专利名称：粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgG Fab片段及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及粉尘螨2类变应原(Der f2)人源抗体IgG Fab 片段及其编码基因，及其制备方法与用途。
背景技术：
哮喘是一种常见的慢性气道病变，难以根治，急性哮喘发作的治疗主要在于控制 症状并减轻炎症反应，而大多数的中重度哮喘患者需要接受长期的治疗以控制病情。因此， 哮喘患者不仅要负担昂贵的治疗费用，更要承受由于哮喘的反复发作而导致的失眠、倦怠、 日常活动受限而引起的一系列包括心理健康、丧失学习工作能力在内的社会问题，从而对 个人、家庭及社会造成极大的负担。过敏性哮喘已是危害严重的公共卫生问题，其发病率及死亡率呈持续上升趋势。 据WHO估计，全世界现有3亿的哮喘患者，其中50%以上的成人和至少80%的儿童患者均 由过敏因素诱发，每年有25万以上的患者死于哮喘，哮喘已不仅是发达国家的公共卫生问 题，几乎所有国家都深受其害。我国大陆哮喘的发病率尚较低，为2. 1% (不包括香港6. 2% 和台湾2. 6% )，但哮喘的发病在国内各地区之间的差异可达10倍，以重庆最高，西藏最低， 并且在未来十年内，哮喘的发病将持续上升，由于我国人口基数大，哮喘的发病率上升2个 百分点，将增加2千万以上的发病人数。过敏性哮喘的病因复杂，除了复合多基因式遗传外，出生前后与环境变应原的接 触也至关重要。鉴于有17. 6%的新生儿具发生变态反应性疾病的危险性，因此采用积极的 措施阻断婴儿出生前后与环境变应原的接触至关重要。WHO早在1999年就提出儿童变应性 疾病的三级预防理论并呼吁一级预防应成为今后研究的重点。一级预防即致敏前的预防， 亦称产前预防，目的在于阻断IgE抗体的产生，主要策略是提高母体变应原特异的IgG抗体 水平，如孕期接触高剂量的变应原或以变应原主动免疫母体可能有效；二级预防是阻断新 生儿致敏后病症的发展，特别重要的是防止病症向变应性皮炎、哮喘等方向发展，主要通过 非特异性免疫手段调控Thl/Th2免疫通路；三级预防则是对已经变应性哮喘等变应性疾病 的患儿进行治疗干预，将Th2应答转化为Thl应答，并防止单一变应原过敏发展为多重变应 原过敏。目前已有人源化抗IgE单抗rhuMAb-E25(商品名Omalizumab)于2003年获FDA 批准问世，主要以高亲和力、非抗原特异性结合血清中游离的IgE，降低血清游离IgE水平， 阻断IgE与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面Fc ε RI的结合以阻断后续反应而达到治疗作用。 对于已经结合在致敏靶细胞表面的IgE，rhuMAb-E25不能发挥作用，因此主要用于中重度 哮喘的治疗以改善患者的临床症状。目前应用较广泛的变应原特异的免疫治疗(SIT)，主要 针对已经发展成变应性疾病的患者，达到减轻症状、减少激素用量、改善气道高反应状态， 并有助于防止单一过敏向多重过敏发展，从而起到三级预防的作用。那么，如何实现WHO提 出的一级、二级预防呢？从免疫学角度考虑，若能提高母体变应原特异的IgG水平，IgG抗 体可作为封闭抗体与母体中的变应原结合，阻断变应原进入胎儿，或使IgG抗体间接进入胎儿可有效阻止胎儿今后产生变应原特异的IgE抗体及进一步发展成变应性疾病。目前已 有越来越多的证据表明母体变应原特异的IgG可有效保护后代产生过敏症状，但具体机制 尚不明确，变应原特异的IgG可能通过抗体本身，或形成抗原抗体复合物促进吞噬，或抑制 B细胞功能，或调节胎儿免疫应答等发挥其保护作用。随着抗体库技术的日益成熟，体外制备针对任何抗原的全人抗体已不再是梦想， “治疗性抗体”飞速发展并逐渐成为变应性哮喘治疗的另一有力武器。
发明内容
本发明的目的在于提供粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片 段及其编码基因和药物用途。本发明选择引起过敏性哮喘的常见变应原——粉尘螨2类变应原，并利用基因工 程抗体技术制备完全人源的变应原特异的IgG Fab片段，若用于孕妇，可提高孕期母体变应 原特异的IgG水平，阻断母体变应原进入胎儿使之致敏，实现一级预防；或使IgG Fab片段 间接进入胎儿，抑制新生儿产生变应原特异的IgE抗体，实现一级或二级预防作用。此外， 对于已经致敏或发生变应性哮喘的儿童或成人，IgG抗体Fab片段可与IgE竞争与变应原 的结合，阻断IgE的桥联及致敏靶细胞的脱颗粒，达到减轻变应性哮喘症状的作用即所谓 的三级预防。利用抗体库技术制备的人源单抗还可在体外进行链替换等改造以提高抗体的 亲和力或进行全长化改造以延长半衰期，从而有望长期而安全的用于临床过敏性哮喘及其 他相关过敏性疾病的预防。本发明所述的人源单抗Fab片段选自健康人免疫球蛋白G基因文库并与人抗尘螨 免疫球蛋白G基因文库进行链替换改造后获得。本发明提供了能与粉尘螨2类变应原(Der f2)特异结合的人源单抗IgG Fab片 段及其编码基因，然而产生本发明的基因序列的方法不受特别的限制。所述的与粉尘螨2类变应原(Der f2)特异结合的人源单抗IgG Fab片段的编码 基因，包括重链V区和轻链V区，含有序列1和17的核苷酸序列。所述的重链V区含有序列2的氨基酸序列；上述的重链 V 区由由互补决定区(complementarity-determining region, CDR) 和框架区FR(framework region, FR)构成，所述CDR含有序列4、6和8的氨基酸序列；所述 的FR含有序列10、12、14和16的氨基酸序列。所述的轻链V区含有序列18的氨基酸序列；上述的轻链V区由互补决定区⑶R和框架区FR构成，所述⑶R含有序列20、22和 24的氨基酸序列；所述的FR含有序列26、28、30和32的氨基酸序列。含有编码本发明的粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片段基 因的质粒载体构成了本发明的一个部分。本发明提供了一种质粒载体，含有编码所述的重链V区的DNA和所述的轻链V区 的DNA，它能插入编码本发明的粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片段 的基因。本发明的质粒不受特别限制，优选pFab-Hi s2。表达本发明的粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片段的宿主 细胞构成了本发明的一个部分。
本发明提供了一种大肠杆菌JM109感受态细胞为宿主细胞，它能表达本发明的粉 尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片段。本发明的宿主细胞不受特别的 限制。本发明通过构建人免疫球蛋白G基因文库并经过克隆印迹法、ELISA、测序分析等 从所述基因文库中筛选得到1个具有结合粉尘螨2类变应原的人源单抗IgG Fab片段，命 名AMIL-Hsh，而后进行了大量的表达纯化及进一步的鉴定。在本发明的实施例中，筛选能表达粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗 IgGFab片段的质粒载体的方法不受特别的限制，可通过例如免疫印迹、ELISA等进行选择。本发明的实施例中，纯化粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片 段的方法不受特别的限制，但首选方法是通过表达蛋白上携带的6XHis Tag经Ni-NTA柱 纯化。本发明所制备的单克隆抗体鉴定的方法不受特别限制，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、 Western blotting 等。本发明的另一个目的在于提供含有如前所述的Fab片段为活性成分的药物组合 物。所述的抗体Fab片段可用于制备防治尘螨过敏性哮喘的抗体药物。动物源性单克隆抗体制备技术虽已普及，但应用于与人体时可引起人抗异源蛋白 的发应，虽可通过抗体人源化技术得以改进，但过程繁杂，耗时耗力，短期难以取得成效。本 发明获得粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片段，并可进一步进行全长 化改造以延长半衰期，有望长期而安全的用于临床过敏性哮喘及其他相关过敏性疾病的预 防。
图 1 质粒载体 pFabl_His2。图2阳性克隆AMlL-Hsh的重链编码基因及氨基酸序列。图3阳性克隆AMlL-Hsh重链可变区CDR、FR划分。图4阳性克隆AMlL-Hsh的轻链编码基因及氨基酸序列。图5阳性克隆AMlL-Hsh轻链可变区CDR、FR划分。图6阳性克隆表达产物AMlL-Hsh提纯后10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中，M. Precision Plus Protein Standard ；A、B和C分别为阳性克隆经镍离子亲和层析纯化后的Fab片段。图 7AM1L-Hsh 纯化 Fab 片段 Western Blot 检测其中A.与HRP标记的鼠抗人κ的抗体(1 250稀释)反应B.用HRP标记的鼠抗人His的抗体(1 500稀释)反应。图8AM1L-Hsh纯化Fab片段与抗原反应的Dot blotting检测。图 9AM1L-Hsh 的 Fab 片段与 rDer f2 的 ELISA 结果。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需 要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本 文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
具体实施例方式
实施例1.抗体库的构建 选择近2个月未患感冒等感染性疾病的知情健康人(无变应性疾病病史且未进行 变应原免疫)300 名，各取抗凝外周血 2ml，以 Ficoll-Paque (Pharmacia，Uppsala, Sweden) 分离淋巴细胞，以试剂盒(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)提取总RNA。将总RNA用Gene-Amp RNA PCR 试剂盒(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn)以 Oligo (dT) 16 逆转录成 cDNA，并 以人IgG轻重链可变区保守序列的上、下游引物(Invitrogen)(表1)进行免疫球蛋白Y、 κ、λ链基因的PCR扩增。PCR产物经试剂盒(QIAGEN GmbH, Hilden，Germany)提纯后， 分别以AscI和NheI (NEW ENGLAND BioLabs)双酶切κ链和λ链产物。酶切后的κ链 和λ链产物与人免疫球蛋白Fab表达载体pFab-His2(图1)连接，随后电转入大肠杆菌 JM109(Takara，中国大连)中，构成轻链库。分别以Sf il和NotI (NEW ENGLANDBioLabs)对 轻链库及Y链PCR产物进行酶切修饰，连接反应后，电转导入大肠杆菌JM109中，构成非依 赖性克隆滴度为9X IO8的人IgG抗体库。
表1人IgG轻重链可变区保守序列的上下游引物序列。
其中引物方向为5'至3'，下划线部分表示酶切位点，符号M代表核苷酸A或C; Y代表C或T ;W代表A或T ;R代表A或G ;H代表A或C或T ;S代表C或G ;K代表T或G。实施列2粉尘螨2类变应原(Derf2)的重组表达由尘螨引起的哮喘占变应性哮喘总数的70% -80%，尘螨已成为诱发变应性鼻 炎、哮喘等变应性疾病的重要元凶。粉尘螨2类变应原(Der f2)是最重要的尘螨变应原之 一，由肠道内皮细胞分泌，随着代谢产物排出体外，故在螨体内和代谢培养基中均能找到， 也是螨体及螨代谢培养基浸出液的主要有效成分，与病人血清IgE的结合率均大于80%。 尘螨2类变应原在天然粗抗原中的含量很低，从天然粗抗原中获得纯化的尘螨2类抗原技术繁琐，代价昂贵，很难满足抗体库筛选的需要。2类尘螨变应原为14KDa，含129个氨基 酸残基的可溶性非糖基化蛋白，可采用经典的大肠杆菌原核表达系统进行表达。有报道显 示原核表达的2类变应原与尘螨病人的血清IgE的反应性与天然变应原相当，可能比真核 表达的变应原更好地反映血清抗体与抗原特异性结合的真实水平。本发明首先提取尘螨 总RNA，以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增粉尘螨2类变应原基因，该基因片段经过 Nde I和Xho I酶切纯化后，与pET19b (Novagen)载体相连接，转化入大肠杆菌JM109中， 将获得的阳性克隆进行序列分析，将正确序列的质粒转入表达宿主菌BL21star(DE3)plysS 感受态细胞(Novagen)，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海生工)诱导表达，提 取包涵体蛋白，并进行蛋白复性(根据Novagen的包涵体蛋白提纯方法)，其预计分子量为 16. 9kDa。提纯的重组蛋白分别用ELISA及Dot Blotting方法，以尘螨变应性哮喘患者血 清及对照血清检测重组蛋白的特异性和敏感性，结果表明该重组蛋白可被尘螨变应性哮喘 患者的血清特异识别，具有特异免疫反应性，可做为抗体库筛选所需的靶的抗原。实施例3.粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的阳性克隆的筛选取9X IO8的非依赖性克隆滴度的抗体库DNA 10ng，转化ΙΟΟμΙ JM109大肠杆菌， ^Hf菌液涂布在Luria broth (10g sodii chloridum, IOg tryptone, 5g yeast extract/L, PH 7)平板(含氨苄青霉素50yg/ml)上，37°C培养7小时，待克隆(约5X IO3个克隆/90mm直 径平板)直径为0. 1 0. 3mm左右时，以直径为82mm硝酸纤维素膜(Armacia/Pharmacia) 覆于平板上，待克隆完全转移至膜上，将膜置于含l.OmM IPTG的LB平板上，30°C诱导表 达6小时，而后用溶菌酶、DNA酶和牛血清白蛋白(IOOmM Tris-HCl [pH 7], 150mMNaCl, 5mM MgCl2,1. 5% BSA, Img of DNase,40mg lysozyme/ml)对膜进行溶菌。经洗涤除去膜 上残留的细菌碎片等，以牛血清白蛋白(BSA)封闭，与250 μ g纯化的重组蛋白反应，随后 分别与阳性血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG Fc抗体(ICNPharmaceuticals， Aurora, Ohio)反应，显色(HRP-1000，Konica Co, Tokyo, Japan)。每次以 4 8 张膜进 行筛选，在膜上发现深染的克隆都作为候选阳性克隆，此为克隆印迹法。或从抗体库中 取IOng DNA,转化100 μ 1JM109大肠杆菌，挑取转化所得的每单个克隆至2ml含氨苄青 霉素的 super broth 培养基(30g tryptone, 20g yeast extract, 10g3_(N-morpholino) propanesulfonic acid [MOPS]/L，pH 7)中，待 0D6。。为 0. 6 0. 8 时加入 IPTG，使其最终浓 度为0. lmM，30°C诱导表达10 12小时，HOOOrpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入 100μ 1含ImM PMSF (苯甲基磺酰氟)的PBS，悬浮细菌，4°C进行超声粉碎，而后HOOOrpm 离心10分钟，取上清液，加入包被有0. 5 μ g重组蛋白/孔的酶标板上，进行酶联免疫反 应，以 HRP 标记的抗人 IgG Fab (ICN Pharmaceuticals, Aurora, Ohio)为二抗，以邻苯二胺 (o-phenylenediamin, 0PD)显色。每块酶标板上均加入阳性血清为阳性对照，一旦OD49tl读 数高于一定数值即为阳性。将克隆印迹法或ELISA筛选所得的阳性克隆挑入25ml含氨苄青霉素的的SB培 养液中，37°C培养至OD600为0. 6 0. 8时，加入IPTG，使其最终浓度为0. lmM，30°C诱导表 达10 12小时，14000rpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入500 μ 1含ImM PMSF的 PBS，悬浮细菌，4°C进行超声粉碎，而后HOOOrpm离心10分钟，取上清液，加入每孔包被有 0.5yg重组蛋白或其他无关蛋白如重组溶组织内阿米巴150kDa表面蛋白等的酶标板上， 进行酶联免疫反应，以HRP标记的抗人IgG Fab为二抗，以邻苯二胺(o-phenylenediamin，0PD)显色。当重组蛋白与其他无关蛋白的OD49tl读数有显著性差别时，即为阳性克隆。累计筛选约1. 28X IO6个克隆，获得1个反应性增强的特异性阳性克隆AMlL_Hsh。实施例4.阳性克隆Fab片段的特性分析取阳性克隆AMlL-Hsh的质粒，分别以AscI-NdeI和SfiI-NotI限制性内 切酶酶切，获得轻链和重链基因，再与经酶切修饰的测序载体CV-2和CV-I连接， 转化大肠杆菌JM109，分别提取含轻链或重链基因的质粒DNA，以M13ReVerSe弓丨物 (5' -GGATAACAATTTCACACAGG-3‘)，进行测序，测序工作由由Invitrogen公司完成。并以 VectorNTI 10软件推算氨基酸序列(图2，4)，以IgBlast进行同源性分析(表2)，并根据 Kabat系统对AMlL-Hsh的轻链可变区和重链可变区的CDR、FR进行划分(图3，5)由于Fab抗体含有6个His-Tag，且重链与His相连，故选用His结合树脂 (Novagen,Madison,Wis.)进行提纯。阳性克隆进行大量培养和诱导表达后，收集细菌，进行 溶菌和超声粉碎，离心取上清液进行纯化。以IM咪唑溶出纯化的Fab片段，以DC Protein Assay(BioRad)测定蛋白含量，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检 测其纯度(图6)。同时以Western blot检测Fab抗体重轻链的完整性(图7)。纯化后的阳性克隆Fab片段分别以ELISA和Dot-bloting检测与rDer f2变应原 的反应性。ELISA结果(图9)显示提高Fab片段的含量可显著提高Fab片段与重组抗原的 反应性，以10 μ g组的反应性最高。Dot-bloting检测(图8)显示AMlL-Hsh与rDer f2、 rDerp2均具有极强的反应性，AMlL-Hsh与天然粗抗原的反应性较弱。纯化的抗体以Biocore3000 (Biocore AB, Uppsala Sweden)检测其亲和力，分别以 纯化的重组变应原rDer f2和重组变应原rDer p2包被后，以浓度为2. 5 μ g/ml, 1. 25 μ g/ ml，0· 625 μ g/ml，0· 3125 μ g/ml的Fab抗体片段与其进行反应，以BIAevalution3. 1软件求 出结合率(KA)和解离率(KD)。结果显示Fab片段AMlL-Hsh与重组变应原rDer p2的结合 力高于重组变应原rDer f2。AMlL-Hsh与重组变应原rDer f2的结合常数为4. 8X 108，解 离常数为1. 34X 10_9 ；AMlL-Hsh与重组变应原rDer p2的结合常数为3. 2 X IO8,解离常数为 1. 27 XlCT9 (表 3)。取5% 的肥大细胞悬液 50 μ 1，与 50 μ 1 Fab (10 μ g) ,50 μ 1 rDer f2 或 rDer ρ 2 (1 μ g，5 μ g)及1 50稀释的病人血清混合半小时后于显微镜下观察肥大细胞脱颗粒情 况，以无关的Fab作为对照。同样的实验重复两次。计算各反应组三次实验结果的平均数 和标准差，进行t检验。以CP33反应组做为无关Fab对照，计算AMlL-Hsh对肥大细胞脱颗 粒的抑制率。结果显示在1 μ g、5 μ g rDer f2抗原作用下，AMlL-Hsh单抗对肥大细胞脱 颗粒的抑制率分别为66. 8%和65.9%。rDer p2抗原的结果与此类似。上述结果表明Fab 片段具有较明显的抑制尘螨变应原与结合于肥大细胞表面的变应性疾病患者血清IgE的 结合，起到竞争性抑制抗原结合的作用(表4)。表2是阳性克隆AMlL-Hsh的同源性分析。表3是抗尘螨Fab片段AMlL-Hsh对rDer f2和rDer p2的亲和力比较。表4是AMlL-Hsh的Fab片段的肥大细胞脱颗粒百分率。表2 SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>粉尘螨2类变应原(Der f2)特异的人源单抗IgG Fab片段的制备与用途<130><160>32<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>678<212>DNA<213> 人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1). . (354)<400>1cag gtg cag eta cag gag tgg ggc cca gga ctg gtg aag cct tea cag 48Gin Val Gin Leu Gin Glu Trp Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin
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权利要求
一种粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgG Fab片段，包括重链V区和轻链V区，其特征是含有序列1和17的核苷酸序列，命名为AM1L Hsh。
2.按权利要求1所述的粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgGFab片段，其特征是所 述的粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgG Fab片段选自天然的人源抗体基因库。
3.按权利要求1所述的粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgGFab片段，其特征是所 述的重链V区含有序列2的氨基酸序列。
4.按权利要求3所述的粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgGFab片段，其特征是所 述的重链V区由互补决定区⑶R和框架区FR构成，所述⑶R含有序列4、6和8的氨基酸序 列；所述的FR含有序列10、12、14和16的氨基酸序列。
5.按权利要求1所述的粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgGFab片段，其特征是所 述的轻链V区含有序列18的氨基酸序列。
6.按权利要求5所述的粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgGFab片段，其特征是所 述的轻链V区由互补决定区CDR和框架区FR构成，所述CDR含有序列20、22和24的氨基 酸序列；所述的FR含有序列26、28、30和32的氨基酸序列。
7.—种表达载体，其特征是含有编码权利要求3所述的重链V区的DNA。
8.—种表达载体，其特征是含有编码权利要求5所述的轻链V区的DNA。
9.按权利要求7或8表达载体，其中所述的表达载体是一种质粒，选自pFab-His2。
10.一种含有权利要求7或8所述的表达载体的宿主细胞。
11.基于权利要求10，所述的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或真核细胞。
12.基于权利要求11，所述的宿主细胞是大肠杆菌JM109。
13.一种粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgG Fab片段的制备方法，其特征是包括下 述步骤通过构建人源抗体基因库并经过ELISA、测序分析、肥大细胞脱颗粒抑制试验等多种 筛选验证方法，从所构建的人源抗体基因库中筛选得到粉尘螨2类变应原特异的人源单抗 IgG Fab片段后，进行表达纯化及抗凝活性测定。
14.一种药物组合物，其特征是含有如上所述的Fab片段为活性成分。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及粉尘螨2类变应原特异的人源单抗IgG Fab片段，本发明通过构建人源免疫球蛋白G基因文库并经过克隆印迹法、ELISA从库中筛选到粉尘螨2类变应原特异人源单IgG Fab片段，经表达纯化及鉴定，证实所述的人源单抗IgG Fab片段能特异性识别尘螨2类变应原并与之具有较高的亲和力，同时可与尘螨粗抗原特异性识别。肥大细胞脱颗粒抑制实验显示所述片段具有明显的抑制尘螨变应原与结合于肥大细胞表面的变应性疾病患者血清IgE的结合，起到竞争性抑制抗原结合的作用。可通过所述的Fab抗体片段对变应性哮喘的患儿进行早期预防，进一步制备防治变应性哮喘的药物组合物。
文档编号C12N15/63GK101891816SQ20091005187
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者付永锋, 橘裕司, 程训佳, 邵红霞 申请人:复旦大学