一种新型检测个体化胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测、评估个体化胰岛素水平的免疫质谱试剂盒及制备方法，为一种非侵入性的体外检测方法。本方法用抗体吸附表面基质及质谱法进行鉴别检测发现一种新型变异的胰岛素。变异的胰岛素或5835.65Da峰值可用于个体化胰岛素水平的检测及评估。通过5835.65Da峰值或被抗体吸附表面基质上捕获的变异的胰岛素，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测，可以应用到已经脱离人体体液的生物标志组合的检测试剂盒的开发。本方法精确、方便且快捷。
【专利说明】一种新型检测个体化胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种非侵入性检测、评估胰腺癌伴有重型糖尿病病人试剂盒的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被磁珠或抗体捕获的胰岛素进行精确地鉴别、检测。
【背景技术】
[0002]随着人类基因组计划的实施和完成，科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(proteome)的概念，指的是“一种基因组所表达的全部蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学(proteomics)。蛋白质组学被认为是后基因组研究中最主要的部分。与基因组相比，蛋白质组的组成更复杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和调控网络的广泛完整的认识。 所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学等的重要研究手段。
[0003]不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用抗体及质谱联合可克服这一技术缺点。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是建立一种在生物样品中检测变异的胰岛素的免疫质谱试剂盒和制备方法。该方法为疾病的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的变异的或修饰的生物标志提供了基础。
[0005]本发明涉及一种非侵入性检测的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被抗胰岛素抗体捕获的变异的胰岛素进行精确地鉴别、检测的方法。
[0006]变异的胰岛素的免疫质谱试剂盒制备及检测方法:
[0007]—小管标有抗胰岛素抗体的磁珠,50微升；
[0008]一小管结合缓冲液(磷酸盐缓冲液，PBS buffer, pH 7.0-8.0)，500微升；
[0009]一小管洗涤液(去离子水)，500微升；
[0010]一小管洗脱液(1-2%三氟乙酸)，50微升；
[0011]一小管以50%乙腈、0.5%三氟乙酸的制备的吸能分子标准溶液，50微升。
[0012]上述各小管置于4°C冷藏盒中。
[0013]具体操作步骤如下:(I)将生物样品稀释在结合缓冲液中；用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清及样品点样在已标记上抗胰岛素抗体的基质上,常用与抗体结合的基质可选择Protein A、Protein G、或streptavidin-biotin系统；基质的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads ；所述基质的支持物采用陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads之中的任一种；所述步骤(3)用洗涤液洗涤；在样品完全干燥前将第一份洗涤液加到该位点；洗涤液在位点上至少停留10秒；彻底清除第一份洗涤液，用第二份洗涤液重复以上步骤；用I?2%三氟乙酸洗脱液彻底洗涤磁珠，将生物标志洗脱至质谱专用的金属片上，自然干燥金属片，加0.5μ L以50%乙腈、0.5%三氟乙酸制备的吸能分子标准溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;所述步骤(4)用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用波长337nm的氮激光仪和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析变异的胰岛素；用仪器的软件进行定量性质谱自动调控:每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至质谱仪信号强度最大值的50%。用计算机分析数据进行数据重叠展示5807.65Da或5835.65Da生物标志。
[0014]本发明中变异的胰岛素是利用一台高精确度的质谱仪来发现的；该设备的质量精确度约为0.001%。
[0015]变异的胰岛素生物标志物首先能够被具有能与生物标志物结合的抗体或磁珠基质WCX吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在飞行质谱仪中被检测。生物标志物通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。用仪器的软件进行定量性质谱自动调控:每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的4091.1Da或6634.0Da标准峰强度调至质谱信号强度最大值的50%。生物标志物的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标志物的数量与质量都可以被检测出来。
[0016]飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本所产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。
[0017]通过对生物标志物的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的标记物的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个生物标志物的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志物的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。
[0018]计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生物标记物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。
[0019]软件分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，可用软件自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。
[0020]对生物标志的检测需要将一个样本放基质的一个吸附点上，接着进行清洗。向吸附点上加入SINAPINIC酸等并让其干燥。而后，用质谱测定法对基质进行分析，而一个显示了蛋白质分子的遗留物图将生成，这张图是在蛋白质分子的质量-电荷比的基础上，以彼此分开的峰图的形式显示出来的。
[0021]因为本项发明中的生物标记是通过分子的质量和特异性抗体来标识的，因而它们可通过质谱测定法进行检测而直接知道它们特定的身份。这种方法比以抗体为基础的ELISA及免疫荧光法等夹心法更准确。
[0022]然而，如果有必要，这些生物标志也可通过，比如，确定多肽的氨基酸序列来进行鉴别。例如，一个生物标志能用许多酶描绘出来，例如V8蛋白酶(V8pr0teaSe)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用来在数据库中搜索序列,这些序列与由多种酶生成的消化片断的分子量相吻合。或者，如果此生物标志不是已知数据库中的蛋白质分子，在生物标志的N极氨基酸序列(N-terminal amino acid sequence)的基础上，可使用降解探针，而后，这些探针会被用来描绘由探测到了生物标志的样本所生成的基因组或cDNA库。最后，蛋白质生物标志可用蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质梯度(protein ladders)。然后,用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments)在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。
[0023]特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征。通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来。对专有特征的识别往往依赖于特殊的检测方法，例如要了解某种疾病是否存在有特异性抗原就要用有关特异性抗体来检测。自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检测和界定方法有了很大的突破，如一个蛋白质不同片段变异是不同类型肿瘤的标志。根据基因到蛋白质表达的复杂过程，一种特异性基因的产物——蛋白质必定有相关多组分蛋白质的表达。通过对这些不同组分的检测形成一个综合模式图(蛋白指纹图谱)，将这种图谱(如某种肿瘤)与其他图谱(如正常人或其他疾病)相比较，进而识别这种特异蛋白(如肿瘤抗原或其片段)，从而将正常人与患某种疾病病人的离体血液区分开来。
[0024]具体操作步骤:
[0025]以下是用本发明提供的一个操作方案实例。
[0026]1.样品处理及标准化质控血清制备
[0027]将生物样品稀释在结合缓冲液中，视需要离心澄清样品。质谱的标准化质控血清制备定义符合如下标准:供血者10人，5男5女，血型为O型；年龄为18-30岁；民族汉。生化指标正常，包括:总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功检查、肾功检查；无遗传病家族史；无重大传染病史。女性不能怀孕，男性为不吸烟者。[0028]2.样品上样
[0029]将质谱的标准化质控血清及样品点样在磁性珠子(磁珠)作为支持物的基质上[a.可用WCX基质的磁珠，阴离子表面(WCX, Weak Cationic Exchanger, 一羧酸基团)基质磁珠(实施例1);或用b.已标记上抗胰岛素抗体基质的磁珠(实施例2)]。可以将质谱的标准化质控血清用于质谱的定量方法。基质的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads。
[0030]3.洗涤
[0031]用洗涤液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤液加到该位点。洗涤液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。
[0032]4.洗脱
[0033]I-2%三氟乙酸彻底洗涤整个磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5 μ L吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制备的标准溶液)。
[0034]吸能分子可用sinapinic acid 或 alpha-cyano-4_hydroxycinnamic acid 等。
[0035]5.质谱的定量控制及测试
[0036]用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析滞留与各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示；可展示5807.65Da或5835.65Da生物标志。
[0037]定量性质谱调控:每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至信号强度最大值的50%。
[0038]用统计学方法，通过WCX磁珠试剂盒的血清蛋白指纹峰分析，发现下述一种分子量为5835.65及5807.65Da蛋白指纹可以用于区分正常人血清、胰腺癌伴有重型糖尿病病人的血清、糖尿病病人的血清:
[0039]表一、WCX磁珠试剂盒的血清蛋白指纹峰分析
[0040]
【权利要求】
1.一种来自胰腺癌伴有重型糖尿病病人的生物样品中的生物标志，该生物标志为变异的胰岛素；其分子量特征为5835.65Da ;该生物标志的鉴定是通过以下步骤实现: (1)样品处理及质谱标准化质控血清制备； (2)样品上样至基质上； (3)洗漆； (4)质谱的定量控制及质谱测试； 其中所述步骤(I)将生物样品稀释在结合缓冲液中；用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清及样品点样在已标记上抗胰岛素抗体的基质上，基质的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads ;所述步骤(3)用洗涤液洗涤；在样品完全干燥前将第一份洗涤液加到该位点；洗涤液在位点上至少停留10秒；彻底清除第一份洗涤液，用第二份洗涤液重复以上步骤；用I?2%三氟乙酸洗脱液彻底洗涤磁珠，将生物标志洗脱至质谱专用的金属片上，自然干燥金属片，加0.5μ L以50%乙腈、0.5%三氟乙酸制备的吸能分子标准溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;所述步骤(4)用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用波长337nm的氮激光仪和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析变异的胰岛素；用仪器的软件进行定量性质谱自动调控:每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至质谱仪信号强度最大值的50%。
2.权利要求1中所述的变异的胰岛素在制备试剂盒中的用途，其特征在于，用于制备检测胰腺癌伴有重型糖尿病病人中的变异的胰岛素的免疫质谱试剂盒。
3.权利要求2中所述的变异的胰岛素为甲基化的胰岛素，其化学结构为: A 链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN B 链:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGE R(CH3)2G F F Y T P K T。
【文档编号】G01N33/68GK103454428SQ201210180854
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年6月5日 优先权日:2012年6月5日
【发明者】许洋 申请人:许洋