专利名称：一种用于基因治疗的细胞的构建方法及制得的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于基因治疗的细胞的构建方法，及使用该方法构建得到的细胞。
背景技术：
基因治疗是区别于传统药物治疗和手术治疗的一种新兴疾病疗法。主要是指利用基因工程的手段，改造遗传信息，从而起到改变疾病表形，治疗疾病的作用。自从上世纪第一例利用腺病毒载体进行的基因治疗以来，该项技术已经在全球生物医学领域得到广泛应用。虽然FDA尚未批准基因治疗，但临床前景仍很广阔。基因治疗的靶标主要是遗传性疾病，或称分子病，指的是患者的遗传信息发生改变。常见的分子病包括地中海贫血、重症肌无力等。现有的基因治疗主要策略是病毒疗法或是核酸疗法。具体来说，腺病毒应用最广。 腺病毒基因组大小适中，易于操作；同时腺病毒具有非基因组整合性，不会随宿主基因组复制而同步复制，同慢病毒或逆转录病毒相比大大提高了安全系数。细胞是病毒的天然宿主， 因此基因表达效率较常规转染手段高。核酸疗法主要是反义核酸和小分子siRNA药物。由于此类RNA分子小，易于给药，贮存方便，安全性高，已有部分通过FDA批注得以上市。现有的基因治疗方法，一般通过引入外源载体或核酸，在体内表达具有正常功能的蛋白，或使致病基因沉默，以实现基因治疗的目的。这些疗法或制剂都无法将含有致病基因的细胞修复为正常的细胞，实现真正意义上的基因治疗。由于无法将突变基因修改，也就无法实现正常的蛋白表达调控，现有的基因疗法也存在一定的风险。SiRNA虽然安全性更高，但是其应用范围有限，且需要长期用药，这也加重了客户的经济压力。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用于基因治疗的细胞的构建方法。本发明的另一个目的在于提供采用上述方法构建得到的细胞。本发明的再一个目的在于提供一种用于可用于地中海贫血治疗的细胞的构建方法。本发明所采取的技术方案是
一种用于基因治疗的细胞的构建方法，包括如下步骤
1)将载体中引入重组酶识别序列，在识别序列间插入正常基因序列，得到修复载体；
2)将正常基因序列与线性化酶切位点引入载体中，得到同源敲除载体；
3)将敲除载体线性化，加入同源正常基因序列特异性的锌指核酸酶，共转染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突变基因，筛选出至少一条同源突变基因被敲除的阳性iPSC细胞；
4)将修复载体、表达重组酶的载体共转入筛选得到的iPSC细胞，基于重组酶识别序列和重组酶，进行基因的置换修复，得到可用于基因治疗的阳性iPSC细胞。
优选的，修复载体中还连接有筛选基因。优选的，同源敲除载的正常基因序列和线性化酶切位点之间插入有重组酶识别序列，重组酶识别序列之间连接有筛选基因。优选的，筛选基因为抗生素抗性基因。优选的，筛选基因两侧设有重组酶识别序列。优选的，修复载体由两种不同的修复载体组成，两种修复载体的区别在于其筛选基因不同。优选的，敲除载体由两种不同的敲除载体组成，两种敲除载体的区别在于其筛选基因不同。一种可用于β -地中海贫血治疗的细胞的构建方法,包括如下步骤
1)将第一组重组酶识别序列插入到载体中，在两个识别序列之间插入正常β-地中海贫血珠蛋白基因，在识别序列和正常β-地中海贫血珠蛋白基因之间插入第二组重组酶识别序列，第二组重组酶序列中插入有抗性筛选基因，该得到修复载体对，修复载体之间的区别仅在于其抗性筛选基因不同；
2)将线性化酶、地中海贫血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到载体中，在5’臂和 3’臂之间插入第一组重组酶识别序列，第一组重组酶识别序列之间插入有第二组重组酶识别序列，第二组重组酶识别序列之间插入有筛选基因，第一组和第二组重组酶识别序列之间还插入有荧光蛋白序列，得到2个同源敲除载体，2个同源敲除载体之间的区别仅在于其筛选基因不同；
3)将同源敲除载体线性化，加入β_地中海贫血珠蛋白基因序列特异的锌脂核酸酶， 共同转入地中海贫血患者的iPSC，加入筛选因子筛选出致病的β-地中海贫血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到阳性iPSC ；
4)将修复载体、表达第一组重组酶的载体共转入筛选得到的阳性iPSC中，进行重组修复，筛选出阳性克隆细胞株，该细胞株经扩增、诱导分化即可得到用于治疗β_地中海贫血的造血干细胞。优选的，筛选出阳性克隆细胞株之后，敲除其中的筛选基因。本发明的有益效果是
本发明方法可以快速，简便的得到大量的可用于基因治疗的iPSC，不同的带有致病基因的iPSC细胞可以采用基本相同的方法构建得到，有效地避免了针对特定疾病设计特定构建方法，大大减少了可用于基因治疗的细胞的难度。使用本发明的方法，可以在体外同时进行多位点基因突变的修复，如多位点的点突变，缺失突变等，可以快速、有效的修复患者的带病干细胞，将修复后的细胞经诱导为单能干细胞之后，回输至患者可以有效的地治疗相应的基因相关疾病，克服了现有技术操作复杂，修复效率低等缺陷。将其诱导为相应的单能干细胞之后，再注入到人体内，可以完成基因治疗。可有效地减轻患者的负担。由于使用的是患者自身的iPSC细胞，在进行基因治疗的同时，避免了使用异种细胞或载体可能对人体造成的危害。修复后的细胞受到与正常细胞相同的调控， 避免了基因过量表达或表达不足的缺陷。
图I :1号打靶删除载体示意图2:2号打靶删除载体示意图3:1号修复载体示意图4:2号修复载体示意图5:3号修复载体示意图6 :4号修复载体不意图。
具体实施例方式一种用于基因治疗的细胞的构建方法，包括如下步骤
1)将载体中引入重组酶识别序列，在识别序列间插入正常基因序列，得到修复载体；
2)将正常基因序列与线性化酶切位点引入载体中，得到同源敲除载体；
3)将敲除载体线性化，加入同源正常基因序列特异性的锌指核酸酶，共转染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突变基因，筛选出至少一条同源突变基因被敲除的阳性iPSC细胞；
4)将修复载体、表达重组酶的载体共转入筛选得到的iPSC细胞，基于重组酶识别序列和重组酶，进行基因的置换修复，得到可用于基因治疗的阳性iPSC细胞。优选的，修复载体中还连接有筛选基因。优选的，同源敲除载的正常基因序列和线性化酶切位点之间插入有重组酶识别序列，重组酶识别序列之间连接有筛选基因。通过插入筛选基因，可以方便地通过设置筛选条件，筛选出所需要的阳性细胞，大大简化了筛选的难度。优选的，筛选基因为抗生素抗性基因，这样就可以简单通过在培养基中添加相应的抗生素来筛选出所需要的细胞。优选的，筛选基因两侧设有重组酶识别序列。这样可以简单通过加入重组酶或表达重组酶的载体，对重组酶识别序列之间的筛选基因进行替换，大大降低了修复载体、敲除载体构建时的工作量，有利于快速、简便地替换不同的筛选基因。优选的，修复载体由两种不同的修复载体组成，两种修复载体的区别在于其筛选基因不同。优选的，修复载体和/或同源敲除载体中还插入有荧光蛋白基因，这样可以简单通过荧光检测，判断所需要的核酸序列是否已经表达，进而筛选出所需要的细胞，或者选择出修复后可更好表达的细胞。优选的，敲除载体由两种不同的敲除载体组成，两种敲除载体的区别在于其筛选基因不同。通过使用不同的筛选基因，同时添加多种筛选条件，可以方便的得到同源基因都被删除或修复的细胞。为避免将筛选基因，特别是抗生素抗性基因引入患者体内造成潜在的危害，将最终得到的阳性iPSC细胞中的筛选基因敲除。一种可用于β -地中海贫血治疗的细胞的构建方法,包括如下步骤
I)将第一组重组酶识别序列插入到载体中，在两个识别序列之间插入正常β-地中海贫血珠蛋白基因，在识别序列和正常地中海贫血珠蛋白基因之间插入第二组重组酶识别序列，第二组重组酶序列中插入有抗性筛选基因，该得到修复载体对，修复载体之间的区别仅在于其抗性筛选基因不同；
2)将线性化酶、地中海贫血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到载体中，在5’臂和 3’臂之间插入第一组重组酶识别序列，第一组重组酶识别序列之间插入有第二组重组酶识别序列，第二组重组酶识别序列之间插入有筛选基因，第一组和第二组重组酶识别序列之间还插入有荧光蛋白序列，得到2个同源敲除载体，2个同源敲除载体之间的区别仅在于其筛选基因不同；
3)将同源敲除载体线性化，加入β_地中海贫血珠蛋白基因序列特异的锌脂核酸酶， 共同转入地中海贫血患者的iPSC，加入筛选因子筛选出致病的β-地中海贫血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到阳性iPSC ；
4)将修复载体、表达第一组重组酶的载体共转入筛选得到的阳性iPSC中，进行重组修复，筛选出阳性克隆细胞株，该细胞株经扩增、诱导分化即可得到用于治疗β_地中海贫血的造血干细胞。优选的，筛选出阳性克隆细胞株之后，敲除其中的筛选基因。下面结合实施例，进一步说明本发明。可用于β -地中海贫血治疗的细胞的构建
同源敲除载体的构建
(I)以pDREVO为模版，通过PCR方法直接将Loxp2272和Loxp511加至删除载体单元 Venus-Rox_Puro+-Rox 两侧，并加入 Sfil 形成 SfilA -Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Lo xp511- SfilB 的结构，并连入 p-simple-18T Vector，形成 18T_SfilA -Loxp2272_Venus-R ox-Puro+-Rox-Loxp511- SfilB0PCR 引物，Forward : 5，- GGCCATTACGGCCATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTA T-3’ (SEQ ID NO 1)
RE: 5’ - GGCCGCCCTGGCCATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTATGGCGCGCCTAAC-3’ (SEQ ID NO 2)
①PCR体系
Kod plus PCR (Kod及其反应试剂是东洋坊公司产品)。Kod buffer5 μ I MgCl2 (2mM) 2μ I
dNTP (2mM)5 μ I
For primer2 μ I
Re primer2 μ I
Kod 酶2 μ I
H2O31 μ I
模版I μ I
Total50 μ I
95°C 2min, 94°C 30 sec, 68°C 5min, 30cycle。②尾端加T体系(Premix Extaq及其反应试剂是Takara公司产品)Premix Extaq:
Kod PCR products Total
25 μ 25 μ ] 50 μ ]
95 °C 5min, 72 °C 20min.
③p-simple_18T连接体系(p-simple_18T及其反应试剂是Takara公司产品)利用PB-SalI-CAG-Bgl II -SfilA- CM- SfilB-Mlul-EcoRl 载体 5’的 Sall-Bgl II, 3’ Mlul-EcoRl，分别将β -globin基因编码区起始位点ATG上游的986_bp同源臂，终止位点TAA下游898-bp的同源臂装入Sall-Bgl II区域和Mlul-EcoRl，同时在5，引入Nhel和 Asisl，形成 PB-Sall-Nhel-Asisl-5’Arm -Bgl II -SfilA- CM- SfiIB-Mlu 1-3JArm-EcoRl (I)酶切体系(内切酶及其反应试剂是Takara公司产品)
EcoRl/Sall2μ I
Bgl II /Mlul2μ I
H buffer5 μ I
PCR片段/载体20 μ I
H2O21 μ I
37°C,4h0(2)片段连接体系(连接反应试剂是Takara公司产品)
PCR片段4 μ I
载体I μ I
Solutionl5 μ I(3)利用 Sfi 1Α、SfilB 酶位点，将(I)中 Loxp2272-Venus-Rox_Puro+-R ox_Loxp511 克隆至中间载体 PB-Sall-Nhel-Asisl-5’ Arm -Bgl II -SfilA- CM-SfilB-Mlul-3，Arm-EcoRl 载体，形成 PB-Sall-Nhel-Asisl-5，Arm -Bgl II -SfilA- Loxp2 272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511- SfilB-Mlul-3’ Arm-EcoRl。①酶切体系(内切酶及其反应试剂是Takara公司产品)
Sfil5μ I
H buffer5 μ I
片段/载体20μ1
H2O20 μ I
56°C,8h.
②片段连接体系(连接反应试剂是Takara公司产品)
片段4μ1
载体I μ I
P-simple_18T Solution I
加T产物
Total
16°C,2h0
4μ I 10 μ I
16 °C, 2h。
7Solutionl5 u 1
16。。，2h。(4)将(3)最后形成的载体Nhel-EcoRl酶切，连入pl253/Spel_EcoRl,最终形 成 @ -globin 基因编码区的删除载体Asisl_5’Arm-Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox_Lox p511 -3 ’ Arm-PGK-dTK ;利用该删除载体Puro+两侧的Rox序列和BAD-Dre工程菌，将Puro+ 换成Neo+，形成2个删除载体。最终
1号Asisl_986bp_ 5，Arm - SfilA-Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511-SfilB -3，Arm-PGK-dTK (图 1);
2号Asisl_986bp-5，Arm - SfilA -Loxp2272-Venus-Rox-Neo+-Rox-Loxp511-SfiIB -3’ Arm-PGK-dTK (图 2);
①酶切体系(内切酶及其反应试剂是Takara公司产品) Nhel/Spel2u 1
EcoRl2 u 1
H buffer5 u 1
片段/载体20iU
H2021 ill
37°C,4h.
②片段连接体系(连接反应试剂是Takara公司产品)
片段4iU
载体1 U 1
Solutionl5 u 1
16。。，2h。③BAD-Dre转化体系
先将含有BAD-Dre工程菌制备成感受态细胞，之后将pl253-Asisl_5’ Arm-Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511 -3，Arm-PGK-dTK 载体转入该工程菌，32°C加入 100 u g/ ml阿拉伯糖诱导Dre的表达2小时，之后收菌并以冰水反复洗涤，以制备成电转感受态，将 Rox-Neo-Rox片断电转感受态,37°C在A+、K+抗性图板即可。修复载体的构建
(5)利用(1)18T -Loxp2272-Venus-Rox-Puro+-Rox-Loxp511 中 Venus 读码 框两侧的Pacl-Rsr II ,将正确的P -globin的基因(含intron)以及P -globin cDNA 插入 Pacl-Rsr II 区域，同时替换掉 Venus 基因，形成 18T- Loxp2272_hBB cDNA (gene) -Rox-Puro+-Rox_Loxp511。之后利用该载体Puro+两侧的Rox序列和BAD-Dre工程 菌，将Puro+换成Zeocin+和Hygro+,最终形成0 -globin正确基因的4个修复载体
1号18T- SfilA -Loxp2272-hBB cDNA-Rox-Zeocin+-Rox-Loxp511-SfiIB (图 3)；
2号18T- SfilA -Loxp2272-hBB cDNA-Rox-Hygro+-Rox-Loxp511-SfiIB (图 4);
3号18T_ SfilA _Loxp2272_hBB gene (intron)-Rox- Zeocin+-Rox-Loxp511-SfilB (图 5)。4 号18T_ SfilA -Loxp2272_hBB gene (intron) -Rox-Hygro+-Rox-Loxp511-SfiIB (图 6)。
PCR 引物:
hbbF3: 5’ - CGCCGGACCGCCACCATGGTGCATCTGACTCCTG-3’(SEQ ID NO :3) hbbR3: 5’-ACGTTAATTAACTTAGTGATACTTGTGGGCCAG-3’ (SEQ ID NO :4)
①PCR体系
Premix Extaq25 μ I
For primer2 μ I
Re primer2 μ I
模版I μ I
H2020 μ I
Total50 μ I
95°C 5min, 94°C 40 sec, 55°C 40 sec, 72°C I. 5min, 30cycle.
②酶切体系(内切酶及其反应试剂是NEB公司产品)
Pacl2 μ I
Rsr II2 μ I
I buffer5 μ I
片段/载体20μ1
Η2021 μ I
37°C,6h.
③连接体系同上。 ④BAD-Dre转化体系，同上。(6)将修复载体I号、2号、3号、4号用Sfil连入PB-CAG-SfilA-CM-SfilB中，利用该载体上的CAGG promoter,检测4个修复载体的β -globin表达状况。将以上几个载体顺转HEK293细胞，24小时后收集细胞蛋白进行β-globin蛋白的 western Blot分析,结果表明其可以表达出蛋白。(7)将(4)中形成I号和2号突变基因删除载体用Asisl线性化，同时加入表达β-globin序列特异的锌脂核酸酶，共同电转β-地中海贫血患者的iPSC，之后在 Puromycin, Neomycin和gancyclovir培养基中进行正向和负向的筛选。①系线性化体系(内切酶及其反应试剂是NEB公司产品)
Asisl4 μ I
4 buffer5 μ I
载体20 μ I
H2O21 μ I
37°C,6h.
②电转及筛选体系
线性化打靶DNA量30 μ g，锌指核酸酶表达载体30 μ g0电转仪型号Bio-Rad Gene Pulser(Cat. No. 165-2105);电穿孔条件电压 240 v，电容 500 μ F，通电时间 8-9. 5ms。 克隆筛选条件300 μ g/ml G418、I μ g/ml puromycin 和 2 μ M GanC 筛选 8 天
(8)将(7)筛选出的iPSC克隆进行PCR及测序的鉴定，寻找两个同源染色体突变的 β-globin都被删除的克隆株，在此基础上将两个不同抗性的修复载体同时电转入阳性iPSC克隆株，同时转入表达Cre的重组质粒PB-CAG-Cre进行Loxp2272和Loxp511的识别和置换修复。Zeocin+和Hygro+抗性筛选,Puromycin+和Neomycin+的负筛选,选择阳性克隆细胞株。电转及筛选体系线性化打靶DNA量30 μ g，Cre表达质粒30 μ g。电转仪型号 Bio-Rad Gene Pulser (Cat. No. 165-2105);电穿孔条件电压 240 v，电容 500 μ F，通电时间 8-9. 5msο 克隆筛选条件2 μ g/ml Zeocin+、2 μ g/ml Hygro+ 筛选。(9)利用PCR及测序，鉴定所筛到的克隆是否为正确修复后的iPS克隆，并将修复正确的iPS诱导分化至造血干细胞。经实验验证，分化所得血细胞的功能获得纠正。
权利要求
1.一种用于基因治疗的细胞的构建方法，包括如下步骤1)将载体中引入重组酶识别序列，在识别序列间插入正常基因序列，得到修复载体；2)将正常基因序列与线性化酶切位点引入载体中，得到同源敲除载体；3)将敲除载体线性化，加入同源正常基因序列特异性的锌指核酸酶，共转染致病基因的iPSC，敲除iPSC中的突变基因，筛选出至少一条同源突变基因被敲除的阳性iPSC细胞;4)将修复载体、表达重组酶的载体共转入筛选得到的iPSC细胞，基于重组酶识别序列和重组酶，进行基因的置换修复，得到可用于基因治疗的阳性iPSC细胞。
2.根据权利要求I所述的一种用于基因治疗的细胞的构建方法，其特征在于修复载体中还连接有筛选基因。
3.根据权利要求I所述的一种用于基因治疗的细胞的构建方法，其特征在于同源敲除载的正常基因序列和线性化酶切位点之间插入有重组酶识别序列，重组酶识别序列之间连接有筛选基因。
4.根据权利要求2或3所述的一种用于基因治疗的细胞的构建方法，其特征在于筛选基因为抗生素抗性基因。
5.根据权利要求2或3所述的一种用于基因治疗的细胞的构建方法，其特征在于筛选基因两侧设有重组酶识别序列。
6.根据权利要求2或4所述的一种用于基因治疗的细胞的构建方法，其特征在于修复载体由两种不同的修复载体组成，两种修复载体的区别在于其筛选基因不同。
7.根据权利要求3或4所述的一种用于基因治疗的细胞的构建方法，其特征在于敲除载体由两种不同的敲除载体组成，两种敲除载体的区别在于其筛选基因不同。
8.采用上述任意一项权利要求所述方法构建得到的细胞。
9.一种可用于地中海贫血治疗的细胞的构建方法，包括如下步骤1)将第一组重组酶识别序列插入到载体中，在两个识别序列之间插入正常β-地中海贫血珠蛋白基因，在识别序列和正常地中海贫血珠蛋白基因之间插入第二组重组酶识别序列，第二组重组酶序列中插入有抗性筛选基因，该得到修复载体对，修复载体之间的区别仅在于其抗性筛选基因不同；2)将线性化酶、β-地中海贫血珠蛋白基因的5’臂和3’臂插入到载体中，在5’臂和 3’臂之间插入第一组重组酶识别序列，第一组重组酶识别序列之间插入有第二组重组酶识别序列，第二组重组酶识别序列之间插入有筛选基因，第一组和第二组重组酶识别序列之间还插入有荧光蛋白序列，得到2个同源敲除载体，2个同源敲除载体之间的区别仅在于其筛选基因不同；3)将同源敲除载体线性化，加入β_地中海贫血珠蛋白基因序列特异的锌脂核酸酶， 共同转入地中海贫血患者的iPSC，加入筛选因子筛选出致病的β-地中海贫血珠蛋白基因全部被敲除的iPSC，得到阳性iPSC ；4)将修复载体、表达第一组重组酶的载体共转入筛选得到的阳性iPSC中，进行重组修复，筛选出阳性克隆细胞株，该细胞株经扩增、诱导分化即可得到用于治疗β_地中海贫血的造血干细胞。
10.根据权利要求9所述的一种可用于β-地中海贫血治疗的细胞的构建方法，其特征在于筛选出阳性克隆细胞株之后，敲除其中的筛选基因。
全文摘要
本发明公开了可用于基因治疗的细胞的构建方法，通过构建带有正常基因的修复载体、同源敲除载体，使用敲除载体敲除患者iPSC的致病基因，之后使用修复载体对iPSC进行重组修复，得到用于基因治疗的iPSC细胞。该方法可以快速，大量的修复细胞中的多类型和多个基因突变。
文档编号A61K48/00GK102586324SQ20121001393
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者吴东海 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院