一种花生种子中优势表达启动子的克隆和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的 可在花生种子中优势表达启动子的克隆和应用。
【背景技术】
[0002] 种子在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。统计数据表明，人类粮食的 80%直接取自植物的种子，稻、麦等种子中富含淀粉，是人类赖以生存的主粮；大豆、花生、 油菜、芝麻等种子的含油量高，是食用油的主要来源。种子中储存物质的多少和组成成份， 直接影响作物的产量和品质。因此，提高粮食作物和油料作物产量、改善作物品质的根本在 于提高和改善其种子中储藏物质的积累量和组成。尽管常规育种技术所培育的优良作物品 种，为解决世界粮食安全问题、改善人民生活做出了重大贡献。然而，常规育种技术在继续 提高作物产量和品质方面的潜力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用转基因技术提高花生 等作物产量及种子的含油量具有巨大的应用价值。
[0003] 花生作为重要的油料作物，不仅在国内农业经济中具有重要地位，而且在世界贸 易中也具有举足轻重的作用。研宄表明，不同植物种子储藏油脂的含量存在很大差异如主 要油料作物油菜为28% -48%、大豆15% -22%、花生44% -54%、芝麻45% -57%，并且 其主要脂肪酸组成也不同，油菜油中含有大量的芥酸（31-55% )，其他含量较高的不饱和 脂肪酸为油酸14-19%、亚油酸12-24%和亚麻酸1-10% ;大豆油中含量最高的为亚油酸 52-65%和油酸25-36%，并且棕榈酸（6-8% )、硬脂酸（3-5% )和亚麻酸（2-3% )也占 有较大比例；花生种子脂肪酸组成主要是：棕榈酸、油酸和亚油酸，分别占总脂肪酸含量的 10%、36-67%和15-43%，是除橄榄油外单不饱和脂肪酸油酸含量最高的。研宄花生种子发 育和储藏物质积累相关基因的表达调控，阐明相关基因的功能，对于通过基因工程改良其 他作物具有一定指导意义。
[0004] 启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板 DNA准确的结合并起始基因特异性地转录。启动子决定着基因转录的方向、效率和时空特 性，是理解基因表达和转录调控机制的关键。按作用方式和功能，可将启动子分为组成型 启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。目前在植物基因工程研宄中，组成型启动子的 应用最为广泛，如花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、玉米的Ubiquitin启动子和水稻的 Actinl启动子等。这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中高效表达。然 而，许多具有时空表达特异性基因的过量表达往往造成能量浪费，有些外源基因的组成性 高表达还影响了植物的正常发育。为在确保植物正常生长的情况下，对目标性状进行更为 有效的定点、定时遗传改良，在植物基因功能鉴定研宄和基因工程遗传改良实践中更加倾 向于使用组织特异性或诱导型启动子。
[0005] 近年来，国内外多个实验室开展了花生种子发育和籽粒储藏物质积累相关基因启 动子的克隆与研宄，旨在充分了解基因的表达调控特征，为作物遗传改良提供依据。花生 籽粒中多个主要储藏蛋白一过敏原Arahl、2、3和6基因的启动子已被克隆和鉴定（Viquez 等，2003 ;2004 ;Zhong 等，2006 ;Bhattacharya 等，2012)，花生 Arah2 启动子驱动 GUS 在种 胚中特异表达，且强度高于35S启动子，而在种皮中基本无表达；花生Arah 6启动子驱动 ⑶S在子叶中表达，而在真叶中表达较弱。花生油体蛋白基因 Ah01eol7.8、Ah01eol8. 5启动 子（Li et al.，2009)和脂肪酸合成与油脂积累相关的基因如AhDGAT3(唐桂英等，2013)、 AhACP (单雷等，2014)启动子，也相继获得克隆与分析。调控种子发育的关键转录因子基 因 AhLEClA的启动子分析发现，其驱动的GUS基因在早期发育的种胚中特异表达，并且其特 异性表达受多个种子特异性调控元件和抑制其在营养组织中表达的负调控元件共同调节 (唐桂英等，2013)。
【发明内容】
[0006] 基于上述现有技术，本发明的发明人经过深入研宄，从花生中克隆获得了一个新 的1289bp花生AhLEClB基因的启动子，该启动子包括Y端非翻译区^ UTR)54bp和其 上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示；同时本发明为了进一步验证其 功能，还构建了 1281bp启动子（包括52bp 5' UTR和1229bp启动子区，其基因序列如Seq IDNo:2所示）以及：y端缺失351bp(缺失部分包括52bp5 ,UTR和 299bp启动子区）的 930bp(其基因序列如Seq ID No:3所示）的启动子驱动的⑶S报告基因植物表达载体，并 转化拟南芥。实验表明，该1281bp启动子驱动的GUS基因主要在转基因植株的种子中高效 表达，在根、茎、叶、花中有极低水平的表达；而：V端缺失351bp的930bp启动子仅驱动⑶S 基因在幼嫩的茎中表达，因此利用1281bp和1289bp的启动子在种胚中高效表达的特性，可 以应用在提高种子储藏物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载体，调控淀粉、油脂 或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。因此，该启动子的克隆对 植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
[0007] 该启动子是在已得到的花生AhLEClB基因的基因组序列（该基因其核苷酸序列如 Seq ID No:4所示）的基础上，通过染色体步移技术得到的1289bp AhLEClB基因 Y端上 游序列，其核苷酸序列如Seq ID No: 1所示。经转录起始位点分析发现，AhLEClB基因转录 起始位点位于翻译起始密码ATG上游-83nt处，通过PlantCARE和PLACE软件对该启动子 进行顺式调控元件分析，该序列除包含启动子中心元件TATA BOX，还包含光响应调控元件 GATA BOX(GATA)、GT1C0NSENSUS(GRWAAW)、S0RLIP1AT(GCCAC)以及莲座叶和根中高表达调 控元件RAVlA AT(CAACA)等；包含许多种子储藏蛋白和胚胎发育相关基因启动子中均含有 的 E BOX (CANNTG)、CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG)以及胚表达调控元件 DPBF CORE (ACACNNG)、 SEF4M0TIF(RTTTTTR)等；包含细胞分裂素、赤霉素、乙烯等植物激素响应调控元件CPB Sequence (TATTAG)、CARE element (CAACTC)、ERE Motif(AWTTCAAA)等；另外，还含有一些 负调控基因表达的元件 WRKY710S (TGAC)、SREATMSD (TTATCC)、HDZIP2ATATHB2 (TAATMATTA) 等。
[0008] 与已知的AhLEClA相比，本发明所针对的AhLEClB有着显著的不同之处，它们核 苷酸序列存在28个碱基的差异，编码蛋白有11个不同的氨基酸，氨基酸相似性达95%。 AhLEClA 和 AhLEClB 基因组 DNA 长度分别为 2279bp 和 2166bp。AhLEClA 和 AhLEClB 在根、 茎、叶、花和未成熟种子及种子发育过程中的表达特征均不同。而根据其获得的相应启动子 也有着明显的不同之处。
[0009] 为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以pCAMBIA3301为出发载体，分别以 Fl为正向引物、Rl和R2为反向引物，扩增相应的启动子片段，构建了含有AhLEClB基因 1281bp启动子片段和Y端缺失351bp (包括Y UTR和300bp启动子区）的930bp启动子 片段的⑶S基因植物表达载体，即用不同启动子片段取代pCAMBIA3301中驱动⑶S基因表 达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南 芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。
[0010] 本发明分别取转基因拟南芥的根、茎、叶、花和种胚，通过现有的方法检测GUS基 因的表达情况。本发明所提供的1281bp启动子区域中，包括5'端非翻译区52bp和其上 游启动子1229bp区段，其基因序列如Seq ID N〇:2所示，即可驱动⑶S基因在种胚中高 效表达，而在植物根、茎、叶、花器官中表达量极低；而缺失了:V端351bp的930bp启动子 区段由于缺失了核心区域的TATA BOX及其他重要的诱导型调控元件，故驱动功能基本丧 失。由此可见本发明克隆的花生AhLEClB基因的包括Y端非翻译区52bp和其上游启动子 1229bp区段具有在种子中高效表达的特性。
[0011] 通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的1281bp 5'端上游调控区包括非 翻译区52bp和其上游启动子1229bp区段，其基因序列Seq ID No: 2所示；以及包括Y端 非翻译区C UTR)54bp和其上游1235bp启动子区，其核苷酸序列如Seq ID No:l所示的 1289bp花生AhLEClB基因的启动子，两者具有在种胚中高效表达的特性。同时这种在种胚 中尚效表达的特性，可以应用在提尚种子储减物质含量中；构建该启动子和相关基因的表 达载体，调控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量。 因此，该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研宄也具有重要意义。
【附图说明】
[0012] 图1为扩增获得的花生AhLEClB基因1289bp