专利名称：含有epo衍生物的血液相关疾病的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于以EPO衍生物为有效成分的血流增加剂、血管促进剂或者缺血性疾患治疗剂的药物发明。
背景技术：
红细胞生成素(以下有时记载为ΕΡ0)是促进红血球前驱细胞分化、增殖的酸性糖蛋白质激素，主要由肾脏产生。血液中含有非常丰富的红血球，它们在一定的期间内发挥作用后，在脾脏等处被破坏(人体红血球的平均寿命约为120天)，在正常状态下，通过骨髓不间断地供应，使末稍的全血红细胞数量经常保持稳定。EPO在这种维持生体内红细胞数量的稳定性方面起着核心性的作用。临床上利用EPO治疗贫血以及进行术前术后的管理。有报导EPO具有促进血管新生的作用，作为缺血性疾患的治疗剂有效(Anatole B et al. , The New England Journal of Medicine,339(9),584-590, (1998) > Christopher H et al.，Blood, 102(4)，1340-1346，(2003)、Ferdinand H B et al. , Blood, 103(3), 921-926, (2004) > Kyle J S et al. , Cardiovascular Research, (59), 538-548, (2003)、 Ferdinand H B et al. , Kidney International,64,1648-1652, (2003))。但是，在以促进血管新生作用为目的的EPO给药时，有可能引起非本来治疗目的的红血球数量增加。为此，临床上需要能尽量抑制红血球增加作用的，并且能作为缺血性的血液相关疾患治疗剂使用的新型治疗药物。
发明内容
本发明的目的是，提供治疗缺血性疾患等的治疗药物。诸位发明者发现EPO衍生物、特别是去唾液酸EPO具有增加血流、促进血管以及治疗疾患的作用，完成了此项发明。S卩，本发明提供以下内容(I)以EPO衍生物作为有效成分的缺血性疾患治疗剂。(2)EPO衍生物是去唾液酸EPO(I)的治疗剂。(3)与含有干细胞物质同时给药的(I)或者(2)的治疗剂。(4)含有干细胞物质为骨髓细胞的(3)的治疗剂。(5)以EPO衍生物为有效成分的血管促进剂。(6)EPO衍生物是去唾液酸EPO的(4)的促进剂。(7)以含有干细胞物质同时给药的(5)或者(6)的促进剂。(8)含有干细胞物质为骨髓细胞的(7)促进剂。(9)以EPO衍生物为有效成分的血流增加剂。(10)促EPO为去唾液酸EPO的(9)的促进剂。(11)与含有干细胞物质同时给药的(9)或者(10)的增加剂。(12)含干细胞物质为骨髓细胞的(11)的增加剂。
图I是使用ICR小鼠下肢缺血标本的EPO衍生物的治疗实验结果(左图生存效果、右图血管再生效果)表示图。图2是使用ICR小鼠下肢缺血标本，与骨髓细胞一同给药的EPO衍生物的治疗实验结果(左图生存效果、右图血管再生效果)表不图。图3是使用ICR小鼠下肢缺血标本的治疗实验结果(血流恢复效果)表示图。图4是使用ICR小鼠下肢缺血标本的治疗实验结果(血管新生效果)表示图。图5是使用无处置ICR小鼠，进行的EPO以及去唾液酸EPO的红细胞增多症诱发效果表示图。
具体实施例方式EPO本发明所使用的ΕΡ0，虽然可以使用任何ΕΡ0，但理想的是使用高纯度ΕΡ0。更具体的说，是具有与哺乳动物的ΕΡ0、特别是与人类的EPO实质性相同的生物学活性物质的高纯度 ΕΡ0。本发明所使用的ΕΡ0，可以使用各种方法制造。例如，可以使用从人类抽取物精制而成的天然的人体EPO(特公平1-38800号公报，等)，或者使用通过遗传工程的方法，由大肠杆菌、酵母菌、中国田鼠卵巢细胞(CH0细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等生成的，用各种方法提取、分离、精制出的人体EPO等。本发明所使用的ΕΡ0， 理想的是使用通过遗传工程的方法，用哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)制造的EPO(例如 特公平 1_44317 号公报，Kenneth Jacobs et al. , Nature, 313 806-810 (1985)等)。通过遗传基因置换法所得到的ΕΡ0，可以是与天然形成EPO的氨基酸排列相同的 ΕΡ0，也可以是该氨基酸排列中的存在I个或多个氨基酸缺失、置换、附加等的，具有与天然形成的EPO相同的生物学活性的ΕΡ0。氨基酸的缺失、置换、附加等，可以通过对该同业者公布的方法进行。例如，如果是该同业者，使用部位特异的变异诱发法等(Gotoh，T. et al. (1995)Gene 152, 271-275 ；ZoIler, M. J. and Smith, M. (1983)Methods EnzymoI. 100， 468-500 ；Kramer, ff. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 ；Kramer, ff. and Fritz, H. J. (1987)Methods EnzymoI. 154, 350-367 ；Kunkel, T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,488-492 ；Kunkel (1988)Methods EnzymoI. 85，2763-2766)，通过向 EPO 的氨基酸导入适宜的变异，就可以调制与EPO同等功能的多肽。而且，氨基酸的变异在自然界也会发生。一般情况下，被置换氨基酸的残基，理想的是被保存氨基酸支链性质的别的氨基酸置换。例如作为氨基酸支链的性质，可以列举出有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、 亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、有脂肪族支链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、有含氢氧基支链的氨基酸(S、T、Y)、有含硫原子支链的氨基酸(C、M)、有含羧酸以及含酰胺酸支链的氨基酸(D、N、E、Q)、有含碱基支链的氨基酸(R、K、H)、有含芳香族支链的氨基酸(H、 F、Y、W)(括弧内字母均为氨基酸的直列标记)。已经知道，相对某氨基酸排列的I个或者多个氨基酸残基的缺失、附加以及/或者有通过其他氨基酸的置换修饰的具有氨基酸排列的多肽，可以维持其生物学的活性(Mark,D. F. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81,5662-5666 ;Zoller，M. J. & Smith,M. Nucleic Acids Research(1982) 10，6487-6500 ;Wang， A. et al.，Science 224，1431-1433 ；Dalbadie-McFarland, G. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79，6409-6413)。还可以使用EPO与其他蛋白质结合的结合蛋白质。在制作结合多肽时，例如，使 EPO编码的DNA与其他蛋白质编码的DNA结构一致地相结合，导入发现媒介物，由宿主发现即可。本发明中，与EPO结合的其他蛋白质无特别地限定。还可以使用经过化学修饰的ΕΡ0。作为化学修饰EPO的事例，可以列举结合了聚乙二醇·维生素B12等无机化合物或者有机化合物的EPO等。EPO的衍牛物本发明中所指的EPO衍生物，是指修饰了 EPO分子中的氨基酸，或者是修饰了 EPO 分子中糖链的EPO。作为EPO糖链的修饰，包括糖链的附加、置换、缺换等内容。作为本发明中理想的糖链修饰，可以列举为EPO分子中的唾液酸缺失。通常，无论是通过转换动物细胞所生产的ΕΡ0，还是尿中提取的ΕΡ0，都可得到含有多种不同糖链构造EPO的EPO组成物。在每个EPO分子中的EPO组成物中，EPO分子附加的唾液酸的数量是不同的，通常，I个EPO分子附加有11 15个唾液酸。通过除去这些唾液酸可以制作去唾液酸化的EPO (去唾液酸ΕΡ0)。在去唾液酸化时，除去唾液酸的数量无特别限定，既可以除去所有的唾液酸，也可以除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或者14个唾液酸。本发明中理想的去唾液酸EPO的EPO分子附加唾液酸数量为10个以下， 更理想的是在5个以下，最理想的是在2个以下。本发明所使用的唾液酸的数量是包含在 EPO组成物中的EPO分子的平均数。I个分子的唾液酸平均数量，可以使用向该同业者公布的方法进行测定(EP0428267公报，等)。除去唾液酸的EPO(去唾液酸ΕΡ0)可以使用向该同业者公布的方法进行制作。例如，可以通过使用唾液酸酶等的酶对EPO进行处理的方法制作。可以使用市售的唾液酶(特表 2005-507426 号，Nobuo Inai et al. ·，Eur. J. Biochem, · 194，457-462 (1990)，等)。作为EPO分子中的氨基酸的修饰，虽然可以列举出氨基甲酰化、生物素化、脒化、 乙酰化、胍化等方法，但本发明理想的氨基酸修饰是氨基甲酰化法。修饰的氨基酸残基无特别的限定，例如，虽然可以列举出赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、 色氨酸等，但本发明的理想修饰氨基酸为赖氨酸。因此，作为本发明的氨基酸修饰EPO的理想状态，可以列举出氨基甲酰化 的 EPO(Marcel L et al.Derivatives of eryt hropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 2004 ；305 239> Fiordaliso E et al. A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium trom ischemia-reperfusion injury. PNAS, 2005 ； 102 :2046、等)。在 EPO 氨基甲酸化中，包括通过与氰酸盐离子等反应的氨基甲酰化，通过与异氰酸烷基脂等反应的烷基氨基甲酰化，通过与烯丙异丙氰酸盐等反应的芳基氨基甲酰化等。疾患本发明的治疗剂，作为血流增加剂、血管促进剂、缺血性疾患治疗剂有治疗作用。本发明的血流量增加是指，局部投给EPO衍生物的部位，或者从该部位到末梢部位的血流量比投药前增加。而且，还意味着到达缺血组织的血流量增加。关于是否具有增加血流量的作用，可以使用对该同业者公布的方法进行测定。例如，可以通过流体技术，使用微量放射性元素的方法进行定量测定(An. J. Physiol. 243 H378, (1982)。进一步还可以通过皮肤温度、热描记法、激光血流计、下肢/上肢血压比、组织氧分压等方法测定和确认。本发明的血管促进是指，促进血管的新生、促进血管的再生、以及促进血管的生长、发达。虽然通过EPO衍生物促进新生、再生、成长、发达等的血管无特别限定，但是在动脉，特别是末梢动脉表现理想。关于是否具有血管促进作用，可以使用对该同业者公布的方法进行测定。例如，可以通过使用碱性磷酸酯酶染色等方法测定毛细血管密度。进一步还可以使用血管造影等方法进行测定、确认。本发明的治疗剂对缺血性疾患的有治疗效果。缺血性疾患是由于血管内腔狭窄、 血栓形成、血管闭塞、血管炎、血管收缩、血液粘性增加等各种原因,所造成的血管血流量减少，组织陷入缺血状态的病症。作为缺血性疾患，有末梢循环障害、缺血性心脏疾患(心肌缺血症、心肌梗塞症、缺血性心功能不全等)、缺血性肾脏疾患、缺血性肺疾患、感染症相关的缺血性疾患等)。本发明的缺血性疾患治疗剂对缺血性疾患的对象无特别限定，虽然任何缺血性疾患都可作为治疗对象，但以末梢循环障害作为治疗对象较为理想。末梢循环障害是由于血管内腔狭窄、血栓形成、血管闭塞、血管炎、血管收缩、血液粘性增加等原因，造成末梢动脉血流量减少，使组织陷入缺血的病症。伴有末梢循环障害的疾患可以列举出闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎等慢性动脉闭塞症、进行性全身硬化症、全身性红斑、雷诺病、振动病、动脉瘤、血管炎等。治疗用制剂本发明的治疗剂，可以根据需要，随意地添加混悬剂、溶解辅助剂、稳定剂、等渗化剂、保存剂、吸附防止剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、PH调整剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂、氧化防止剂等。作为混悬剂的事例，可以列举出纤维素、聚山梨醇酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、 黄蓍胶末、羧甲基纤维素纳、缩聚山梨醇单十二酸酯等。作为溶液辅助剂，可以列举聚氧化乙烯硬化蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟酰胺、缩聚
山梨醇单十二酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。作为稳定剂，可以列举出葡聚糖40、纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。作为稳定剂，还可以添加某种氨基酸(例如，特开平10-182481号公报等)。作为可以添加的氨基酸中，包含游离氨基酸、氨基酸的钠盐、钾盐、盐酸盐等盐类。可以添加I种或者2种以上组合的氨基酸。虽然作为稳定剂添加的氨基酸无特别限定，但理想的氨基酸可以列举出白氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸。作为等渗化剂的事例，可以列举出D-甘露醇、山梨醇等。作为保存剂的事例，可以列举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、 苯酚、甲酚、氯化甲酚等。作为吸附防止剂的事例，可以列举出人血清白蛋白、卵磷脂、右旋糖酐、环氧乙烷、 甲基氧丙环共聚合体、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯硬化蓖麻油、聚乙二醇等。作为表面活性剂的非离子表面活性剂可以列举出单辛基山梨聚糖单、单月桂基山梨聚糖单、单棕榈基山梨聚糖、等山梨脂肪酸酯；单辛基丙三醇、单肉豆蘧基丙三醇、单硬脂酸丙三醇等的丙三醇脂肪酸酯；单硬脂甘油基癸酸酯、甘油基半胱氨癸酸酯、单甘油基亚麻酸癸酸酯等的聚甘油脂肪酸酯；聚氧化乙烯单月桂酸山梨聚糖、聚氧化乙烯油酸山梨聚糖、聚氧化乙烯单硬脂酸山梨聚糖、聚氧化乙烯单棕榈酸山梨聚糖、聚氧化乙烯三油酸酯山梨聚糖、聚氧化乙烯单三硬脂酸山梨聚糖等的聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯；聚氧化乙烯四硬脂酸山梨糖醇、聚氧化乙烯四油酸山梨糖醇等的聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯聚氧乙烯单硬脂酸甘油等的聚氧化乙烯甘油脂肪酸酸；聚乙烯硬脂酸乙二醇等的聚乙烯乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等的聚氧化乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯棕榈醚等的聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等的聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯硬化蓖麻子油(聚氧乙烯氢蓖麻子油)等的聚氧乙烯硬化蓖麻子油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等的聚氧乙烯蜂蜡衍生物聚氧乙烯羊毛脂等的聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯氨基硬脂酸等的含有聚氧乙烯脂肪酸氣基等的HLB 6 18的物质；阴尚子表面活性剂，例如掠桐基硫酸纳、月桂基硫酸钠、硫酸油醇钠等的含有碳原子数10 18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯月桂基硫酸钠等的环氧乙烷的平均附加摩尔数为2 4，烷基的碳原子数为10 18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基硫代玻拍酸酷纳等的烧基碳原子数为8 18的烧基硫代玻拍酸酷盐；天然系列的表面活性剂，可以列举如卵磷指、甘油磷酸脂、鞘磷脂等的鞘磷脂脂类；碳原子数12 18 的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等典型事例。本发明的制剂中，可以添加这些表面活性剂的I种或者2种以上的组合。希望的表面活性剂是，聚山梨醇酯20，40，60或者80等的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，特别希望的是聚山梨醇酯20以及80。而且，也希望泊洛沙姆(Pluronic F-68 (登陆商标)等)代表的
聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇。作为含硫还元剂，可以列举出N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸以及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、含有碳原子数I 7的硫醇酸等氧硫基物质等。作为防氧化剂，可以列举出异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、叔丁对甲氧酚制剂、 α -生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸以及基盐、L-抗坏血酸棕榈酸、L-抗坏血酸硬脂酸、 亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊基、没食子酸丙基、或者乙二胺四醋酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等的螯合剂。甚至，还可以含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐，以及枸橼酸钠、枸橼酸钾、醋酸钠等有机盐等通常的添加成分。将本发明作为缓释制剂时，缓释性制剂可以通过使用聚合体作为基剂等的众所周知的方法进行调制。作为基剂的聚合体，希望使用能够在生体内分解的聚合体。本发明治疗剂的EPO衍生物投药量，通常为O. 001 μ g/kg/day ΙΟΟΟμ g/kg/day， 但希望投药量为O. 01 μ g/kg/day 100 μ g/kg/day,最佳希望投药量为O. I μ g/kg/day 30μ g/kg/day。对于使用本发明治疗剂的患者，由医师综合考虑各个患者的年龄、体重、症状、给药途径等因素，决定投药量。本发明的治疗剂EPO衍生物希望局部投药。局部投药的部位无特别限定，可以对欲促进血管新生、增加血流量的部位(组织、器官等)以及发生缺血状态的部位等投药。作为具体的局部投药部位的事例，可以列举出，下肢骨格肌、上肢骨格肌、心脏(心肌)等。只要不会对全身造成大影响，而对患部局部有效，EPO衍生物的局部投药方法无特别的限定。使用一般的注射器、注射针头、局部针等，都可以进行局部给药。本发明中所谓的局部给药，一般是指直接向欲促进血管新生、增加血流量的部位和陷入缺血状态的部位以及其近旁等处，投与EPO衍生物。但是，也可以通过直接连接这些部位的血管进行给药。(例如，在肝脏为缺血部位时，从肝动脉投与EPO衍生物等。)本发明的治疗剂也包括以预防为目的的预防剂。干细胞含有物质干细胞是具有自我复制和分化能力的细胞，本发明所采用的干细胞即可以是造血干细胞，也可以是除此之外的其他干细胞。本发明中所谓的干细胞物质，如果是含有干细胞的组成物，则无特别限定。既可以仅含有干细胞，也可以包含有干细胞之外的其他成分。作为干细胞含有物质，可以列举出骨髓、脐带血、末稍血等。希望的干细胞含有物质是骨髓细胞。骨髓细胞即可以是自体骨髓，也可以是异体骨髓。而且，投与的骨髓组织匹配抗原 (HLA或者MHC)的类型不一定必须与患者一致，但是，希望与患者一致。骨髓细胞可以通过向同业者公开的方法调制，例如，可以将哺乳动物全身麻醉，从骨盆的部位(髂骨、大腿骨等)采集。采集的骨髓可以通过比重离心法等众所周知的方法，分离有核细胞成分或者低比重细胞成分。骨髓细胞的投与量一般为I X IO6 I X IO12个/body，希望投与量为I X IO8 IXlO10个/body，最希望的投与量为3X IO9 6X IO9个/body。给药的方法无特别限定，尽管可以使用任何的方法给药，但是，希望的是使用局部给药，特别希望对缺血部位进行肌肉内注射。骨髓细胞的给药可以向复数的部位或者分为复数的次数进行投药。例如，作为对四肢缺血的治疗给药的事例，可以列举出将浓缩为50ml的骨髓细胞含有溶液，分别向50个部位进行肌肉内给药的方法(每个部位lml)。作为心肌缺血治疗剂的事例，可以列举出将浓缩为IOml的骨髓含有溶液，分别向50个部位进行肌肉内给药的方法(每个部位O. 2ml)。本发明提供，以EPO衍生物和干细胞含有物质组合为特征的血流增加剂、血管促进剂或者缺血性疾患治疗剂。EPO衍生物和干细胞含有物质即可以同时给药，也可以依次给药。本发明的效果如后述的实施事例所示，本发明项目的发明者们在使用下肢缺血的标本进行治疗效果实验时，观察到与EPO单独给药相比，去唾液酸EPO单独给药对下肢坏死具有更强的抑制作用(生存效果)。在EPO单独给药的实验中，未见从发绀状态的恢复，但是，通过去唾液酸EPO单独给药，观察到了从发绀状态恢复的情况(实效性血管再生效果)。通过骨髓细胞移植和去唾液酸EPO给药的合并给药，进一步显著地增加了生存效果以及实效性血管再生效果。使用未进行人工造成下肢缺血的无处置ICR小鼠，进行红细胞增多症的发诱效果实验时，在投与EPO的实验中，观察到了成红细胞的亢进(Ret)、脾脏的髓外造血的亢进 (Sp)以及红细胞增多症(Hb、Hct)。但在投与去唾液酸EPO的实验中，未观察到这些副作用。本发明者虽然不受以下理论束缚，但是推测因为去唾液酸EPO比EPO在血液中的分解速度快，不在血液中滞留，所以不引起红细胞增多症那样的副作用。根据本项发明，通过投与EPO衍生物，不会诱发红细胞增多症等不希望发生的作用，可以使用于增加血流、促进血管新生以及治疗缺血性疾患。通过本项发明的实施事例，可作出进一步的说明，但是，本项发明不受这些限定。 当业者可以进行各种变更、修饰，这些变更、修饰也包含在本项发明之内。以下实施事例的统计学解析，全部数据使用平均值土SD表示。通过使用ANOVA进行群间的比较，然后，通过BON = FERR0NI进行确率的检定。P < O. 0024定义为无显著差
巳升。实施例I :去唾液酸EPO的调制从使用CHO细胞通过遗传子组换法制作的EPO(中外制药株式会社制)中，根据文献(Im ai N. Higuchi M. Kawamura A. Tomonoh K. Oh-Eda M. Fujiware M. Shimonaka Y. Ochi N. Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoietin. Supp ressive effects of sialic acid in the expression of biological activity of human erythropoietin in vitro. European Journal of Biochemistry. 194(2) :457-62. 1990 Dec 12.)记载的方法，调制了去唾液酸ΕΡ0。通过SDS凝胶电泳分子量的降低，以及等电点电泳Pl的变化，确认除去了唾液酸。而且，通过以EPO依存性细胞株的增殖作为指标的生物测定，确认去唾液酸EPO保持着生物活性。去唾液酸EPO的制作将EPO冻干粉末以及神经氨(糖)酸甘酶(生化学工业)，用IOmM枸橼酸-磷酸缓冲液(pH 6. 5)溶解，各自混合成lmg/ml以用250mU。以37°C孵化I小时后，通过C 4逆相HPLC纵列(VYDAC)的乙腈浓度梯度溶出，精制出去唾液酸EPO。所得到的去唾液酸EPO中的唾液酸已经除去，可以通过SDS凝胶电泳确认分子量降低，以及通过等电点电泳确认Pl的变化得以证实。也就是说，将去唾液酸EPO 5. O yg, 在SDS-PAGE样品缓冲剂(TEFCO)中，进行100°C，10分钟的转换处理，用其全量14%的丙烯酰胺(TEFCO)进行了电泳。将凝胶进行CBB染色，确认分子量约降低了 5KDa。使用 PhastGel IEF 3_9 (Amersham)进行等电点电泳后,用20%三氯醋酸溶液进行固定化处理， 使用PhastGel蛋白银染试剂盒进行银染色。确认了由于唾液酸的解离，pi变化至8. O的附近。去唾液酸EPO的牛物活件通过以EPO依存性细胞株的增殖作为指标，确认了去唾液酸EPO具有生物活性。即，将EPO依存性增殖细胞AS-E2细胞株(文献Miyazaki Y. Kuriyama K. Higuchi M. Tsushima H. Sohda H. Imai N. Saito M.Kondo Τ. Tomonaga Μ. Establishment and characterization of a new erythropoietin-dependent acute myeloid leukemia cell line, AS-E2. Leukemia. 11(11) :1941-9,1977Nov.)在 0. 04 lOng/ml 的去唾液酸 EPO 或者含有EPO的20% FCS/IM DM培养基中(Hyclone)，在37°C 5. 0% C02条件下，培养3 4 天，使用WST-I试剂(宝酒造)测定活细胞数。确诊了去唾液酸EPO也具有与EPO同样的增殖刺激。
实施例2 从日本横滨的Charles Riner购入雄性8周龄的ICR小鼠用于实验。所有的实验顺序按照 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH 出版号86-23 ; National Institute of Health, Bethesda, MD),在无菌条件下进行。通过向小鼠的腹腔内投与氯胺酮(60mg/kg Bff)以及甲苯噻嗪6mg/kg BW)麻醉小鼠。按照Isner的方法切开左下肢中间部位的皮肤，暴露血管(Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichler B，Isner JM Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol 152 1667-1679，1998)。结扎大腿动脉起始部后，结扎该潜在动脉，剥离其他的侧枝，与主动脉一同切除。所有的小鼠都给以通常的饮食和饮水。实施例3 :使用下肢缺血标本的治疗效果实施(生存效果和血管再生效果)(实施方法)使用实施例2的方法制作的ICR小鼠下肢缺血标本进行了治疗实验。在实验中， 将下肢的坏死定义为死(survival)。并将下肢发甜的恢复定义为恢复(recovery)。实验中使用了以下各群(各群13匹)。C群无治疗E群EP0(400U/kg体重，缺血部位肌肉内注射)连续6天给药的治疗。A E群同剂量同给药方法的去唾液酸EPO治疗。B群将1X107个骨髓细胞，在缺血部位进行肌肉内注射的治疗(在第I天，分4 个部位给药)B+E群合并使用B (骨髓细胞)和E (EPO)。B+AE群合并使用B和AE (去唾液酸ΕΡ0)(结果)各治疗的生存效果、恢复效果以及结果如图I、图2所示。将结果总结如下(I) EPO单独给药对下肢坏死有抑制作用，但去唾液酸EPO单独给药对下肢坏死有更强的抑制作用(生存效果)。(2) EPO单独给药时未观察到从发绀状态的恢复，但去唾液酸EPO单独给药时，观察到了从发绀状态的恢复(实效性血管再生效果)。(3)虽然观察到骨髓细胞移植具有生存效果以及实效性血管再生效果，但是，合并使用EPO给药可以增强这些效果，如果将去唾液酸EPO代替EPO合并使用，则能更有效地显著增强这些效果。实施例4 :使用下肢缺血标本的治疗效果实施(血流恢复效果)使用与实施例3中下肢生存·恢复标本相同的小鼠、相同的方法制作的小鼠下肢缺血标本测定血流。(实施方法)从制作好下肢缺血标本的当天开始治疗(day I)。移植在day I内进行。EPO等的给药在day 1-6的连续6天内进行。在Day 7内使用激光·多普勒测定下肢血流的恢复。实验中使用了以下各群。C群连续6天肌肉内注射生理盐水(η = 12)
E群连续6天肌肉内注射EPO 400U/kg体重(η = 5)。A群连续6天肌肉内注射去唾液酸EPO 400U/kg体重(η = 5)。B群移植同种同系骨髓细胞(I X IO7骨髓细胞)(η = 7)B E群合并使用B和Ε(η = 5)B A群合并使用B和Α(η = 6)测定时，使用Moor Instruments 公司(Wilmington, Delaware, USA)的 moorLDI Laser Doppler system测定两下肢血流，缺血肢测定值除以健康肢测定值得到flux ratio。(结果)得到的结果如图3所示。与EPO相比，去唾液酸EPO与单独治疗以及与骨髓细胞移植合并使用的两种方法对下肢血流恢复的效果更好。实施例5 :使用下肢缺血标本的治疗效果实施(血管新生)(实施方法)在实施例4中使用Laser Doppler测定血流之后，取出缺血下肢作为标本，使用抗 CD31抗体和过氧化物酶法对血管进行染色。计数血管数和肌肉纤维数，前者除以后者的值作为相当于肌肉纤维的血管数。(结果)得到的结果如图4所示。与EPO相比，去唾液酸EPO与单独治疗以及与骨髓细胞移植合并使用的两种方法对下肢血流恢复的效果更好。实施例6 :导致红细胞增多症发病的效果(实验方法)以观察EPO的副作用红细胞增多症的发病为目的，对不进行人工制作下肢缺血的未经处置的ICR小鼠，连续6天的EPO给药或者去唾液酸EPO给药(下肢肌肉内注射)，在给药第I天起算的10天后，采血后实施安乐死，测定脾脏的重量(Sp)。并测定血红蛋白浓度(Hb)、红细胞压积值(Hct)以及网状红细胞比率(Ret)。实验中使用了以下各群(各群8匹)。C群对照E群ΕΡ0的每次给药量为40，400或者4000U/kg。AE群同等剂量的去唾液酸EPO(结果)各给药剂量的Sp :脾脏重量，Hb :血红蛋白浓度，Hct :红细胞压积值，Ret :网状红细胞的效果如图5所不。结果总结如下(I)观察到通过EPO给药，造成的成红细胞造血亢进(Ret)，脾脏的髓外造血亢进 (Sp)以及红细胞增多症(Hb、Hct)。(2)未观察到通过去唾液酸EPO给药造成的这些副作用。
权利要求
1.去唾液酸EPO在制备血流增加剂中的用途。
2.一种血流增加剂，其包含去唾液酸EPO和骨髓细胞。
全文摘要
本发明公开了一种以红细胞生成素(EPO)衍生物作为有效成分的血流增加剂、血管促进剂以及缺血性疾患治疗剂。
文档编号A61K38/19GK102580058SQ20121001381
公开日2012年7月18日 申请日期2006年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者加藤公则, 樋口正人, 鸟羽健 申请人:新潟Tlo株式会社