一种多探头液质联用点板装置的制造方法
【专利摘要】一种多探头液质联用点板装置，涉及生物样品分析。设有第一微型零死体积三通、第二微型零死体积三通、第三微型零死体积三通、二级阵列毛细管液相色谱柱、三级阵列毛细管液相色谱柱、多探头毛细管固定平台；二级阵列色谱柱通过第一微型零死体积三通与单一色谱柱连接，三级阵列色谱柱通过第二微型零死体积三通和第三微型零死体积三通与二级阵列色谱柱连接；三级阵列色谱柱接固定平台；第一微型零死体积三通与二级阵列色谱柱连接；第二微型零死体积三通和第三微型零死体积三通与二级阵列色谱柱连接，第二微型零死体积三通和第三微型零死体积三通与三级阵列色谱柱连接，三级阵列色谱柱连接到固定平台的固定架上；固定平台固定于三维电动位移台上。
【专利说明】
一种多探头液质联用点板装置
技术领域
[0001] 本发明涉及生物样品分析，尤其是涉及一种多探头液质联用点板装置。
【背景技术】
[0002] 分析科学领域越来越关注于微纳尺度的样品检测，以纳流液相色谱、毛细管电泳 为主的高效分离技术为微量样品的解析提供了更多选择。纳流液相分离极低的体积流量能 显著减少样品和溶剂消耗，减小成本，降低样品稀释程度，提高分析检测灵敏度，与微量样 品有良好的匹配性;同时能显著能降低质谱离子源的负担，与质谱检测器有较好的兼容性。
[0003] 质谱技术已经被广泛应用于生物样品的分析并且成为蛋白质组学研究中不可或 缺的工具。质谱有强大的结构鉴定能力，高的质量精确性和分辨率，而且可以分析飞摩尔级 的肽段和蛋白质，电喷雾离子源质谱和基体辅助激光解析离子源质谱的出现使生物大分子 的分析成为了可能。
[0004] 纳流液相分离通常在100m内径以下的通道内中进行，流量范围多为50~500nl/ min，而常规电喷雾质谱样品引入系统一般包括气动雾化器和双程雾化室两部分，雾化器适 用流量约为lml/min，且雾化室死体积较大（40~100mL)，会导致谱带展宽（SchaumlSffel, Dirk, Jorge Ruiz Encinar ,and Ryszard Lobinski ?''Development of a sheathless interface between reversed-phase capillary HPLC and ICPMS via a microflow total consumption nebulizer for selenopeptide mapping.^Analytical chemistry 75.24(2003) :6837-6842)，因此与电喷雾质谱联用要解决的是洗脱液流速与雾化器消耗量 相匹配的问题，需要设计相应的接口用于纳流液相分离和质谱联用，一般通过降低同心雾 化器中央毛细管尺寸或减小出口气孔内径实现，而这会导致喷针易于堵塞，仪器架构复杂， 检测结果稳定性差等结果。
[0005] 另一种液质联用方式被称为离线联用，主要用于纳流液相分离和基体辅助激光解 析离子源质谱联用，其关键在于对分离后样品的有效收集。离线联用的分离和检测在时空 上相对独立，可达到前端液相分离流出物在最佳流速下沉积存储，后端质谱根据需要选取 合适的数据米集速率（Pe§，0ndrej, and Jan Preisler."0ff_line coupling of microcolumn separations to desorption mass spectrometry?"Journal of Chromatography A 1217.25 ( 20 10): 3966-3977；Miernyk,Jan A.,and Mark L.Johnston.''Digging deeper into the seed proteome:prefractionation of total proteins?"Seed development:0MICS technologies toward improvement of seed quality and crop yield. Springer Netherlands ,2012.265-278)，从而同时实现液相分 离和质谱检测效果的最优化。
[0006] 目前国内外在离线联用领域多限于单探头方式，将经过液相分离后的样品通过管 路转移到MALDI靶板上。这种操作方式分析通量低，管路转移的方式往往导致柱后死体积的 产生，经液相分离后的样品会在柱后扩散，牺牲色谱分离度。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种多探头液质联用点板装置。
[0008] 本发明设有第一微型零死体积三通、第二微型零死体积三通、第三微型零死体积 三通、二级阵列毛细管液相色谱柱、三级阵列毛细管液相色谱柱、多探头毛细管固定平台；
[0009] 所述二级阵列毛细管液相色谱柱通过第一微型零死体积三通的上端口与单一色 谱柱出口端连接，三级阵列毛细管液相色谱柱通过第二微型零死体积三通和第三微型零死 体积三通与二级阵列毛细管液相色谱柱连接;三级阵列毛细管液相色谱柱直接连接到多探 头毛细管固定平台上；
[0010]单一色谱柱经进样器与高压纳流栗上，第一微型零死体积三通的左端口和右端口 分别与二级阵列毛细管液相色谱柱入口连接;第二微型零死体积三通的上端口和第三微型 零死体积三通的上端口分别与二级阵列毛细管液相色谱柱的2个出口端连接，第二微型零 死体积三通的左端口和第三微型零死体积三通的左端口、第二微型零死体积三通的右端口 和第三微型零死体积三通的右端口分别与三级阵列毛细管液相色谱柱的入口连接，三级阵 列毛细管液相色谱柱连接到多探头毛细管固定平台的固定架上;多探头毛细管固定平台上 设有固定孔，多探头毛细管固定平台通过固定孔固定于三维电动位移台上。
[0011] 使用时，待测样品经进样器上样后，于单一色谱柱上初步洗脱，洗脱流出物通过第 一微型零死体积三通逐柱富集到二级阵列毛细管液相色谱柱的柱头，经二级阵列色谱柱分 离后的洗脱流出物通过第二微型零死体积三通和第三微型零死体积三通逐柱富集到三级 阵列毛细管液相色谱柱的柱头，阵列色谱柱均通过高压纳流栗进行色谱洗脱。经三级阵列 色谱柱分离后的洗脱物，通过三维电动位移台上移动，按照预设的频率均匀、离散地点到基 质辅助激光解析质谱靶板上，供基质辅助激光解析质谱检测。
[0012] 本发明由多通道色谱柱连接接口、平行阵列毛细管柱和多探头毛细管固定平台等 部分组成，多通道色谱柱连接接口由多个微型零死体积三通构成，用于连接多根毛细管液 相色谱柱;平行阵列毛细管柱由多根柱型和柱压完全相同的色谱柱(最多可到384根)连接 而成。
[0013]本发明将纳流液相分离后的产物按照所需频率，直接转移到到MALDI靶板上用于 质谱鉴定，避免了柱后扩散产生;可以按照需要设计探头的数目和相对位置，再利用3D打印 技术制作点板台，实现了液质联用的开源化。
[0014] 本发明基于蛋白质组研究样品量少且珍稀的特点，将经过液相分离后的复杂样 品，在多探头点板装置的作用下，分割成n个(n>2)相同的样品系列，每个样品系列为原样 的1/n，然后可进行多种不同方式的检测。相同样品的多重检测结果集成起来即可获得复杂 样品多方位的信息。此方法有效解决了因某些检测技术对样品的损耗或破坏，而不能再进 行其它方式检测的缺点；分流后的样品组份可以进行收集、保存，以待之后对感兴趣的样品 点进行检测。一次色谱分离操作，多维检测模式的分析方法可以有效地提高分析效率。
[0015] 本发明用于纳升液相色谱和激光辅助激光解吸质谱联用的分离检测系统，并将该 系统用于复杂生物样品的分析。本发明用于将纳流液相分离的产物等分成n个(n多2)相同 的样品系列，然后再按照所需频率直接且高速有序地转移到MALDI靶板上用于质谱鉴定。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明实施例的结构组成示意图。
[0017] 图2是本发明实施例的多探头毛细管固定平台的结构组成示意图。
[0018] 图3是本发明实施例使用状态示意图。
【具体实施方式】
[0019] 参见图1~3,本发明实施例设有第一微型零死体积三通4、第二微型零死体积三通 5、第三微型零死体积三通6、二级阵列毛细管液相色谱柱7、三级阵列毛细管液相色谱柱8、 多探头毛细管固定平台9。
[0020] 所述二级阵列毛细管液相色谱柱7通过第一微型零死体积三通4的上端口 41与单 一色谱柱3出口端连接，三级阵列毛细管液相色谱柱8通过第二微型零死体积三通5和第三 微型零死体积三通6与二级阵列毛细管液相色谱柱7连接;三级阵列毛细管液相色谱柱8直 接连接到多探头毛细管固定平台9上。
[0021]单一色谱柱3经进样器2与高压纳流栗1上，第一微型零死体积三通4的左端口 42和 右端口 43分别与二级阵列毛细管液相色谱柱7入口连接;第二微型零死体积三通5的上端口 51和第三微型零死体积三通6的上端口 61分别与二级阵列毛细管液相色谱柱7的2个出口端 连接，第二微型零死体积三通5的左端口 52和第三微型零死体积三通6的左端口 62、第二微 型零死体积三通5的右端口 53和第三微型零死体积三通6的右端口 63分别与三级阵列毛细 管液相色谱柱8的入口连接，三级阵列毛细管液相色谱柱8连接到多探头毛细管固定平台9 的4个固定架12~15上；多探头毛细管固定平台9上设有2个固定孔16、17,多探头毛细管固 定平台9通过固定孔16和17固定于三维电动位移台11上。
[0022]在图3中，箭头表示液流方向。
[0023] 使用时，待测样品经进样器2上样后，于单一色谱柱3上初步洗脱，洗脱流出物通过 第一微型零死体积三通4逐柱富集到二级阵列毛细管液相色谱柱7的柱头，经二级阵列色谱 柱分离后的洗脱流出物通过第二微型零死体积三通5和第三微型零死体积三通6逐柱富集 到三级阵列毛细管液相色谱柱8的柱头，阵列色谱柱均通过高压纳流栗1进行色谱洗脱。经 三级阵列色谱柱分离后的洗脱物，通过三维电动位移台上11移动，按照预设的频率均匀、离 散地点到基质辅助激光解析质谱靶板10上，供基质辅助激光解析质谱检测。
[0024]以下给出本发明的使用方法：
[0025] -、蛋白质阵列色谱分离系统的建立
[0026] 1.毛细管色谱柱的制备和前处理
[0027] 米用单颗粒塞技术（Z ? Xiao，Lin Wang，Bo Zhang et al ? A "plug-and-use" approach towards facile fabrication of capillary column for high performance nanoflow liquid chromatography.J.chromatogr.A 2014,1325:109-114)，结合高压勾衆 填充的方法制备毛细管柱。基于单颗粒塞的高通透性，制备若干根(2~12根)分离效果相同 的15cm长的反相毛细管色谱柱用作色谱分析柱。
[0028] 用作液质联用的毛细管柱尾端需要事先进行疏水性处理，以避免记忆效应的产 生。处理方法如下：在毛细管柱填充之前，运用烧灼的办法，去掉毛细管外壁的聚酰亚胺涂 层（约2mm);然后将去掉涂层的一端浸入到玻璃防水剂Aquapel (PPG Industries， Pittsburgh，USA)中疏水性处理 30min。
[0029] 2.毛细管固定平台的制作
[0030] 综合考虑纳流液相色谱柱的外径和MALDI靶板中靶点的间距后，采用So 1 id Works 软件绘制出设计图，以ABS(丙烯晴一丁二烯一苯乙烯共聚物)作为材料，利用3D打印技术制 作出毛细管柱固定平台（如图2所示）。该平台的关键设计部分在于固定架内部的中空部分 直径和纳流液相色谱柱的外径相同，从而能够固定住液相色谱柱，避免因滑脱引起点板定 位不准。示意图中设计的毛细管柱固定平台，其长度为15cm，宽度为8cm，厚度为lcm，并带 有多个4cm高度的固定架，其中固定架结构是内部为中空部分直径为360m，底面半径为5mm 的圆柱体设计；同时在固定架开有两个直径8mm的固定孔用于将毛细管固定平台，通过螺丝 固定到三维电动位移台上。
[0031] 3.多探头液质联用系统的建立
[0032]多根色谱柱之间通过零死体积三通(如图3所示）连接，因每根色谱柱的柱压及分 离效果相同，待测样品在第一根毛细管液相色谱柱上洗脱后，洗脱流出物通过多通道色谱 连接接口等份富集到各阵列色谱柱的柱头上;再将各阵列色谱柱连接到点板平台上，各阵 列毛细管色谱柱尾端会套上内径为0.3mm的聚四氟乙烯管，用于进一步保护和固定毛细管 色谱柱;色谱柱阵列中各通道的洗脱流出物会按照一定频率直接、有序的转移到预先点不 同种类基质的MALDI靶板上，供之后的激光辅助激光解吸质谱分析。
[0033] 二、用所建多探头液质联用点板装置进行蛋白质组样品分析
[0034] 细胞色素C样品以胰蛋白酶酶解(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司），浓 度为 5mg/mL。
[0035]操作时，首先按照装置示意图1连接，通过微型零死体积三通（1/16外径，IDEX，美 国）、1根单一色谱柱(RP，lOOwii内径，15cm长）、4根阵列色谱柱(RP，lOOwii内径，15cm长)建立 阵列多维液相色谱分离系统。配制流动相buff er A: H20/0.1 %TFA，buff er B: ACN/0.1 % TFA，buffer C:60%ACN。所建二维阵列色谱分离系统以buffer A平衡后，将400nL细胞色素 C酶解产物经自动进样器载入到阵列式液相色谱分离系统中第一根的反相色谱柱上，依次 按照反相梯度洗脱程序（〇~5%B，5min;5% ~50%B，50min;50% ~100%B，30min)，400nL/ min的流量洗脱，洗脱下来的肽段被转移并富集到第二段阵列色谱柱的柱头后，被继续洗 脱;最终，流出物以设置的时间间隔被自动点到MALDI靶板，且此MALDI靶板已预先点好不同 种类基质(CHCA、DHB)。
[0036]最后，用BRUKER ultraflextreme Proteomics Analyzer对每个样品点进行 MALDI-MS和MALDI-MS/MS的测定。用FlexAnalysis软件对所得数据进行处理，并在蛋白质数 据库Mascot内进行搜索，从而得到肽段鉴定结果。分流后的同源样品组份以两种基质模式 的基质辅助激光解析质谱进行检测，获得的分析结果互为补充。一次色谱分离操作，多维检 测模式的分析方法有效的提高了分析效率。
【主权项】
1. 一种多探头液质联用点板装置，其特征在于设有第一微型零死体积三通、第二微型 零死体积三通、第三微型零死体积三通、二级阵列毛细管液相色谱柱、三级阵列毛细管液相 色谱柱、多探头毛细管固定平台； 所述二级阵列毛细管液相色谱柱通过第一微型零死体积三通的上端口与单一色谱柱 出口端连接，三级阵列毛细管液相色谱柱通过第二微型零死体积三通和第三微型零死体积 三通与二级阵列毛细管液相色谱柱连接;三级阵列毛细管液相色谱柱直接连接到多探头毛 细管固定平台上； 单一色谱柱经进样器与高压纳流栗上，第一微型零死体积三通的左端口和右端口分别 与二级阵列毛细管液相色谱柱入口连接;第二微型零死体积三通的上端口和第三微型零死 体积三通的上端口分别与二级阵列毛细管液相色谱柱的2个出口端连接，第二微型零死体 积三通的左端口和第三微型零死体积三通的左端口、第二微型零死体积三通的右端口和第 三微型零死体积三通的右端口分别与三级阵列毛细管液相色谱柱的入口连接，三级阵列毛 细管液相色谱柱连接到多探头毛细管固定平台的固定架上;多探头毛细管固定平台上设有 固定孔，多探头毛细管固定平台通过固定孔固定于三维电动位移台上。
【文档编号】G01N30/02GK105891363SQ201610216186
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】张博, 丁芳芳, 史晓慧, 曾巨星, 黄山青
【申请人】厦门大学