一种适用于提取香蕉不同组织的基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA 的方法。
【背景技术】
[0002] DNA分子标记技术已广泛用于植物种质资源研宄。通过分子标记辅助育种可以大 大缩短育种周期，不受发育时期、组织器官和环境条件等因素影响。高效、快速制备高质量 的基因组DNA，并保证DNA的纯度和完整性，是进行分子标记和其他分子生物学试验的基 础。
[0003] 从植物组织中提取基因组DNA的常用方法有CTAB (十六烷基三乙基溴化铵）法和 SDS(十二烷基磺酸钠）法，以及基于这两种方法的改良法。这些方法适用于香蕉幼嫩组织 的基因组DNA提取，提取的DNA纯度能够满足一般分子生物学的需要，但对于富含多糖、多 酚的香蕉果实而言就需要通过分步离心，或加入醋酸钾和氯仿/异戊醇多次抽提，不仅提 取效果不能保证，而且操作步骤复杂，耗时长，易交叉污染。现有的实验操作中采用一种组 织对应一种方法的方式提取植物不同组织的基因组DNA，由于每种方法要配置的药品不同、 操作步骤各异，因此会增多实验步骤，加大工作量。
[0004] 鉴于上述情况，期望获得一种从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因 组DNA的方法，即，仅应用一种方法就可提取香蕉不同组织器官中的基因组DNA。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在解决上述问题。
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法。
[0007] 本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法包括如下步骤：步骤一：取 香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中；步骤二：在所述步骤一的所述香蕉 组织样品中加入提取缓冲液、10% SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；步骤三：在经所述步骤 二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴，然后离心分离；步骤四：取经所述步骤三所得的上清 至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分离，弃上清液；步骤五：取经所述步骤 四得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer或无菌水，再用适量 的RNase A消化，取出后于-20°C保存备用。
[0008] 进一步的，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为0. 5g ;所述步骤二中所述提 取缓冲液的用量为ImU所述10% SDS的用量为150 yL、所述氯化苄的用量为200 yL~ 800 μ L ;所述步骤三中加入所述乙酸钠的含量为450 μ L ;所述步骤四中的所述异丙醇的用 量为0· lmL。
[0009] 进一步的，所述氯化苄为600 μ L。
[0010] 进一步的，所述提取缓冲液包括pH 9.0的IOOmmol · Llris-HCl、pH 8.0的 40mmo1 · L <EDTA。
[0011] 进一步的，所述步骤二中水浴温度为65°C，水浴时间为45min。
[0012] 进一步的，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离 心参数为13000 Xg离心8min。
[0013] 进一步的，所述步骤四中设定的离心参数为13500Xg离心10min。
[0014] 进一步的，所述步骤五中所述75%的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA方法不 受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组 织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且收率高。
【附图说明】
[0016] 图1-1示出根据现有技术的CTAB常规法和CTAB改良法1提取香蕉各组织基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0017] 图1-2示出根据现有技术的CTAB改良法3和CTAB改良法2提取香蕉各组织基因 组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0018] 图1-3示出根据现有技术的SDS法和SDS结合蛋白酶K法提取香蕉各组织基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0019] 图1-4示出根据现有技术的改良尿素法和根据本发明的氯化苄法提取香蕉各组 织基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0020] 图2示出根据本发明的氯化苄法中不同浓度氯化苄提取香蕉各组织基因组DNA的 琼脂糖凝胶电泳结果；
[0021] 图3示出根据本发明的氯化苄法DNA的ITS扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技 术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的 技术效果。
[0023] 香蕉基因组DNA提取方法的比较实验
[0024] 在香蕉基因组DNA提取方法比较实验中，香蕉的叶、假茎、根和果实样品均采自国 内香蕉主栽品种'巴西蕉'（Musa Cavendish AAA)。此外，果实催熟后分别对果皮和果肉部 位进行采样。所有样品采集后迅速用95%的酒精清洗，分别置于-80°C超低温冰箱中保存 备用。
[0025] 取0. 5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分 别按下述方法提取基因组DNA。
[0026] (1)氯化苄法（即本发明的方法）
[0027] 步骤如下：
[0028] 实施例1 :
[0029]①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄200 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔IOmin 摇匀一次；
[0030] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0031] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混勾后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0032] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴Ih)，取出后于-20°C保存备用。
[0033] 实施例2 :
[0034] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄600 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔15min 摇勾一次；
[0035] ②加入450 yL乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0036] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL_20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0037] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0038] 实施例3 :
[0039] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄800 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔 10_15min 摇勾一次；
[0040] ②加入450 μ L乙酸钠冰浴15min，在设定的离心参数为13000 Xg的条件下离心 8min ；
[0041] ③取上清至一新离心管，加入0. lmL-20°C预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后在设定 的离心参数为13500 Xg的条件下离心10min，弃上清液；
[0042] ④取沉淀用75%的乙醇洗涤2次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA， 再用适量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存备用。
[0043] 实施例4 :
[0044] ①加入 ImL 提取缓冲液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化苄400 μ L，充分混匀后65°C水浴45min，期间每隔