高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法；采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中褪黑素，利用高效液相色谱将褪黑素与杂质分离，内标法定量，以褪黑素的同位素作为内标，以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算褪黑素的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确性好，前处理过程简单；分析时间短，4.2min内即可完成褪黑素的分析，精密度及加标回收率满足检测要求。
【专利说明】
高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法及试 剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及唾液检测的技术领域，特别涉及一种高效液相色谱串联质谱技术检测 唾液中褪黑素的方法。
【背景技术】
[0002] 目前常用的检测唾液中褪黑素的方法有酶联免疫法、电化学发光免疫法等，这些 方法受到多种客观条件的影响，如温度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可避免 唾液基质中结构相似物质的干扰，灵敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大，缺 乏统一标准，导致检测结果偏差较大，参考价值较低。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是解决现有唾液中褪黑素检测方法技术中存在的部分问题，提供一 种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法及试剂盒。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] -种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法，包括如下步骤：
[0006] 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中褪黑素，利用高效液相 色谱将褪黑素与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴， 标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算褪黑素的含量；
[0007] (1)具体色谱条件为：
[0008] 流动相A:体积比为0.05 %的甲酸水；
[0009] 流动相B:甲醇，纯度为色谱纯，浓度为100% ;
[0010] 色谱柱型号：Phenomenex Kinetex_C18,50X2.
[0011] 采用梯度洗脱的方式，见表1;
[0012] 流速为0.2ml/min，柱温为40°C，进样体积为20yl;
[0013]表1流动相梯度洗脱参数
[0015] ⑵质谱条件：
[0016] 在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾电压为 5000V;碰撞气为5;气帘气为10;离子源气流GS1为60，GS2为60;离子源温度为450°C ;检测离 子对m/z:褪黑素233.2/174.1、内标d4-褪黑素237.1/178.2;褪黑素及内标的去簇电压、碰 撞电压碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2;
[0017]表2褪黑素及内标的质谱参数
[0019] 优选地，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500yl于2ml离心管 中，加入50ng/ml的内标溶液10yr混匀后加入lmol/1的NaOH溶液lOOyl和lml萃取液，涡旋混 合5min，13000r/min离心10min，取上清800yl;氮气吹干，以10 %甲醇水lOOyl复溶，涡旋 3min; 13000r/min，离心3min，进样检测。
[0020]优选地，所述内标溶液配制:称取褪黑素同位素内标，甲醇溶解后配制成lmg/ml的 储备液用甲醇；用甲醇将储备液用甲醇稀释至50ng/ml即得实验用内标溶液。
[0021] 优选地，所述萃取液为正己烷:乙酸乙酯为1:1的混合液。
[0022] 优选地，所述氮气吹干温度为40~50°C。
[0023] 本发明的另一方面通过以下方法实现：
[0024] 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的试剂盒，所述试剂盒包括如下试 剂：
[0025] (1)洗脱液：
[0026] 洗脱液A:0.05%V/V甲酸水；
[0027]洗脱液B:甲醇(色谱纯）；
[0028] (2)标准品母液:褪黑素的甲醇溶液；
[0029] 配制:精确称取10mg褪黑素标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母液；
[0030] (3)内标液:d4-褪黑素的甲醇溶液；
[0031 ] 配制:精确称取10mg d4-褪黑素的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母 液;用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
[0032] (4)稀释液：
[0033] 稀释液1:空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
[0034] 稀释液2:甲醇；
[0035]稀释液3:氢氧化钠溶液；
[0036] (5)萃取液：正己烷：乙酸乙酯= 1:1;
[0037] (6)质控品：褪黑素的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度 分别为：lpg/ml、2 ? 5pg/ml、10pg/ml;
[OO38] 褪黑素母液稀释至100pg/ml得溶液A;
[0039] QC(H):取100yl溶液A，用稀释液1定容至lml;
[0040] QC(M):取25yl溶液A，用稀释液1定容至lml;
[0041 ] QC(L):取10yl溶液A，用稀释液1定容至lml。
[0042]本发明方法具准确度高、重现性好，稳定、可靠的特点。褪黑素的精密度及加标回 收率满足检测要求，可用于唾液中褪黑素的检测，且分析时间较短，4.2min内即可完成褪黑 素的检测，利于开展大批量样本检测，能够对人体褪黑素分泌变化进行实时监测，便于了解 睡眠障碍者的病情、观察人体昼夜节律分泌变化状况，并采取相应治疗措施。应用本试剂盒 检测唾液中褪黑素，前处理过程简单，分析时间短，灵敏度高、特异性强、准确性好。
【附图说明】
[0043]图1为褪黑素及内标d4-褪黑素标准品的总离子流色谱图；
[0044] 图2为唾液中褪黑素及内标d4-褪黑素的总离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0045] 为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述。
[0046] -种高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法，包括如下步骤：
[0047]采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中褪黑素，利用高效液相 色谱将褪黑素与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴， 标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算褪黑素的含量；
[0048] (1)具体色谱条件为：
[0049] 流动相A:体积比为0.05 %的甲酸水；
[0050] 流动相B:甲醇，纯度为色谱纯，浓度为100% ;
[0051] 色谱柱型号：Phenomenex Kinetex_C18,50X2.
[0052]采用梯度洗脱的方式，见表1;
[0053] 流速为0.2ml/min，柱温为40°C，进样体积为20iil;
[0054]表1流动相梯度洗脱参数
[0056] (2)质谱条件：
[0057]在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾电压为 5000V;碰撞气为5;气帘气为10;离子源气流GS1为60，GS2为60;离子源温度为450°C ;检测离 子对(m/z):褪黑素(233.2/174.1)、内标d4-褪黑素(237.1/178.2);褪黑素及内标的去簇电 压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2;
[0058]表2褪黑素及内标的质谱参数
[0060] 所述经预处理的唾液按照如下方法制备得到：取唾液500iil于2ml离心管中，加入 10y 1内标溶液(50ng/ml)混匀后加入100ylNaOH( lmo 1 /I)溶液和lml萃取液(正己烷：乙酸乙 酯=1:1)，祸旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800iil;氮气吹干（40~50°C )，以 lOOlillO %甲醇水复溶，祸旋3min; 13000r/min，离心3min，进样检测。所述内标溶液配制:称 取褪黑素同位素内标，甲醇溶解后配制成lmg/ml的储备液用甲醇；用甲醇将储备液用甲醇 稀释至50ng/ml即得实验用内标溶液。
[0061] 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的试剂盒，所述试剂盒包括如下试 剂：
[0062] (1)洗脱液：
[0063] 洗脱液A:0.05%V/V甲酸水；
[0064]洗脱液B:甲醇(色谱纯）；
[0065] (2)标准品母液:褪黑素的甲醇溶液；
[0066] 配制:精确称取10mg褪黑素标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母液； [0067] (3)内标液:d4-褪黑素的甲醇溶液；
[0068] 配制:精确称取1 Omg d4-褪黑素的标准品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/m 1的母 液;用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液；
[0069] (4)稀释液：
[0070] 稀释液1:空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
[0071] 稀释液2:甲醇；
[0072]稀释液3:氢氧化钠溶液；
[0073] (5)萃取液：正己烷：乙酸乙酯= 1:1;
[0074] (6)质控品：褪黑素的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度 分别为：lpg/ml、2 ? 5pg/ml、10pg/ml;
[0075] 褪黑素母液稀释至100pg/ml得溶液A;
[0076] QC(H):取100yl溶液A，用稀释液1定容至lml;
[0077] QC(M):取25yl溶液A，用稀释液1定容至lml;
[0078] QC(L):取10yl溶液A，用稀释液1定容至lml;
[0079]所述试剂盒的组分如下表：
O'
[0082]具体实施例 [0083] 1、仪器及参数设置：
[0084]高效液相色谱仪(48；116111:1100)，色谱柱(50\2.11]1111，2.611111;1(;[116丨61菲罗门），流 动相为体积比为0.05%甲酸水和甲醇，柱温为40°(：，流速为20(^1.1]11]^1，分析时间为 4.2111；[11，液相条件为梯度洗脱（0~1.5111；[11，10%甲醇；1.5~2111；[11，10%~90%甲醇；2~ 4min，90% 甲醇；4~4.2min，90% ~10% 甲醇）。
[0085]质谱仪(4000Qtrap，AB公司），使用ESI源，在正离子条件下，检测模式为MRM。
[0086] 检测离子对(m/z):褪黑素（233.2/174.1);内标d4-M(237.1/178.2);
[0087] 气帘气（CUR)为10、碰撞气（CAD)为5、离子喷雾电压（IS)为5000V，温度为450°C， GS1为60，GS2为60。
[0088]褪黑素及内标的质谱参数
[0090] 2、唾液样本处理
[0091] 取唾液样本500yl，加内标溶液10yl，混合60s，加入100ylNa0H(lmol/l)溶液和lml 萃取液（正己烧：乙酸乙酯=1:1)，祸旋混合5min，以13000转/分离心10min，取上清800iil; 氮气吹干(40°C)，10%甲醇水lOOyl复溶，涡旋5min;以13000转/分离心3min，取上清进样。 标准品配制:准确称取褪黑素，用甲醇溶解后配制lmg/ml的储备液。依次稀释至所需浓度。 [0092] 方法验证
[0093] 1.总离子流色谱图：褪黑素及内标d4-褪黑素的标准品及唾液样品中的峰形对称， 基本没有杂质干扰，表明该条件能够用于褪黑素的定量分析。
[0094] 2.校准曲线:采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标的浓度比 为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，计算唾液中褪黑素的浓度。褪黑素在0.625 ~20pg/ml范围内线性较好，相关系数在0.99以上，满足定量要求。
[0095] 3.精密度试验：取500yr混合唾液基质，分别加入低、中、高浓度的标准品溶液，使 其理论浓度为1.25、5、10pg/ml，每个浓度平行做6个样本，得到精密度结果。
[0096] 4.回收率试验:取500yl混合唾液基质，分别加入0、低、中、高浓度的标准品溶液， 使其理论浓度0、1、2.5、5、10pg/ml，每个浓度平行做6个样本，重复操作3次。结果显示，唾液 褪黑素的加标回收率在90.2 %~103 %之间，3次重复试验的RSD在6.3%~13.4%范围内。 [0097]表3唾液基质中褪黑素的加样回收率(n = 6)
[0099] 现存检测方法(酶联免疫法、电化学发光免疫法)受到多种客观条件的影响，如温 度、pH值、离子强度、试剂免疫活性等。免疫法不可避免唾液基质中结构相似物质的干扰，灵 敏度低。不同厂家生产的试剂盒检测结果偏差较大，缺乏统一标准，导致检测结果参考性较 低。高效液相串联质谱技术将液相的分离功能与质谱的检测功能高效结合。唾液样本在分 析之前，采用液液萃取的方式进行净化处理，采用萃取剂（乙酸乙酯：正己烷=1:1)进行液 液萃取得到较纯净的样本。通过比较乙酸乙酯、正己烷及不同乙酸乙酯与正己烷比例(正己 烷：乙酸乙酯=1:1、3:7、7:3)混合后的提取效果，得到最佳的提取条件。建立液相色谱及质 谱条件，选择性能较好的色谱柱，以0.05%甲酸水和甲醇为流动相，采用梯度洗脱的方式， 使褪黑素与杂质较好分离;优化质谱条件，选择适宜的离子对m/z:褪黑素(233.2/174.1); 内标d4-M(237.1/178.2)，使褪黑素检测时灵敏度达到较高水平。样本在检测时，经过色谱 柱时被测物与杂质分离，之后进入质谱。定量时，采用内标法，减少误差的产生。通过分析色 谱图，对峰面积进行积分，代入标准曲线准确计算被测样本的浓度。总之，该法能够用于检 测唾液中褪黑素的含量，为临床提供可靠的检测方法。
[0100] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护 范围为准。
【主权项】
1. 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法，其特征在于，包括如下步骤： 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的唾液中褪黑素，利用高效液相色谱 将褪黑素与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准 品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算褪黑素的含量； (1) 具体色谱条件为： 流动相A:体积比为0.05 %的甲酸水； 流动相B:甲醇，纯度为色谱纯，浓度为100% ; 色谱柱型号：Phenomenex Kinetex_C18,50 X 2 · lmm，2 ·6μηι; 采用梯度洗脱的方式，见表1; 流速为〇. 2ml/min，柱温为40°C，进样体积为20μ1; 表1流动相梯度洗脱参数(2) 质谱条件： 在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式;喷雾电压为 5000V;碰撞气为5;气帘气为10;离子源气流GSl为60，GS2为60;离子源温度为450°C ;检测离 子对m/z:褪黑素233.2/174.1、内标d4-褪黑素237.1/178.2;褪黑素及内标的去簇电压、碰 撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表2; 表2褪黑素及内标的质谱参数2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的唾液按照如下方法制备得 至丨J:取唾液500μ1于2ml离心管中，加入50ng/ml的内标溶液10μ1混匀后加入lmol/1的NaOH溶 液100μΙ和Iml萃取液，祸旋混合5min，13000r/min离心10min，取上清800μ1;氮气吹干，以 100μΙ 10%甲醇水复溶，祸旋3min; 13000r/min，离心3min，进样检测。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述内标溶液配制：称取褪黑素同位素内 标，甲醇溶解后配制成lmg/ml的储备液用甲醇；用甲醇将储备液用甲醇稀释至50ng/ml即得 实验用内标溶液。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述萃取液为正己烷：乙酸乙酯为1:1的混 合液。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮气吹干温度为40~50°C。6. 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 包括如下试剂： (1) 洗脱液： 洗脱液A: 0.05 % V/V甲酸水； 洗脱液B:甲醇(色谱纯）； (2) 标准品母液:褪黑素的甲醇溶液； 配制:精确称取IOmg褪黑素标准品，用甲醇溶解定容至IOml，得lmg/ml的母液； (3) 内标液:d4-褪黑素的甲醇溶液； 配制：精确称取I Omg d4-褪黑素的标准品，用甲醇溶解定容至I Om 1，得Img/m 1的母液； 用甲醇依次稀释得50ng/ml的内标溶液； (4) 稀释液： 稀释液1:空白唾液基质溶液，将0.4g牛血清蛋白用水定容至IOml制得； 稀释液2:甲醇； 稀释液3:氢氧化钠溶液； (5) 萃取液:正己烷：乙酸乙酯= 1:1; (6) 质控品：褪黑素的空白唾液基质溶液，分低中高浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度分别 为：lpg/ml、2·5pg/ml、10pg/ml; 褪黑素母液稀释至I 〇〇pg/ml得溶液A; QC(H):取100μΙ溶液A，用稀释液1定容至Iml; QC(M):取25μ1溶液Α，用稀释液1定容至Iml; QC(L):取10μ1溶液A，用稀释液1定容至Iml。
【文档编号】G01N30/06GK105891364SQ201610220614
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】刘胜敏, 何健, 宋晓涛
【申请人】北京洛奇临床检验所股份有限公司