0 μ L氯化苄的氯化苄法；C4 :800 μ L氯化 苄的氯化苄法。如图2中所示，在C4下，1泳道（果肉）中条带明显与其它泳道中的条带 跑得慢，而且条带模糊，这可能是该果肉基因组DNA中含有较多的蛋白质以及酚类；在CU C2与C3下，条带状况基本相似，但Cl与C2下，泳道2中条带非常淡，而C3中，各泳道的带 比较清晰、整齐。综上所示，C3(600 yL氯化苄的氯化苄法）最适于提取香蕉各组织中的基 因组DNA。
[0084] (2)吸光度检测
[0085] 利用核酸蛋白测定仪（Eppendorf BioPhotometer Plus)检测按上述各种方法提 取的香蕉基因组DNA样品的质量浓度（单位样品中提取出的基因组DNA的质量，单位：μ g/ mL)以及在波长260nm、280nm处的吸收值A260和A280,计算A260/A280用以判断DNA的纯 度。表1示出不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度（μ g/mL)。表2示出不同DNA提取 方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值。表3示出氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取 香蕉各组织DNA的质量浓度（μ g/mL)、A260/A280值。
[0086] 纯DNA的A260/A280比值为1 · 8，若A260/A280比值在1 · 7~1 · 9之间，则表明DNA 的纯度较高；若比值在1. 5及以下则表示DNA溶液中含50%以上的蛋白质，即，DNA受到蛋 白（芳香族）或酚类物质的污染。
[0087] 表1中明显可见氯化苄法^OOyL)无论在香蕉的叶、假茎与根中，还是在果皮以 及果肉中提取出的基因组DNA的质量浓度均高于其它方法中提取的基因组DNA。
[0088] 如表2中所示，仅CTAB改良法2与氯化苄法（600 μ L)能从香蕉各组织（叶、假茎、 根、果皮以及果肉）中提取出基因组DNA ;并且仅氯化苄法（600 μ L)的Α260/Α280比值均 在1. 7~1. 9之间，如上所述，上述方法中仅氯化苄法（600 μ L)能从香蕉各组织中提取出 纯度高的基因组DNA。
[0089] 如表3中所示，600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉叶、假茎、根中提取的基因组DNA 的质量浓度均高于其它浓度的氯化苄法，而且Α260/Α280比值均在1. 7~1. 9之间；虽然 600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉果肉中提取的基因组DNA的质量浓度低于800 μ L氯化苄 的氯化苄法，但是600 μ L氯化苄的氯化苄法的Α260/Α280比值高于800 μ L氯化苄的氯化 苄法的Α260/Α280比值，并且小于1. 8,另外，600 μ L氯化苄的氯化苄法在香蕉果皮、果肉中 提取的基因组DNA的质量浓度均明显高于200 μ L、400 μ L的氯化苄的氯化苄法中提取的基 因组DNA的质量浓度。
[0090] 综上所述，在综合考虑基因组DNA质量浓度与纯度的情况下，600 μ L氯化苄的氯 化苄法是提取香蕉不同组织的基因组DNA的最优方法。
[0091] 表1不同方法提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比
[0092]
[0093] 表2不同DNA提取方法提取香蕉各组织DNA的A260/A280值对比
[0094]
[0095] 表3氯化苄法中添加不同浓度氯化苄提取香蕉各组织DNA的质量浓度对比
[0096]
[0097] (3) PCR扩增检测
[0098] 分别从香蕉品种：Calcutta 4 ;巴西蕉（香牙蕉类）；Mbwazirume (东非高原香 蕉）；Mbi Egomel(Plantain);过山香；东莞大蕉（大蕉类）；广粉1号（粉蕉类）；贡蕉中 取样，然后将所有样品迅速用95%的酒精清洗，分别置于-80°C超低温冰箱中保存备用。
[0099] 取0. 5g上述各样品，加入适量液氮后研磨成粉末，迅速转至2mL离心管中，然后分 别按氯化苄法（添加600 μ L氯化苄）提取基因组DNA。
[0100] 以上述基因组DNA为模板，采用香蕉内转录间隔区通用引物ITS4/ITSL进行PCR 扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后EB染色，在紫外光下观察、拍照。
[0101] 在图3中，M :Maker(2000)的泳道；附图标记1、2、3、4、5、6、7以及8分别 表示香蕉品种Calcutta 4、巴西蕉（香牙蕉类）、Mbwazirume(东非高原香蕉）、Mbi Egomel (Plantain)、过山香、东莞大蕉（大蕉类）、广粉1号（粉蕉类）以及贡蕉的基因组 DNA的PCR产物的泳道。如图3中所示，电泳条带均清晰可见，为单一的700bp左右大小的 带，符合香蕉种质资源ITS特有片段，由此可见，由氯化苄法（添加600 μ L氯化苄）提取的 DNA符合PCR操作的需求。
[0102] 综上所述，采用氯化苄法可简便、快速地提取香蕉不同组织的基因组DNA，而且所 提取的基因组DNA完整性好、纯度高，适于PCR操作的需求；与提取基因组DNA的其它方法 相比，就提取香蕉果皮、果肉的基因组DNA而言，600 yL氯化苄的氯化苄法效果尤其凸显。
[0103] 本文虽然已经给出了本发明的具体实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在 不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不 应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
【主权项】
1. 一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一：取香蕉组织样品，加入液氮后研磨成粉末，转至离心管中； 步骤二：在所述步骤一中所得的所述香蕉组织样品中加入提取缓冲液、10%SDS与氯 化苄，充分混匀后水浴； 步骤三：在经所述步骤二得到的混合液中加入乙酸钠冰浴后离心分离； 步骤四：取经所述步骤三所得的上清液至离心管中，加入预冷的异丙醇，混匀后离心分 离，弃上清液； 步骤五：取经所述步骤四得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TEbuffer或无菌水，再用RNaseA消化后于-20°C保存备用。2.如权利要求1所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述步骤一中所述香蕉组织样品的用量为〇.5g ;所述步骤二中所述提取缓冲液的用量 为ImU所述10%SDS的用量为150yL、所述氯化苄的用量为200yL~800yL;所述步骤 三中加入所述乙酸钠的含量为450yL;所述步骤四中所述异丙醇的用量为0.lmL。3. 如权利要求2所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述氯化苄的用量为600yL。4. 如权利要求2所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法，其特征在 于，所述提取缓冲液包括pH9. 0 的IOOmmol? !/1Tris-HCl与pH8. 0 的 40mmol?LlDTA。5. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤二中水浴温度为65 °C，水浴时间为45min。6. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤三中所述乙酸钠冰浴所述混合液的时间为15min，且设定的离心 参数为13000Xg离心8min。7. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤四中设定的离心参数为13500Xg离心lOmin。8. 如权利要求2至4任一项所述的一种适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方 法，其特征在于，所述步骤五中所述75%的乙醇洗涤所述沉淀的次数为两次。
【专利摘要】本发明的适用于提取香蕉不同组织的基因组DNA的方法包括：取香蕉组织样品，加入液氮研磨成粉末，迅速转至离心管中；然后，加入提取缓冲液、10％SDS与氯化苄，充分混匀后水浴；接着，加入乙酸钠冰浴，然后离心；取经上一步骤所得的上清至一干净离心管，加入预冷的异丙醇，混匀后离心，弃上清液；取经上一步骤得到的沉淀用75％的乙醇洗涤，室温挥发乙醇，然后加入TE buffer，再用适量的RNase A消化，取出后于-20℃保存备用。上述方法不受取材限制，从香蕉不同组织器官中均能快速提取高质量的基因组DNA，而且从单位香蕉组织样品中提取的基因组DNA的纯度高并且量大。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104894104
【申请号】CN201510202596
【发明人】盛鸥, 邓贵明, 魏岳荣, 邝瑞彬, 李春雨, 易干军
【申请人】广东省农业科学院果树研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月23日