专利名称：用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医用配置品，具体涉及用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂及其制备方法。
背景技术：
器官移植后必需应用免疫抑制剂防止急性排斥反应的发生，免疫抑制剂通过抑制 T细胞和B细胞等靶细胞的细胞增殖、细胞因子合成而起作用。但是目前仍然无法区分移植抗原引起的免疫排斥反应和病毒细菌感染引起的免疫反应。理想的免疫抑制治疗应该在免疫抑制和保持免疫力间取得平衡，因此对于临床医生来说移植患者管理是一件很困难的事。保存受体免疫力，尽可能减小免疫抑制剂用量或诱导免疫耐受一直是移植免疫学家的主要目标，因此移植后免疫监测至关重要。目前临床常用受体免疫状态的监测的方式仍然是临床症状评估结合移植物活检。 但是，活组织病理检查对移植物和宿主均是一种损伤性检查，不能重复进行，不能完全反应移植器官的免疫状态，而且当病理检查已出现排斥反应时，移植排斥已经发生，因此病理检查有其固有的局限性。除了病理检查，常用的免疫监测方法有外周血T细胞计数、杀伤细胞CTL和NK细胞活性测定、MHC分子检测、细胞因子测定、Perforin、颗粒酶B、⑶40L和FasL的测定、循环抗体检测等。由于免疫反应的复杂性，上述免疫学检测方法的均有其局限性，依靠单一免疫指标来评估机体的免疫状态不太现实，临床上衡量器官移植后排斥反应及免疫抑制治疗的效能主要通过排斥反应的发生情况(病理活检)和移植物功能情况，如肾移植时肝肾毒性的发生情况，肝移植时肝功能情况(血Cr、ALT等)来进行评估。病理诊断目前仍然是诊断排斥反应的金标准，但是移植物活组织病理检查也有其局限性一、活检组织检测是一种损伤性检查方法，对移植物的正常存活有一定的影响，不能反复采取样本，另外，采取样本过少又会影响病理切片读片的正确性；二、活检组织病理学检查是非定量性指标，影响其临床诊断的准确性，病理学检查容易受读片者的主观因素及技术水平的影响，产生偏倚，缺乏客观性； 三、病理切片检查无法对浸润性淋巴细胞做功能性评判，不利于排斥反应的早期诊断.在排斥反应发生的早期或移植物失功能的受者，甚至临床上表现为稳定型的受者，病理活检切片都可看到大量T淋巴细胞浸润，或仅表现为斑点性T细胞浸润。
发明内容
本发明的目的在于提供用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂及其制备方法。本发明所采取的技术方案为
用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，该试剂是经CFSE染色的两种同品系的兔脾细胞的PBS悬液，两种兔脾细胞的总浓度为(5 7) X IO7个/mL，二者的比例为I :1， 其中，两种兔脾细胞分别来自经过异体皮肤移植后的供体和受体，染色后的阳性细胞比例≥95%，活细胞比例≥彡95%。优选的，供体为雌性兔子。优选的，受体为雄性兔子。上述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，包括如下步骤
1)取同品系的雌性兔子和雄性兔子分别为供体和受体，进行异体皮肤移植；
2)异体皮肤移植后第10 13天切除供体和受体的脾脏，分别制成供体脾细胞的PBS 悬液和受体脾细胞的PBS悬液；
3)往供体脾细胞的PBS悬液中加入6μM CFSE，往受体脾细胞的PBS悬液中加入
O.24 μ M CFSE，然后在温度为37°C下孵育染色；
4)染色后，将供体脾细胞和受体脾细胞用PBS洗涤后，按细胞数I: I的比例混合，用 PBS调整细胞总浓度为(5 7) X IO7个/mL，得用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂。优选的,雌性兔子为雌性大白兔。优选的，雄性兔子为雄性大白兔。优选的，孵育染色时间为15 20 min。本发明中所述的CFSE为羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯。本发明所述的细胞来源于经过异体皮肤移植后的供体和受体的脾细胞，供体细胞与移植物同基因，抗原性与移植物完全相同，能被因移植产生的免疫反应特异性杀伤，全面、准确地反映移植物所受的免疫攻击；受体细胞与进行皮肤移植的兔同基因，作为免疫状态监测的内参，用于消除由于细胞破碎、死亡、归巢等一系列细胞在体外染色处理及体内自然死亡等非特异生损失带来的误差。本发明所述的细胞取自兔异体皮肤移植后第10 13天的供体和受体细胞，皮肤移植后体内的免疫环境会发生复杂的变化，而异体皮肤移植后第10 13天会出现排斥反应，取此阶段的细胞用于监测兔子皮肤移植后免疫状态，更真实，更准备。本发明用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的监测方法，包括如下步骤
1)将本发明的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂通过耳缘静脉注射到皮肤移植后的兔子体内，注射到皮肤移植的兔子体内的试剂含有细胞总数为(I 1.4) XlO9个；
2)注射后第8h，将兔子进行耳缘静脉取血，血液进行流式细胞检测，得出外周血两种阳性细胞比率；
3)计算杀伤率，根据杀伤率判断兔子皮肤移植后的免疫状态，若注射后第8h，杀伤率 ^ 80%，就可以判断为受体兔对移植物处于免疫排斥状态。本发明所述兔的免疫状态指受体对移植物的排斥程度，即试剂中的异体(供体) 脾脏细胞被受体排斥的程度。本发明的监测方法，杀伤率越高，则移植排斥越强，本发明的监测方法的判断原则为用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂注射后第8h，杀伤率 ^ 80%，就可以判断为受体兔对移植物处于免疫排斥状态。本发明的有益效果是
本发明用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，能快速、直观、准确的监测移植手术后兔的免疫状态。本发明的试剂直接注射于皮肤移植后的兔子体内，不需要模拟体内复杂环境，通过测试细胞的特异性损失来反映免疫状态，监测结果更全面、准确，首次在大动物中证明了本发明试剂能有效地检测兔子皮肤移植后免疫状态。
图I为本发明试剂用于动物实验的技术流程图2为动物实验中各分组的杀伤率曲线图。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。实施例所用的供体选为雌性新西兰大白兔，受体选为雄性新西兰大白兔，用于免疫状态监测的兔子为雄性新西兰大白兔，体重均为I. 9 2. 5kg，许可证号SCXK(粤)一 0015。CFSE 试剂购自美国 Molecularprobes 公司。实施例I
用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，该试剂是经CFSE染色的两种兔脾细胞的 PBS悬液，两种兔脾细胞的总浓度为6X IO7个/mL，二者的比例为I :1，其中，两种兔脾细胞分别来自经过异体皮肤移植后的供体和受体，染色后在荧光显微镜下观察，阳性细胞比例为95%，并用锥虫蓝溶液检测细胞活性，活细胞比例为96%。上述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，包括如下步骤
1)按照随机配对的原则，取雌性大白兔和雄性大白兔分别为供体和受体，进行异体皮肤移植；
2)异体皮肤移植后第12天，手术切除供体(雌性大白兔)和受体(雄性大白兔)的脾脏， 脾脏切除后逐层缝合关闭腹腔，予纱布覆盖，术后予输液及青霉素8万单位/kg治疗；
3)脾脏切除后立即用200目不锈钢网研磨法制备脾细胞悬液，7.5 g/L氯化铵裂解红细胞，O. 01mol/L PBS稀释分别制备供体和受体单个脾细胞悬液；
4)受体脾细胞悬液用O.24 μ M CFSE染色，供体脾细胞用6 μ M高浓度CFSE染色，染色孵育温度为37°C，时间15 min ；
5)染色后，将供体脾细胞和受体脾细胞用PBS洗涤一次，然后按细胞数I: I的比例混合两种细胞，并用PBS调整细胞总浓度为6X IO7个/mL，得混合脾细胞悬液，即本发明免疫状态监测的试剂。实施例2
用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，该试剂是经CFSE染色的两种兔脾细胞的 PBS悬液，两种兔脾细胞的总浓度为5X IO7个/mL，二者的比例为I :1，其中，两种兔脾细胞分别来自经过异体皮肤移植后的供体和受体，染色后在荧光显微镜下观察，阳性细胞比例为97%，并用锥虫蓝溶液检测细胞活性，活细胞比例为95%。上述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，包括如下步骤
1)按照随机配对的原则，取雌性大白兔和雄性大白兔分别为供体和受体，进行异体皮肤移植；
2)异体皮肤移植后第10天，手术切除供体(雌性大白兔)和受体(雄性大白兔)的脾脏， 脾脏切除后逐层缝合关闭腹腔，予纱布覆盖，术后予输液及青霉素8万单位/kg治疗；
3)脾脏切除后立即用200目不锈钢网研磨法制备脾细胞悬液，7.5 g/L氯化铵裂解红细胞，O. 01mol/L PBS稀释分别制备供体和受体单个脾细胞悬液；
4)受体脾细胞悬液用O.24 μ M CFSE染色，供体脾细胞用6 μ M高浓度CFSE染色，染色孵育温度为37 °C，时间18 min ；
5)染色后，将供体脾细胞和受体脾细胞用PBS洗涤一次，然后按细胞数I: I的比例混合两种染色后的细胞，并用PBS调整细胞总浓度为5 X IO7个/mL，得混合脾细胞悬液，即本发明免疫状态监测的试剂。实施例3
用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，该试剂是经CFSE染色的两种兔脾细胞的 PBS悬液，两种兔脾细胞的总浓度为7X IO7个/mL，二者的比例为I :1，其中，两种兔脾细胞分别来自经过异体皮肤移植后的供体和受体，染色后在荧光显微镜下观察，阳性细胞比例为96%，并用锥虫蓝溶液检测细胞活性，活细胞比例为97%。上述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，包括如下步骤
1)按照随机配对的原则，取雌性大白兔和雄性大白兔分别为供体和受体，进行异体皮肤移植；
2)异体皮肤移植后第13天，手术切除供体(雌性大白兔)和受体的脾脏，脾脏切除后逐层缝合关闭腹腔，予纱布覆盖，术后予输液及青霉素8万单位/kg治疗；
3)脾脏切除后立即用200目不锈钢网研磨法制备脾细胞悬液，7.5 g/L氯化铵裂解红细胞，O. 01mol/L PBS稀释分别制备供体和受体单个脾细胞悬液；
4)受体脾细胞悬液用O.24 μ M CFSE染色，供体脾细胞用6 μ M高浓度CFSE染色，染色孵育温度为37°C，时间20 min ；
5)染色后，将供体脾细胞和受体脾细胞用PBS洗涤一次，然后按细胞数I: I的比例混合两种染色后的细胞，并用PBS调整细胞总浓度为7 X IO7个/mL，得混合脾细胞悬液，即本发明免疫状态监测的试剂。上述异体皮肤移植的方法如下取约3X3cm大小供体新西兰大白兔背部皮肤，用眼科剪将皮下组织修剪干净，并将受体大白兔背部用手术刀切除一块同样大小的皮肤，保留皮下组织，然后将供体皮片用5-0无创缝合线固定在受体小鼠背部，用纱布包扎伤口，胶布固定，松紧适度，并将供体伤口消毒并包扎。下面通过动物实验证明本发明所述的试剂能有效地检测兔子皮肤移植后免疫状态，本实验的技术流程图参见图I。I.实验动物
选择雌性新西兰大白兔，L 9 2. 5kg，作为供体(许可证号SCXK (粤)一 0015);选择雄性新西兰大白兔，L 9 2. 5kg，作为受体(许可证号SCXK (粤)一 0015);上述动物及制备本发明试剂所用的动物均购自南方医科大学实验动物中心，所有的动物都受到了实验动物所应有的待遇，而且实验程序经过了当地动物保护与研究机构的批准。2.实验分组
实验共分为5组(n=5)，A组异体移植排斥组出组自体皮肤移植组；(组未移植组； D组异体移植免疫抑制剂低剂量组；E组异体移植免疫抑制剂高剂量组。3.皮肤移植模型的建立
根据分组需要建立两组皮肤移植模型，以雌性新西兰大白兔为供体，雄性新西兰大白兔为受体建立异体皮肤移植模型；以雄性新西兰大白兔建立自体皮肤移植模型。A、B、C三组为异体皮肤移植模型，E组为自体皮肤移植模型，D组相当于空白对照组，该组均为雄性新西兰大白兔。异体皮肤移植模型的构建参见上述的异体皮肤移植方法；自体皮肤移植模型的构建与上述的异体皮肤移植方法基本相同，区别在于供体和受体都为同一雄性大白兔。D组(异体移植免疫抑制剂低剂量组)受体给予2mg/kg环孢素A (CsA)，静脉注射，受体在移植前8小时用一次，以后每日一次；
E组(异体移植免疫抑制剂高剂量组):受体给予15mg/kg环孢素A (CsA)，静脉注射，受体在移植前8小时用一次，以后每日一次。4.采用实施例I的免疫状态监测试剂输注
1)将各组的雄性大白兔(受体)固定；
2)将大白兔的耳缘用体积分数为75%的乙醇消毒；
3)用4号头皮针穿刺耳缘静脉成功后注射实施例I的免疫状态监测试剂，用量20mL/ 只，每只雄性大白兔注射的混合脾细胞数为I. 2X109个。5.标本采集及流式
每组皮肤移殖后的雄性大白兔，在本发明免疫状态监测试剂输注后第lh、2h、4h、8h，经耳缘静脉取血进行流式监测外周血两种阳性细胞比率，即供体脾细胞数/受体供体脾细胞数。每次约200 μ L，用红细胞裂解液(BD公司，美国)在室温下裂解红细胞，经PBS洗涤3 次后流式细胞仪(BD公司，美国)检测，选定淋巴细胞分析为分析对象，每份标本测定约IO5 个细胞。6.计算杀伤率
试剂注射到兔子体内后，由于供体细胞MHC表型的不同而受到受体的排斥，我们把注射试剂的供体细胞(异基因)被排斥的程度叫做杀伤率，按以下公式进行计算
杀伤率(R) =1 一供体脾细胞数/受体脾细胞数X 100%。7.统计学分析
实验数据用SPSS 13. O软件进行统计学分析处理，数据结果以均数和标准差表示(土SD),每个时间点各组间比较统计方法采用单向方差(F)分析。组间用Dunnett t (2-sided)法检验与A组(异体移植排斥组)比较。P〈0. 05被认为有统计学意义，制作杀伤率曲线图。各组实验的杀伤率结果见表1，杀伤率曲线图见图2。判断标准注射试剂后第 8h，杀伤率> 80%，可判定为移植排斥反应。
权利要求
1.用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，该试剂是经CFSE染色的两种同品系的兔脾细胞的PBS悬液，两种兔脾细胞的总浓度为(5 7) X IO7个/mL，二者的比例为I :1， 其中，两种兔脾细胞分别来自经过异体皮肤移植后的供体和受体，染色后的阳性细胞比例彡95%，活细胞比例彡95%。
2.根据权利要求I所述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，其特征在于供体为雌性兔子。
3.根据权利要求I所述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂，其特征在于受体为雄性兔子。
4.如权利要求I 3任一项所述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，包括如下步骤1)取同品系的雌性兔子和雄性兔子分别为供体和受体，进行异体皮肤移植；2)异体皮肤移植后第10 13天切除供体和受体的脾脏，分别制成供体脾细胞的PBS 悬液和受体脾细胞的PBS悬液；3)往供体脾细胞的PBS悬液中加入6 μ M CFSE,往受体脾细胞的PBS悬液中加入O.24 μ M CFSE，然后在温度为37°C下孵育染色；4)染色后，将供体脾细胞和受体脾细胞用PBS洗涤后，按细胞数I: I的比例混合， 用PBS调整细胞总浓度为(5 7) X IO7个/mL，得用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂。
5.根据权利要求4所述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，其特征在于雌性兔子为雌性大白兔。
6.根据权利要求4所述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，其特征在于雄性兔子为雄性大白兔。
7.根据权利要求4所述的用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂的制备方法，其特征在于孵育染色时间为15 20 min。
全文摘要
本发明公开了用于兔子皮肤移植后免疫状态监测的试剂及其制备方法，该试剂是经CFSE染色的两种兔脾细胞的PBS悬液，两种兔脾细胞的总浓度为(5～7)×107个/mL，二者的比例为1∶1，其中，两种兔脾细胞分别来自经过异体皮肤移植后的供体和受体，染色后的阳性细胞比例≥95%，活细胞比例≥95%。本发明能快速、直观、准确的监测移植手术后兔的免疫状态。本发明的试剂直接注射于皮肤移植后的兔子体内，不需要模拟体内复杂环境，通过测试细胞的特异性损失来反映免疫状态，监测结果更全面、准确。
文档编号A61K49/00GK102580119SQ20121001393
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者潘明新, 蒋泽生, 钟利民, 高毅 申请人:南方医科大学珠江医院