜上没有棕红色线显示，则表明试纸条已失效。2. 2氯羟吡啶胶体金免疫试纸条和试纸卡的制备(I)待标氯轻卩比唳mAb或pAb与胶体金溶液的预处理将待标氯轻卩比唳mAb或pAb溶液IOOOOrpm离心30mmin，除去杂质；用0. lmol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8. 2。(2)待标氯轻卩比唳mAb或pAb与胶体金最佳标记浓度的确定确定氯轻卩比唳mAb与胶体金最适标记浓度取酶标板9孔，每孔25 u I ddw铺底，第一孔加入400 u g/25 u L的CLOP mAb，之后进行倍比至第八孔，第九孔为空白对照；用0. lmol/L K2CO3调节胶体金溶液pH 8. 2，加入到酶标板中，每孔125 y L，混勻，静置IOmin后，加入0.1mLlO% NaCl溶液25 y L，混匀，静置Ih ;对照孔与CLOP mAb量不足以稳定金溶胶的各孔呈现由红变蓝的聚沉现象，而CLOP mAb量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变，选择其中含CLOP mAb量最低孔第7孔的量，为ImL胶体金所需的CLOP mAb的量，该孔的CLOP mAb的量为12. 5 μ g，在此基础上增加10% (体积比)即为待标CLOPmAb的实际用量，待标的量为13. 75 μ go(3)胶体金与氯羟吡啶IgG抗体的结合按照上述第7孔的结果，分别取ImL胶体金和对应量的氯轻卩比唳mAb 13. 75 μ g,搅拌下混合,静置反应lOmin, IOOOOrpm离心30min,弃上清，沉淀物稀释后加入含I %的(体积比)BSA的硼酸钠溶液(硼酸钠浓度为10%，质量体积比)，BSA作为稳定剂，4°C保存备用。将1: 100 1: 500稀释(体积比)的胶体金标记抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)吸附于精制玻璃纤维棉中，4°C低温真空干燥，制备CLOP金标物结合垫。参考1和图2，衬板I用硬质塑胶条制成。样品垫2用玻璃纤维棉制成。金标 物结合垫3为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉。包被膜4本实施例采用硝酸纤维素膜。隐形检测线5用CLOP-载体蛋白偶联物在包被膜上印制成“I”。隐形对照线6用山羊抗小鼠免疫球蛋白(GaM IgG)溶液在包被膜上印制成“ I ”，两条线平行排列组合为“ I I ”。手柄端的吸水垫7用吸水滤纸制成。覆盖在样品垫2和金标物结合垫3上面的样品端白色保护膜8-1，手柄端保护膜8-2覆盖在吸水垫7上面的手柄端其它颜色保护膜(如黄色)。标识线9为测试样品的带箭头标示线，即在样品垫2与金标物结合垫3交界处对应的白色保护膜偏向样品垫一侧约O. 5cm处印制的标示线，在标示线右侧保护膜上印有箭头及max字样。也可以根据需要制成试纸卡。实施例3、本发明氯羟吡啶胶体金免疫试纸条和试纸卡的性能3.1本发明氯羟吡啶胶体金免疫试纸条和试纸卡的灵敏度试验将氯羟吡啶母液(lmg/mL)浓度分别稀释为0、2· 0、4· 0、8· O、16. 0、32· O μ g/L和64 μ g/L的CLOP标准品加到CLOP-试纸条和试纸卡(CLOP-Strip)的样品垫上，静置反应10分钟，用读条仪读取T线扫描面积光密度的相对光密度值(G/DX A-ROD (pixel)，式中G为graph表不图表，D为density表不光密度，A为area表不扫描面积，DXA为扫描面积的光密度，ROD为relative optical density表示相对光密度值，pixel为不同距离像速),以不同浓度标准品与空白标准品相对光密度值的百分率(G/DXA-R0D(pixel)% )为纵坐标，以不同标准品浓度的常用对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制检测试纸的标准曲线，推导回归方程，进行相关回归分析。根据检测试纸的显色结果，取G/DXA-R0DXpiXel% =80%为机读敏感度，取G/DXA-ROD (pixel) %= 50%为目测敏感度，确定CAP-Strip的检测限。检测试纸的机读检测限为0. 5μ g/L，根据肉眼观察进行判断，目测检测限为5. 0μ g/L。3. 2本发明氯羟吡啶胶体金免疫试纸条和试纸卡的特异性试验以交叉反应率为指标判定该试纸的特异性。将与CLOP结构相似，功能相近的抗生素类药物或非抗抗生素类药物作物类似物来检测该试纸的特异性。目测结果显示，检测试纸与山羊抗小鼠IgG的结合反应特异性很强；与CL0P-2C的交叉反应为4. 0μ g/L，这是因为CLOP、CL0P-2C具有相同的抗原表位；与其他抗球虫药和抗生素类药物无交叉反应性。表I氯羟吡啶胶体金免疫试纸与氯羟吡啶类似化合物的交叉反应
权利要求
1.一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，其特征在于所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。
2.根据权利要求1所述的氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，其特征在于，所述的隐形检测线和隐形对照线平行排列组合为“ 11 ”。
3.根据权利要求1所述的试纸条或卡，其特征在于，所述金标物结合垫为将1: 100 1: 500稀释(体积比)的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，4°C低温真空干燥，制备CLOP金标物结合垫。
4.根据权利要求3所述的试纸条或卡，其特征在于，所述胶体金标记抗体制备方法为将稀释后的胶体金和单克隆抗体或多克隆抗体按照不同的浓度倍比，选择胶体金显色红色的最小稀释浓度作为胶体金标记抗体的最佳量，用于胶体金标记抗体的制备。
5.根据权利要求4所述的试纸条或卡，其特征在于，所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为 Al、氯羟吡啶半抗原的改造亲核取代反应引入酯键，然后在碱、酸的作用下，合成含有羧基的氯羟吡啶半抗原； A2、CL0P-2C-载体蛋白人工抗原的合成采用活泼酯法合成CLOP人工免疫原，称取75mg CLOP半抗原溶解于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺35mg和N-轻基琥珀酰亚胺18mg，在室温下磁力搅拌反应过夜12h，此液为A ;称取20mgBSA溶于2mLO.01mol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲液溶液中，此液为B ;将反应液B置于磁力搅拌器上，4°C下将反应液A缓慢滴加到反应液B中,搅拌反应过夜。次日将反应液置于经过预处理的透析袋内，在PBS中搅拌透析7天，得到偶联产物CL0P-2C-BSA，分装上清液，冻存于_20°C冰箱中，备用； A3、氯羟吡啶单克隆抗体和多克隆抗体的获得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50μ g/0. 2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NSO骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备CLOP mAb ； 多抗制备用CL0P-2C-BSA载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为50yg ，100 μ g/次，背部皮下分多点注射；首免，用合成的人工抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；力口强免疫，用合成的人工抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4 5次，每次间隔4 8周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20°C冻存备用。
全文摘要
本发明公开了一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。本发明的胶体金层析检测试纸条和试纸卡具有下列各项优点①特异性强，敏感性高。②简便、快速、时效性强。③结果显示形象、直观、准确。④节省费用，适用范围广，便于推广。
文档编号G01N33/543GK103018440SQ201210507849
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者张海棠, 范国英, 王自良, 姜金庆, 王淑云, 杨雪峰, 丁涵, 李艺 申请人:河南科技学院