专利名称：：人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和其编码多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗HAbl8G/CD147的人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和由所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要杀手之一。据世界卫生组织(WHO)年度报道，2005年全球有760万入死于恶性肿瘤(癌症)。近年来，癌症的病因与临床诊治研究有较大的进展，但癌症的死亡率仍然没有得到有效的遏制。癌症是一种基因病，其发生与演进涉及多个基因并经过多个不同的阶段，与细胞分化、细胞周期调控、凋亡、血管生成和转移相关的多种途径的调节紊乱有关。一方面临床应用传统的癌组织学诊断方法，用癌组织分级和类型、癌淋巴结转移(TNM)分级体系等指标，无法准确地进行早期诊断，难以评估临床预后，因此，对指导临床制定处理方案具有很大的局限性.另一方面，传统的癌手术，放疗，化疗也不能满足临床的需要。因此加快加强研究癌的诊断和治疗一直是人们迫切的要求.自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，它们在疾病诊治的基础研究和临床应用方面发挥了积极的作用，其中以单抗的研制为各种难治性肿瘤带来了新的希望。正是由于抗体药物特异性高，可针对特定靶点制备，应用于治疗自身免疫性疾病、心血管病、传染病、炎症，特别是肿瘤治疗，已成为当前全球生物药物领域研发的热点，年销售额超过百亿美元的"重磅炸弹药物"。至2007年美国FDA先后批准26种抗体药物上巿，有14个用于治疗结肠癌、乳腺癌、淋巴癌等实体肿瘤。如治疗淋巴瘤的抗体药物利妥昔单抗(rituximab)，单药治疗总反应率为50%，联合化疗有效率高达80%以上。抗体药物也可被用作传递药物的工具增强放化疗的疗效，很可能成为靶向和疗效最强的肿瘤特异性生物药物。与此同时，我国囯家药品监督管理局也加强了抗体药物审批力度，已有11种抗体药物批准上巿。尤其值得注意的是我国已有一些具有自主知识产权的抗体药物正在进行临床或者完成临床研究，等待批准上巿。目前，鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代，其主要原因是鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱；它与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱；鼠源抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC与CDC作用的时间较短；鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体反应(AAR)引起过敏反应。这样就严重阻碍了鼠单克隆抗体的进一步应用。为了解决这些问题，人源化抗体显示出了巨大的优势。目前，对鼠抗体人源化的构建方法即鼠抗体的人源化改造主要方法包括嵌合抗体、表面重塑抗体、重构抗体。嵌合抗体利用DM重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗^^仍然保留了30X的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应HAMA。表面重塑抗体对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响側链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区(CDR)构象的残基尽量不替换。重构抗体由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区(SDR)转移。CDR移植后的抗体也称改型抗体。Jone等于1986年在Nature上报道了他们关于CDR移植抗体的研究成果，将鼠单抗B1-8单抗V区中的互补决定区(CDR)序列取代与其自身框架区(FR)最为相似的人源抗体中相应CDR序列，开创了这种新方法。Zenapax(Daclizumab)是美国FDA批准的用该法产生使用于急性排异反应或顽固性哮喘的人源化单抗.在此基础上，Padlan等发现抗原抗体的相互作用主要由CDR区20%-334的氨基酸残基完成，这些区域在各个抗体之间差异很大，被称为特异性决定簇残基(specifitydeterminingresidues,SDRs)，与CDR移植相比，这种方法能最大限度地减少抗体的鼠源序列，并将序列移植对抗体活性的影响降到最低。另外是全人源化抗体完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛等。如用于类风湿疾病的adali咖mab和结肠癌治疗的panitumumab即为全人抗体。除上述提及方法外，此外我们还可见到框架区重塑(frameworkpatching),超级人源化(Superhumanization)等方法。这些方法大都和上述提及的方法类似。如超级人源化法和SDR移植法类似，即保留鼠源抗体的正则结构(canonicalstructures),而该结构对于维持亲本抗体的空间结构有着重要的作用。Tan等最先比较了人源和鼠源抗体，对可变区正则结构相近或相同的抗体，完全移植到相应的人源框架区，进一步降低了待改造抗体的免疫原性，功能实验表明，这种方法也能很好使抗原结合活性保持.2004年-2006年美国食品食品药品管理局(FDA)和欧洲药品评估局(EMEA)共批准上市的单抗药物中，90%以上是人源化抗体。在疾病乾向治疗的观念曰益突显的今天，抗体药物的应用范围正逐渐超出肿瘤和免疫性疾病；另外，随着新的疾病相关靶抗原被发现，治疗性抗体必将发挥越来越重要的作用；而抗体的人源化也会为其进一步的临床上推广应用扫除障碍，即对抗体进行人源化改造，一方面保持了抗体识别抗原的能力.另一方面，降低了鼠源性抗体的免疫原性，减少了人体针对鼠源性抗体产生的"人抗鼠抗体反应(HAMA)反应"，从而相应的提高了抗体在临床应用的安全性。目前在恶性肿瘤的诊断方面，FDA批准的生物诊断试剂主要分为4类l.血清癌标志物检测试剂盒。2.放射免疫显像试剂盒。3.免疫组织化学试剂盒。4.基因诊断试剂盒。血清学癌标志物检测试剂盒主要包括AFP(甲胎蛋白)的检测，用于诊断肝癌及睾丸癌，CEA(癌胚抗原)的检测，用于诊断肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等诊断，PSA(前列腺特异性抗原)的检测用于前列腺癌诊断等。放射免疫显像试剂盒主要包括CEA-Scan(Tc-99m标记的CEA抗体)，用于结肠癌、乳腺癌、肺癌的体内诊断；Nofetumobab(Tc-99m标记的40KD的癌相关抗原的抗体)用于小细胞肺癌的体内诊断；Oncoscint(Indium~lll标记的抗Tag-72的抗体B72.3)，用于结肠癌的体内诊断和Prostascint(Indium-Ill标记的抗PSMA)，用于前列腺癌的体内诊断。基因诊断试剂盒包括用荧光探针对组织中的her-2及尿液中的膀胱癌细胞的检测。免疫组织化学试剂盒主要是her-2检测试剂盒，用于her-2抗体药物应用前的判断指标。由此可以看出，目前国内外免疫组织化学试剂盒同类产品较少，暂还没有用HAbl8G/CD147这一癌标志物进行诊断试剂开发的产品.根据前期鼠源单抗HAbl8的研究结果显示，与其他癌标志物相比，HAbl8G/CD147更为广谱、阳性率更高，例如Her-2蛋白在乳腺癌的阳性表达仅有20%~40°/。，HAbl8G/CD147的阳性率为64.36%。因此HAbl8G/CD147的免疫诊断试剂的应用更广、敏感性更强。HAbl8G/CD147分子是第四军医大学细胞工程中心用肿瘤单抗HAbl8筛选人肝癌组织cDNA文库得到的CD147家族的新成员。分析HAbl8G/CD147分子作为乳腺癌和肝癌的肿瘤标志物在以下几个方面具有临床意义1)HAbl8G/CD147分子可作为癌的诊断标志物免疫组化结果显示，6HAbl8G/CD147在大多数癌组织，特别是上皮来源的癌组织中的表达阳性率很高，其阳性表达只限于癌细胞，背景清晰(间质均不着色)，无非特异性着色，并且，在正常组织表达很低，在良性肿瘤和良性病变组织均为阴性；经检测各类癌1553例，其中阳性检测率达到1035例，阳性率为66.64%;而239例正常组织中，阳性率仅占到5.18%，反映出HAbl8G/CD147分子对癌细胞具有很高的敏感性和特异性。这将对癌的诊断具有重要的临床意义。2)HAbl8G/CD147分子可作为癌早期诊断标志物免疫组化检测结果显示，HAM8G/CD147的阳性率在乳腺不典型增生(癌前病变)为27.23X(12/44);肝细胞不典型增生100%(6/6，)；胃癌肠上皮化生为72.92%(35/48)，这些表达阳性的不典型增生病变也可能已经具有癌变的基因水平改变，发现和诊断这些病变将大大提高癌的早期诊断率，使这部分患者得到早期治疗。3)Mbl8G/CD147分子可作为癌的组织学分级和预后预测标志物前期研究结果显示HAbl8G/CD147在乳腺的髓样癌，粘液癌不表达，在浸润性导管癌表达阳性率高。表达强度与组织分级相关(P=0.002)。同时分析了HAbl8G/CD147分子与其它几项(ER、PR、CerbB-2、p53、Ki67)指标的关系，HAbl8G/CD147分子表达与CerbB-2呈显著正相关(P-0.000)，与PR呈显著负相关(P-0.000);对106例临床病人进行随访，发现HAbl8G/CDl47的表达与病人的转移与复发、病人的生存密切相关(p-0.000)，说明HAbl8G/CD147可以用作预测乳腺癌预后不良的指标。而我们的前期研究也表明，HAM8G/CD147在高分化肝癌的表达明显的低于在低分化肝癌的表达，在肝癌肝移植术后其表达增髙预示着肝癌的复发。以上结果提示HAbl8G/CD147的表达强度对临床评估肿瘤的预后，制定个体化的治疗方案具有重要意义。
发明内容本发明的一个目的在于提供一个抗广谱肿瘤标志物HAbl8G/CD147的单克隆抗体的人源化单抗Hu-ScFv18重链可变区基因和轻链可变区基因；以便获得的由两个片断重组后表达出特异性识别和结合肿瘤标志物HAbl8G/CD147的抗体活性片段。本发明的另一目的在于所述的人源化单抗Hu-ScFv18重链可变区基因和轻链可变区基因和对应多肽在制备用于诊断和治疗肿瘤药物中的应用。根据本发明的一个方面，本发明提供一个抗肿瘤标志物HAbl8G/CD147单克隆抗体的人源化单抗Hu-ScFv18重链可变区基因和轻链可变区基因和其编码多肽。本发明的人源化单抗Hu-ScFv18重链和轻链可变区基因是从已有的鼠源性抗HAbl8G单抗的杂交瘤细胞株HAbl8中克隆的基因改造得到的，其中所述的重链可变区基因全长为357bp,其核苷酸序列如序列表中〈400〉1所示，其编码的多肽序列如序列表中<400>3所示。所述的轻链可变区基因全长为333bp,其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其编码的多肽序列如序列表中<400>4所示，上述两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合肝癌相关抗原HAbl8G的抗体活性片段。我们已有的研究显示，HAbl8G/CD147是一个通用型肿瘤广谱标志物，因此针对杂交瘤HAbl8分泌的抗HAM8G/CD147的单抗进行的人源化改造，所得到的人源化单抗Hu-ScFv18轻、重链可变区基因即可用于诊断和治疗肿瘤药物中应用。图l鼠源性HAbl8单抗VH和VL的结构拓扑图。图2鼠源性HAbl8单抗可变区突变位点的三维结构图。图3PCR产物的凝胶电泳图。图4重组质粒酵切鉴定的凝胶电泳图。图5人源化单抗Hu-ScFv18的细胞ELISA结果示意图。图6人源化单抗Hu-ScFv18的细胞免疫荧光结果示意图。图7人源化单抗Hu-ScFvl8的免疫组化结果示意图.具体实施例方式8鼠源性HAbl8单抗轻、重链可变区基因克隆所用细胞株为第四军医大学细胞工程研究中心釆用传统的融合方法获得的一株高亲和力、高特异性的鼠源性抗人肝细胞癌单抗HAb18杂交瘠细胞株《生物材料保藏证明生物材料的分类命名抗人肝癌单克隆抗体HAM8杂交癍细胞株，保藏单位中国傲生物菌种保藏管理委员会普通徵生物中心，地址中国北京中关村，保藏日期1999年12月6日，保藏编号CGMCCNO.0426),该抗体已通过了中国药品生物制品检定所的《人用鼠源性单克隆抗体射备及质量控制要点》的要求，其抗原为HAbl8G分子，其分泌的翁体分子亚型为IgGl。利用该细胞株提取总RNA，通过反转录和pca反应可扩纘鼠象性单拔H幼18轻、重链可变区基因。具体方法和结果已在下列文章和专利中公开该细胞株的建立可参见《单克隆抗体通讯》，1989;2:33-36，陈志南，刘參仿，杨继震等；该基因本发明人已经获得授权专利CN021144710。《HAt)18G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达>》，中国免疫学杂志，2歸3年7期。鼠豫性HAbl8单抗可变区序列和结构计算机分析本发明人利用基因序列翻译软件ORFfinder将鼠源的单抗HAblS重链可变区VH和轻链可变区VL的核酸序列(专利CN021144H0)进行翻译，同时根据抗体基因数据库Kabat、Abm、Chothia和Contact的规则标^翁;体的互补决定区CDR区和用矩形框表示的SDR区，"小星"(Stafs)代表在不病数据库中不同的CDR区(见表l)。表1鼠源性Mbl8单抗可变区序列及其分析HAbl8Vh^120舶VRSKAHfHA*#**Ksbst*…'…*w………《处匿………w…*…峰》…"…^……Cor^…………'m…"…脂………w80咖g:TESlT"RFTISRD"KSI"LQHR界LRAEDTGIYJCTIlf)SIATlH"QGT********KabatKabst-ContactContact^I恥WHAM8VLvI20切SNRR|TGVP***********Kabat、AbH、Chothia**,…*Kabat、AbK、-…""Contact……""Contacts,OKI*80咖KFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDA"FCJQft"SPFlTFGSGTKLEISRKPChothia*********Kabat、腿、Cho化ia-********Contacts………图w利用抗体胚系基因数据库VBase2的基因序列DNAPLOT对其核酸序列进行分析，确定了HAbl8VH使用了Igh-VJ606VH6家族V基因片段，VL使用了IGKV19/28家族V基因片段.同基因数据库Genbank的非冗余数据库nr做比对BlastP，组织来源分别选择人Homosapiens和小鼠Musmusculus两类。确定选择相似性得分最高的人源、鼠源抗体可变区序列各ioo条进行统计，查找鼠源序列中的差异残基，然后利用SWISS-MODEL对HAbl8可变区同源模建，对HAbl8的三维结构模建和结构分析即。最终获得从PDB中挑逸与HAbl8VH、VL相似性得分合计值最高的IO个抗体结构。利用结构数据库Swiss-Pdb10Viewer3.7的拟合功能将HAbl8VH、VL以该抗体结构为模板进行空间拼接，用软件Gromos96获得力场的计算能量值，将最小能量值的对接模型使用软件Discover进行分子力学优化，得到鼠HAM8可变区精确的三维模型。进一步分析抗体的可变区三维结构，可知HAbl8VH的同源模板为lWmH、lv7nK、ldlfH、lwzlH,同时VL的同源模板为lncdL、lncaL、liaiL、lztxL，选择具有73.3%相似性的lwzl作为拼接模板，结果经GR0M0S96力场优化后总能量为-8820.85KJ/Mo1。在Discover分子力学优化后，用Procheck检查得到G-factor值为0.13A，表示模型的各项指标在对应的统计学范围内。依据模建的三维模型计算鼠单抗可变区相对表面可及性、氢键作用，绘制结构拓扑图见阁l，其中方型框表示側链外露的残基；画形框表示表面可及性小于30%的残基；三角框表示参与VH-VL相互作用的残基；灰色表示差异残基；黑色表示差异残基中的异常残基；箭头表示分子内氧键(NH—0C)。初步决定突变侯选位点，CDR-FR连接处参与形成氢键的残基，以及在抗体框架区形成氪键保持球蛋白P片层结构的残基，对以上残基均予以保留。在此基础上检査CDR中非SDR残基，发现只有VL中CDR2的ThrL056外露面积为62.6%、且没有参与氢键作用，可以作为突变侯选位点。通过以上分析，将最终得到的侯选突变位点分为三类无风险位点、外側P片层位点、CDR区位点，具体见表2.通过观察HAbl8模型，发现候选的突变位点均分布在CDR对侧区和FR区上，远离CDR,见图2。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>再次使用Naccess以范德华半径为参数计算重链HAM8VH、轻链HAbl8VL和鼠单抗HAb18的相对表面可及性。利用软件Chimera中的键能分析工具FindHBond分析HAb18VH、VL分子内和分子间氢键相互作用。最终确定突变候选位点，最后通过类似的对突变产生的人源化抗体的模建与分析，获得能编码正确的抗体可变区的人源性VH与VL基因(见序列表).以同样的方法构建人源化抗体模型，使用Swiss-PdbViewer3.7将二者分子叠合，并计算得到RMSDallat咖为0.2lA，说明引入突变残基后并没有改变原鼠源抗体的CDR构象。人源化单抗Hu-ScFvl8轻、重链可变区序列的扩增和验证用重叠PCR(Over-lappingPCR)的方法，结合上面的鼠源性单抗HAbl8可变区序列和结构计算机分析，对潜在的免疫源性较强，但不影响抗体结构的侯选位点进行定点突变，从而获得人源化单抗Hu-ScFv18重链可变区序列。设计的人源化单抗Hu-ScFv18可变区基因PCR扩增IO条引物序列分别如下Partl引物P1-55ATGACCATGATTACGCCAAG3引物Pl-35AACACAAGACAGGCGCATAGATCCT3引物P2-55AGGATCtATGCGCCTGTCTTGTGTT3引物P2-35AGTGTCTTCAGTTCTTAAGTTG3引物P3-55CAACTTAAGAACTGAAGACACT3引物P3-35AGTAAGGATCCACCGCCACCCGAGCC3Part2引物P4-5.35CGGTGGATCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGTTCG3引物P4-5.25CGGTGGCGGTTCGAGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAC3引物P4-5.15ATGACCCAGACTCCCACAAGCCTGGTTGT3引物P4-35GATGTGCGGCCGCGCGTTTGATTTCCA3PCR扩增反应的具体步骤按常规方法进行，分别用上述各对引物扩增所需的基因'反应体系为模板2.5ul，dNTP(各0.4mM),10xBuffer5ul，ExTaqDNA聚合酶1.25u，5，端和3，端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul，混匀，瞬时离心后，加入l-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件94t:imin，54TClmin，72"Clmin，35个循环，最后72TC延伸10min。首先，以18-ScFv为模版(见本发明人文章和专利《HAM8G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达》，中国免疫学杂志，2003年7期；中国专利CN021144710)，分别扩增利用三对配对引物Pl-5/Pl-3，引物P2-5/P2-3，引物P3-5/P3-3获得产物Pl(图3，泳道2)，产物P2(图3，泳道3)，产物P3(图3，泳道4);将三个产物P1、P2、P3混合后，用配对引物Pl-5/P3-3再次扩增获得大约510pb的产物Partl(图3，泳道5)。随后再次用18-ScFv为模版，以引物P4-3/P4-5.1获得中间产物P4.1;再用纯化的中间产物P4.1为模版，以引物P4-3/P4-5.2获得产物P4.2;最后用纯化的P4.2为模版，以P4-3/P4-5.3获得产物Part2(图3，泳道6).将获得的两个片段基因Partl+Part2利用BamHl消化，连接，终产物直接用P4-3和Pl-5扩增，获得目标基因Hu-ScFv18，其理论大小870bp,(图3，泳道7箭头所示)。目的片段T载体克隆测序方案如下将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体lul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水lul,连接缓冲液5ul，混匀后4TC过夜，转化大肠杆菌JM109，條选重组克隆，然后釆用通用测序引物测序。突变后基因Hu-ScFv18放到T载体中测序验证正确后，通过分7I/AbfI双酶切放到表达载体pCANT-AB5e，I双酶切鉴定结果如图4所示其中克隆1-6均插入了Hu-ScFvl8序列；泳道7是鼠源的ScFvl8对照(ScFvl8/pCANT)，8是阴性对照。从这个结果可以发现克隆l-6均插入了正确的Hu-ScFv18。最后将克隆1的重组质粒转染大肠杆菌AcW/表达蛋白；表达蛋白可通过Ni-NTA层析柱富集纯化(按供应商法马西亚公司的标准步骤进行)。所获得蛋白可用Western-blot和免疫荧光检测表达蛋白的活性，进而验证所获得的人源性序列的可靠性。人源化单抗Hu-ScFv18可变区序列表达蛋白的活性验证将噬粒表达载体pCANT-AB5e利用Sfil/Notl进行双酶切，与本发明所克隆的人源化单抗Hu-ScFv18可变区序列的轻、重链可变区基因重组成可溶性Hu-ScFv18表达载体进行常规的原核表达并纯化.以正常人张氏肝细胞QSG-7701为阴性对照，肝癌细胞FHCC-98为样本，用间接ELISA检测表达产物-可溶性Hu-ScFvl8的活性。ELISA结果显示，表达产物能和肝癌细胞FHCC-98结合，但是不能与正常的肝细胞结合(见图5).这说明纯化产物获得了表达的Hu-ScFvl8小分子抗体。另外，以此表达的可溶性Hu-ScFvl8小分子抗体结合上述两种细胞的免疫荧光实验(见图6)，表明所表达的可溶性Hu-ScFv18小分子抗体可特异性结合在癌细胞的细胞膜上，而不结合到正常的肝细胞表面，这也间接的说明了表达的产物一Hu-ScFvl8具有一定的生物学活性。免疫组化试验结果示(见图7):Hu-ScFv18小分子抗体可与肝癌组织结合，而与正常肝组织不结合，表明该人源化单抗Hu-ScFvl8具有识别、结合肝细胞肝癌的能力，具有发展成为抗肝癌制剂的潜能。通过生物信息学，对该可溶性Hu-ScFvl8小分子抗体的性质预测如下组成氨基酸数目(Numberofaminoacids):256个；理论上的分子量(Molecularweight):27329.1;理论上的等电点(Theoreticalpi)::6.79;其中含有的阴性带电残基(Asp+Glu):22;阳性带电残基(Arg+Lys):21;最终分子式为C1195H1829N3390383S8，即总原子数3754个；N端序列起始于E(Glu).体内半衰期在网织红细胞估计约1.0小时，在酵母约30分钟；而在大肠杆菌至少大于IO.0小时。脂肪指数(AliphaticIndex)60.55.目前，肿瘤单抗应用方面的研究主要集中在(1)肿瘤单抗在肿瘤相关抗原研究中的应用单克隆抗体的发展提供了一个发现新肿瘤相关抗原或肿瘤抗原新位点的有效手段。这些抗原可用于临床血清学检查，具有一定的诊断和评价治疗效果的意义.(2)肿瘤单抗导向药物研究以单抗为载体的放免显像诊断、导向化疗和导向放疗近年取得了实质性进展。主要有①化学药物一单抗交联物；②细胞毒素一单抗交联物；③放射性核素一单抗交联物等。以本发明所述的人源化单抗Hu-ScFv18轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可直接用于有关疾病特别是常见肿瘤，如肝癌，乳腺癌，肺癌等的诊断及导向治疗。另外，以本发明所述的人源化单抗Hu-ScFvl8轻、重链可变区基因编码的多肽及其衍生物作为载体，交联上细胞毒性药物、毒素、放射性核素、酶和生物反应调节剂等作为导向药物，可用于有关疾病特别是肿瘤的诊断及治疗.从本发明所述的人源化单抗Hu-ScFvl8轻、重链可变区基因编码的多肽出发，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式(l)人源化抗体。针对该基因结构的人源化改造，不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(2)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽接头(GLy4Ser)3或其他柔性接头可连接VH基因和VL基因而成单链抗体；由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL—个功能结构域组成的单域抗体；由单个CDR构成的最小识别单位等。(3)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)2、Flex微型抗体、LD微型抗体、FUV)2、F(ab')3、(ScFv)4等.由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透肿瘤组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(4)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体，上述基因可提供其中的一个靶点.(5)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(6)重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是高效，非特异毒性低，体内稳定性好，易穿透肿瘤及体内使用较安全。(7)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体dna上基因in或基因vin连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物.通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出更加优化的特异性抗体。以上述人源化单抗Hu-ScFvl8的轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子为载体，交联上各种抗癌或抗炎症的效应物质而形成的免疫偶联物或导向药物主要有下列几种形式u)抗体-核素偶联物。该偶联物可将核素有效地导向肿瘤组织局部，从而减少了因放疗外照射引起的正常组织损伤及有关的不良反应，并可对肿瘤进行定位诊断和导向治疗。这种方法即为放射免疫显像和放射免疫治疗。与单抗偶联的常用核素有1251，131I,mIn，9flY，"Tc'，mRe和、e等。(2)抗体-化疗药物偶联物。该偶联物能特异地导向肿瘤，可减低对正常组织的损伤，减少化疗药物的毒副作用。常偶联的化疗药物如烷化剂中的磷酸酰胺；抗代谢中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素类阿霉素、表阿霉素、柔红霉素；植物类长春新碱、丝裂霉素等.(3)抗体-毒素偶联物。该偶联物又称免疫毒素。其杀伤细胞作用强且不依赖于生物辅助机制.其杀伤肿瘤机制与放疗，化疗不同，所以一般放疗、化疗效果差的肿瘤可用，应用前景广阔。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、红豆毒素、肥皂草毒素、假单孢菌外毒素、链球菌溶血素、穿孔素等。(4)抗体-生物反应调节剂(BRM)偶联物。BRM单独调节机体的免疫能力和杀伤肿瘤细胞已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达肿瘤靶部位，其杀伤作用得不到充分发挥且有毒副作用。将BRM与单抗偶联，通过单抗携带其到达靶部位而发挥杀伤肿瘤的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。常用的BRM有INF和IL-2等.(5)抗体导向酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其在肿瘤部位转化成髙浓度抗癌活性药以杀伤肿瘤细胞。目前，可作为前药的有苯甲酸氢芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸丝裂霉素、葡糖苷酸柔红霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和头孢菌素氣芥等。活化酶有羧肽酶G2、碱性磷酸酶、青霉素酰胺酶、P-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、P-葡糖苷酶和氨基肽酶等.(6)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可提高药物靶向性和疗效。序列表<110>陈志南〈120〉人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和其编码多肽及其应用<160>4<210>1<211>357<212>DNA<220><221>V一region<222>(1)…(357)<400>1gaagtgaagcttgaggagtctggaggaggc"ggtgcastcctggagga48tctatgcgcctgtcttgtgttgcctctggattcacttttagtgacgcc96tggatggactgggtccgccagtctccaigagaagggacttgagtgggtt144getgaaatteigaageaaagetaataatcatgcaccatactatactgag192tctgtgaaagggaggttcaccateteacgagatgattecaagagtatt240atetacctgcaaatgaacaacttaagaactgaagacactggcatttat288tactgtaccaggg"ageacggetacccactggggccaagggactctg336gtcactgtctctteagetage357<210>2<211>333<212>雖<220><221>V_region<222>(l)...(333)<400>2agtattgtg"g￡LCCcagactcccgacagggttaccataacctgcaaggtagettggtaccaacagaagccattctatgcatecaatcgcaacactagtggatatgggacggatttcactgaagacctggcagtttatttctgtacgttcggcteggggacaaagctgacaagectggttgtateagcagga48gccagtcagagtgtgattaatgat96gggcagtctcctaaactgctgata144ggagttcctgatcgcttcactggc192ttcaccateageactgtgcagget240cagcaggattatagtcctccattc288gaaateaaacgcgcggccgca333<210>3<211>119<212>PRT<220><221>V_segment<400>3GluValLysLeuGluGluSerGlySerMetArgLeuSerCysValAlaTrpMetAspTrpValArgGinSerAlaGlulieArgSerLysAlaAsnSerValLysGlyArgPheThrlielieTyrLeuGinMetAsnAsnLeuTyrCysThrArgAspSerThrAlaValThrValSerSerAlaSer119GlyGlyIxuValGinProGlyGly16SerGlyPheThrPheSerAspAla32ProGluLysGlyLeuGluTrpVal48AsnHisAlaProTyrTyrThrGlu64SerArgAspAspSerLysSerlie80ArgThrGluAspThrGlylieTyr96ThrHisTrpGlyGinGlyThrLeu112<210>4<211>111<212>PRT<213>mouse<220><221>V_segment<400>4SerlieValMetThrGinThrProThrSerLeuValValSerAlaGly16AspArgValThrlieThrCysLysAlaSerGinSerVallieAsnAsp32ValAlaTrpTyrGinGinI>ysProGlyGinSerProLysLeuLeulie48PheTyrAlaSerAsnArgAsnThrGlyValProAspArgPheThrGly64SerGlyTyrGlyThrAspPheThrPheThrlieSerThrValGinAla80GluAspLeuAlaValTyrPheCysGinGinAspTyrSerProProPhe96ThrPheGlySerGlyThrLysLeuGlulieLysArgAlaAlaAla11120权利要求1、抗HAb18G/CD147的人源化单抗Hu-ScFv18的重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列。2、由权利要求l基因编码的多肽产物，其具有序列表<400>3的序列。3、抗HAbl8G/CD147的人源化单抗Hu-ScFv18的轻链可变区基因，其具有序列表<400>2的序列。4、由权利要求3基因编码的多肽产物，其具有序列表<400>4的序列。5、权利要求1或3所述的基因在制备用于诊断和治疗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明涉及抗HAb18G/CD147的人源化单抗Hu-ScFv18的轻、重链可变区基因和其编码多肽及其应用。本发明应用一组设计的引物成功地将HAb18杂交瘤分泌的抗HAb18G/CD147单抗的轻、重链可变区基因进行了人源化改造，所得人源化单抗Hu-ScFv18的重链和轻链可变区基因可编码正确的抗体可变区。基于上述已克隆到的抗HAb18G/CD147的人源化单抗Hu-ScFv18轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种针对HAb18G/CD147分子的小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于肝癌的诊断和治疗目的。文档编号A61K48/00GK101550416SQ20091012614公开日2009年10月7日申请日期2009年2月26日优先权日2008年3月18日发明者征张,郁李,杨向民,陈志南申请人:陈志南