一种检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的方法

专利名称：：一种检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的方法
技术领域：
：本发明属分子生物学
技术领域：
，更具体地说，涉及一种新型检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法。
背景技术：
：近年来，儿童及成人恶性血液疾病发生率有逐年上升趋势，通过常规放化疗等治疗手段，3年生存率仅有40-60%,且难以完全治愈，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是唯一可以达到治愈的方法。目前，国内外移植例数逐年攀增，国内已开展造血干细胞移植的医院多达数十家。但allo-HSCT后的排异、复发却极大的影响了移植的成功率。移植的成功与否与移植后稳定的供受者嵌合状态的形成有着密切关系。因此，区分移植后造血干细胞的来源是评估移植成功与否的重要标志，并对判断原发病预后具有重要价值。在《ClinOncol》杂志2004年第22期"Increasingmixedchimerismisanimportantprognosticfactorforunfavorableoutcomeinchildrenwithacutelymphoblasticleukemiaafteralio—geneicstem—celltransplantation:possibleroleforpreemptiveimmunotherapy"—文中就指出，移植后动态监测供受者的嵌合率可以及早发现排斥、预防复发并及时干预，具有非常重要的意义。《中国输血杂志》2003年第16期"造血干细胞移植后植入证据检测方法的研究现状"一文指出，检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的经典方法有(l)血型；(2)红细胞同工酶;(3)性染色体核型分析;(4)HLA抗原；(5)限制性长度多态性;(6)可变串联重复序列VNTR;(7)微卫星重复序列(STR)等，都有其固有缺点。目前国际通行的检测嵌合率的方法是STR-PCR，它有高度可区别性、敏感性和相对快速等优点，但《Blood》杂志1991年第77期"Evaluationofmixedchimerismbyinvitroamplicationofdinucleotiderepeatsequencesusingthepolymerasechainreaction"——文指出，它只是——禾中半定量的方法，有PCR竞争及平台期结果偏倚的缺点，其PCR产物需进行进一步毛细管电泳，有产物污染的可能，灵敏度只可达到5-10%左右。这些缺陷使其难以检测微小残留病灶，且PCR产物电泳及测序分析成本较高，价格昂贵的遗传测序仪在临床上用途极局限，大多送往科研机构检测，国内难以普及开展。SNP(singlenucleotidepolymorphism),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有己知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，广泛用于群体遗传学和疾病相关基因的研究，将逐渐取代STR在法医鉴定、个体识别中的应用，成为新一代的分子遗传学标记。实时定量PCR(RQ—PCR)是一种将常规聚合酶链反应(PCR)与特异性的探针杂交技术融合的技术，它成功解决了常规PCR不能定量、扩增产物污染的假阳性、需要进行PCR后处理等问题，具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，且实时定量PCR仪可以进行白血病融合基因、甲基化、点突变及移植患者巨细胞病毒、真菌等定量检测，在血液科具有极高的临床应用价值。《Blood》杂志2002年第99期"Quantitativeassessmentofhematopoieticchimerismafterbonemarrowtransplantationbyreal-timequantitativepolymerasechainreaction"—文报道了RQ-PCR联合SNP检测移植后嵌合率的方法，较STR-PCR极大的提高了检测的灵敏度、准确性，但需利用供受者的细胞模拟供受嵌合进行倍比稀释建立标准曲线，这种方法建立的标准曲线需要利用大量的移植前的宝贵标本，操作繁琐，增加了检测成本及时间，并且降低了实验的稳定性。本发明利用质粒标准品建立标准曲线、进行绝对定量，质粒有性质稳定、易于保存、定量准确、可无限量扩增的优点，不浪费血样，极大提高了结果的准确性及可靠性。
发明内容本发明的目的是提供一种简便易行、节约成本的检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的新方法。为实现此目的，本发明采用了实时定量PCR技术(RQ-PCR)联合单核苷酸多态性(SNP)检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率，建立了含有目的基因和内参的质粒标准品倍比稀释的标准曲线，主要包括以下步骤(1)基因组DNA制备；(2)SNP位点选择及引物和探针设计；(3)PCR筛选供受者差异SNP位点；(4)目的基因及内参GAPDH质粒标准品及标准曲线的建立；(5)实时定量PCR检测；(6)供者嵌合率(DC)的计算；(7)方法准确性及敏感度验证。本发明的标准品构建模板为此SNP位点阳性的患者的定性PCR产物，将其克隆入T载体、构建质粒，倍比稀释后建立标准曲线。本发明的另一个目的，是利用18个SNP位点携带的大量遗传信息，将本系统应用于法医鉴定和个体识别，逐渐取代STR在法医鉴定、个体识别中的应用。本发明利于及早发现移植排斥、预防复发，指导临床治疗、提高移植的成功率，具有较高的灵敏度、稳定性及可操作性，质粒标准品性质稳定可靠、来源简单，不需要大量使用移植前的宝贵标本构建标准曲线；且供受者18个SNP位点PCR结果携带有大量遗传信息，可作为个体识别用途。本发明可替代目前通行的STP-PCR半定量检测方法，利用大多医院已购置的实时定量PCR仪进行嵌合率定量检测，且检测费用较为便宜，具有极高的临床应用前景。上述技术方案中，有关内容具体解释如下1.异基因造血干细胞移植(allo-PBSCT):就是在移植前用大剂量的化疗/放疗将病人血液中的肿瘤细胞最大限量杀死，同时抑制患者免疫与造血系统，然后将HLA配型相和的同种异基因供体造血干细胞通过静脉输入患者体内，达到重建病人的造血及免疫功能的目的。2.嵌合率(donorchimerismDC):移植后供者细胞所占总体的比例，以此判断供体细胞是否植入或被排斥，并与移植后常见并发症移植物抗宿主病(GVHD)有密切联系，可以指导临床增减免疫抑制剂的用量或进行供体淋巴细胞输注。3.聚合酶链反应(PCR):是一种体外扩增DNA片段的方法，具有特异、敏感、产率高、快速等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。4.实时定量PCR反应(RQ-PCR):是指在常规PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过己知拷贝数标准品所建立的标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。需要特定的实时定量PCR仪器完成。定量PCR反应的可行性定量一般是在PCR扩增指数期进行的。5.质粒标准品人工合成的包含有目的序列或内参序列的、已知拷贝数的质粒，质粒作为载体，具有性质稳定、定量准确、操作简便等优点，拷贝数=(质量+分子量)X6.023X1023。通常标准品倍比稀释3-5个点，构建一条标准曲线，用以对未知样品进行绝对定量。6.内参内参通常是e-actine、GAPDH等看家基因，在细胞中表达量或基因组中拷贝数恒定，受环境影响影响小，内参的定量结果代表了样本中总细胞或基因组含量，可以校正总细胞数、加样等误差。本发明中每位移植后患者都要进行目的SNP位点基因及内参基因两次PCR反应，用目的基因拷贝数/内参基因拷贝数进行最终嵌合率计算。下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。图1为18个SNP位点名称、位置、区别度及其引物、探针序列。图2为本实验结果与STR-PCR、荧光原位杂交(FISH)及特殊白血病融合基因结果比较(CC:完全嵌合；MC:部分嵌合)。图3为供受者寻找差异位点的定性PCR结果。两两左右泳道分别是移植前供受者相同引物的PCR产物，只有其中一个阳性的为可区别SNP位点，如图只有3/4道及13/14道供受者有一个阳性，即为可区别SNP位点，此引物及探针可作为该患者移植后嵌合率检测时的目的引物和探针。图4为供受者寻找差异位点的定量PCR结果。移植前供受者用同样SNP位点的引物行定量PCR反应，移植前供受者只有一个能够扩增，在定性PCR结果上，进一步验证此位点的弓I物及探针可用于下一步嵌合率定量检测。图5为模拟嵌合的实测值与理论值相关性比较结果，相关性高达R2>0.99。图6为方法的敏感性。倍比稀释建立模拟嵌合，本实验可重复敏感度为0.01%。此图为内参标准品2倍或10倍无限倍比稀释后的PCR扩增图，从左至右分别是100%、25%、12.5%、3.25%、1.6%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.01%,此次PCR扩增反应的阈值是22203.863795，扩增曲线与阈值交界点的横坐标即为此样品的CT值，据PCR2倍扩增原理，每倍比稀释2倍，CT值应减少lQi=2)，稀释10倍，CT值应减少3.33(2333=10)，同样比例倍比稀释的样品所扩增曲线与阈值交界点之间间距应该基本相等，PCR敏感性可达到0.01%。图7为某患者移植后嵌合率动态变化图及与STR-PCR同期比较结果。图8a为S01aSNP位点质粒标准品倍比稀释后的扩增曲线及所建立的标准曲线，图8b为内参GAPDH的质粒标准品倍比稀释后的扩增曲线及所建立的标准曲线，两者扩增效率基本一致，0.97259vs0.97173。余SNP位点标准曲线不再赘述。具体实施例方式1.标本处理及基因组DNA制备1.1裂红采集的EDTA抗凝血或骨髓标本一加入2-3ml裂红液(NH4Cl(1.5M)80g，KHC03(100nM)10g，Na4EDTA(10nM)3.7g，调节溶液pH值到7.2-7.4，加去离子水定容到1L，在制备工作液时，将此储存液稀释10倍后使用)一反复颠倒混匀一静置5min—离心1200rpm，5min—弃上清，再次加入裂红液重复一次一加入PBS2-3ml洗涤两遍离心后收集白细胞。1.2基因组DNA提取采用试剂盒常规盐析方法提取基因组DNA(U-gene，安徽)，分光光度计测取DNA纯度及浓度，纯度保证OD值在1.7-2.0之间为宜，-20^冻存备用。细胞数极低的采用Chelex-lOO(Bio-Rad)方法(参见《皖南医学院学报》1999年第18期"Chdex-100—步法快速提取外周血DNA")提取。详细步骤如下裂红后的白细胞加入200uL10%Chelex-100，充分混匀后一56。C保温30min—充分震荡一100°C煮沸8min，充分震荡一离心，13000rpm，5min—上清液中即含模板DNA。2.SNP位点选择及引物和探针设计我们选取了9条不同染色体上共18个SNP位点(见图1)，比如S01a在染色体的位置是17q(17号染色体长臂)，在人群中的区别度是23.6%，即此位点在人群中有23.6%机率可以成为相互差异位点，达到个体识别的用途。对应此位点的核酸序列，设计了上下游引物及一条探针(引物GGTACCGGGTCTCCACATGA,GGGAAAGTCACTCACCCMGG;探针CTGGGCCAGAATCTTGGTCCTCACA);S01a及S01b共用同一条下游引物及探针，S01b也在17号染色体长臂的位置，其引物序列GTACCGGGTCTCCACCAGG，GGGAAAGTCACTCACCCMGG;探针序列CTGGGCCAGMTCTTGGTCCTCACA;S02在Y染色体上，在人群中的区别度是36.4%，即此位点在人群中有36.4%机率可以成为相互差异位点，以达到个体识别的用途。同样地，对应此位点的核酸序列，设计了上下游两条引物及一条探针(引物GCTTCTCTGGTTGGAGTCACG，GCTTGCTGGCGGACCCT;探针CTGCACCACCAAATCATCCCCGTG)。位点选择原则①双等位基因突变；②至少有两个连续碱基突变；③在普通人群中有广泛异质性。一条引物特异性针对突变SNP位点，另一条针对公共序列。3.筛选供受者差异SNP位点普通PCR(见图3):移植前供受者分别进行18个SNP位点的普通PCR反应(与定量PCR使用同样扩增引物，见附图l)，反应在BimetraTGradientPCR仪中进行。每次均设阴性对照。PCR产物经凝胶电泳(2%琼脂糖，电泳25min)分析后筛出供受者单独阳性的、即可区别SNP位点，行定量PCRit—步验证。反应体系终浓度体积(ul)模板DNA50-100ng3.4引物200nM1.6(Forward+Reverse)2XPre-MIX(包含酶、IX10Mg2+、dNTPs、Buffer)双蒸水(补充体积)总体积20反应条件:温度时间预变性95。C2min变性95。C10s35个循环退火60°C30s延伸72°C30s最终延伸72°C5min定量PCR(见图4):加入序列特异性的探针对候选SNP位点行定量PCR反应进一步验证，如某一SNP位点仅有移植前供者或受者能扩增，即确定为此对供受者目的SNP位点。总反应体积20ul，反应在ABI7500实时定量PCR仪中进行。每次均设阴性对照(未加模板DNA，双蒸水补充)。反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4.标准品及标准曲线的建立我们分别构建18个含有待区别的SNP位点基因的质粒首先在NCBI数据库中根据每对SNP位点上下游引物位置确定此SNP位点PCR产物大小一利用此SNP位点阳性患者的定性PCR产物为标准品的构建模板(如S01a位点，患者甲利用已设计好的S01a位点特异引物可以扩增出阳性片段，即利用此PCR产物作为S01a位点质粒标准品构建模板)一PCR产物行2%琼脂糖电泳，30min—紫外灯下目的条带胶回收(回收产物即包含S01a位点目的基因序列，按常规胶回收试剂盒操作)一通过T4连接酶与T载体(商品化购买，TAKARA，大连)连接(16°C过夜)，将其插入T载体中一连接产物进一步经DH5A大肠杆菌感受态转化、蓝白斑筛选挑出单克隆菌后摇菌扩增一首先行PCR反应进行验证(引物同图lS01a位点)一阳性的行质粒小抽(按试剂盒常规方法提取)一最终测序验证，并测其浓度，据分子量计算出拷贝数，倍比稀释成数量级在107103，至少稀释3个数量级才能建立标准曲线，稀释数量级越多曲线建立越可靠。每批的阈值水平设在对数增长期并且高于非特异扩增。我们分别构建了内参及各SNP位点的质粒标准品，多次定量PCR反应后发现其扩增效率基本一致(图8a和图8b)，所以也可仅利用内参GAPDH—条标准曲线来计算两者的拷贝数。5.实时定量PCR检测反应体系和条件同上表，使用表达恒定的内参GAPDH校正误差，设双副孔，每次反应均包括移植前供/受者(如此SNP位点在移植前供者扩增阳性，受者阴性，则测未知样品嵌合率时，要包含移植前供者)、5梯度标准品和阴性对照。反应管排列设计如下(顺序可不同，操作熟练之后可不设副孔)标准品e7(内参GAPDH)标准品e7(内参GAPDH)移植前供或受者(目的基因)移植前供或受者(目的基因)标准品e6(内参GAPDH)标准品e6(内参GAPDH)移植前供或受者(内参GAPDH)移植前供或受者(内参GAPDH)标准品e5(内参GAPDH)标准品e5(内参GAPDH)待测样品(目的基因)待测样品(目的基因)标准品e4(内参GAPDH)标准品e4(内参GAPDH)待测样品(内参GAPDH)待测样品(内参GAPDH)标准品e3(内参GAPDH)标准品e3(内参GAPDH)阴性对照(无模板)6.供者嵌合率(DC)的计算利用标本的Ct值及标准曲线计算出各标本SNP位点及内参的拷贝数，副孔取平均值。如内参拷贝数^3X103，即认为该标本可用。拷贝数<500样品均进行第2次扩增。DC(%)=此SNP位点拷贝数/GAPDH拷贝数_xl00%移植前供者(或受者)SNP位点拷贝数/移植前GAPDH拷贝数7.方法准确性及敏感度验证将一对已知差异SNP位点的供受者移植前标本计数，用供者细胞对受者按比例稀释，使受者细胞分别占100%、80%、40%......0.01%、0.001%，建立模拟嵌合，利用差异SNP位点进行定量PCR反应测得嵌合率，与理论值进行对比验证(图5、图6)。图7是通过STR-PCR及本发明之方法对一异基因移植后患者供受嵌合率动态监测的结果。利用内参质粒标准品扩增的17次标准曲线，平均斜率为-3.39(-3.22-3.65)，平均截距为39.97(37.3343.19)，相关系数均大于0.995，批内差及批间差均在可控范围。利用图1提供的18对SNP引物，几乎每一对移植前供受者均能找到相互差异的位点。对模拟嵌合细胞进行嵌合率定量检测，多次结果与理论值相关性很好，R2>0.99(图5)，方法可重复敏感度为0.01%(图6)。部分患者同时进行了STR-PCR、XY-FISH及融合基因的定量结果，相关性很好(比较结果见图2)。以上结果均证明，本发明所建立的方法是准确、可靠、简便、易行的，适宜于临床推广。另外，实施方式第2、3步采用的供受者18个SNP位点PCR结果携带有大量遗传信息，可作为个体识别用途。在本研究中51对移植供受者通过此18个SNP位点相互识别率可达到96.1。/。(49/51)，说明上述18个SNP位点为中高信息量位点，适用于法医学个体识别，可作为当前STR系统的重要补充。1权利要求1、一种检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法，该方法包括以下步骤(1)基因组DNA制备；(2)SNP位点选择及引物和探针设计；(3)筛选供受者差异SNP位点；(4)质粒标准品及标准曲线的建立；(5)实时定量PCR检测；(6)供者嵌合率的计算。2、根据权利要求1所述的检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法，其特征在于所述标准曲线是利用含有供受区别SNP位点基因和内参的质粒标准品经倍比稀释后建立的。3、根据权利要求1所述的检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法，其特征在于所述标准曲线是利用含有内参的质粒标准品经倍比稀释后建立的。4、根据权利要求1或2或3所述的检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法，其特征在于所述倍比稀释拷贝数数量级是107103。5、根据权利要求1所述检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率的方法，其中所述SNP位点系统在法医学个体识别中的应用。全文摘要本发明采用了实时定量PCR技术(RQ-PCR)联合单核苷酸多态性(SNP)检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率，建立了含有目的基因和内参的质粒标准品倍比稀释的标准曲线，标准品构建模板为此SNP位点阳性的患者的定性PCR产物，将其克隆入T载体、构建质粒，倍比稀释后建立标准曲线。本发明提供的新方法利于及早发现排斥、预防复发，提高移植的成功率，具有较高的灵敏度和稳定性，不需要大量消耗移植前的宝贵标本，且可以作为个体识别的用途。本发明可替代目前通行的STP-PCR半定量检测方法，利用大多医院已购置的实时定量PCR仪进行嵌合率定量检测，准确、简便、快速、成本较低。文档编号C12Q1/68GK101575643SQ200910052260公开日2009年11月11日申请日期2009年5月31日优先权日2009年5月31日发明者王健民,宇邵申请人:中国人民解放军第二军医大学