专利名称：全人源抗人cd20单抗分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗人CD20单抗。本发明特别与高亲和力、低解离速率的抗人CD20单抗有关。本发明还披露了这种全人源抗体组成的药物在人类疾病治疗中的应用。
背景技术：
⑶20蛋白，也称之为人B淋巴细胞限制性分化抗原或Bp35，是一种非糖基化的疏水穿膜磷酸化蛋白，其分子量为35kD，在所有成熟B细胞表面表达，由MS4A1基因编码(Valentine et al，1989，J Biol Chem 264(19) :11282-11287 ；and Einfield et al,1988,EMBO J7(3) :711-717)。在人体，⑶20在B细胞发育的整个过程中，除了第一和最后阶段外均进行表达；它从pre-pre B细胞到记忆细胞都存在，但是在pro_B细胞或浆细胞中不表达(Bona C,et al, 1996, Textbook of Immunology. Martin Soohoo,2rd edition). CRC Press, pl02.ISBN9783718605965)。曾经认为，它可能是B细胞激活过程中的一个调节步骤，是细胞周期启动、分化所需要的，并在B细胞发育和分化成成浆细胞过程中起重要作用。在B细胞淋巴瘤、毛发细胞白细胞瘤和慢性B细胞淋巴细胞白血病发现它的存在，在皮肤/黑色素瘤癌干细胞也发现它的存在(Fang D，et al.，2005，Cancer Res. 65(20) :9328-37)。CD20 存在于90%以上的外周血或淋巴器官的B细胞表面，并且在早前B细胞(early pre-B)发育过程中表达，直到浆细胞分化。CD20不但存在于正常的B细胞，也存在于恶性B细胞。特别是，CD20 在 90% 以上的 B 细胞非霍金奇(NHL)中表达(Anderson, et al (1984)Blood63 (6)1424-1433)。但是在造血干细胞，pro_B细胞，正常浆细胞和其他正常组织中没有发现它的存在(Tedder et al, 1985, J Immunol, 135 (2) :973-979)。在体液免疫反应(与由T细胞控制的细胞介导的免疫反应相对)中B细胞是其重要作用的淋巴细胞。B细胞的重要功能是制造抗抗原的抗体，起抗原提呈细胞(APCs)作用，并经与抗原作用最终发育成记忆细胞。B细胞是被动免疫系统的重要组分。另一个重要方面是，⑶20不发生遮蔽、调变或内部化(internalize) (Cragg MS,etal.，2005，Curr Dir Autoimmun 8:140-74)。所有这些背景都是使得它成为诱人的治疗性靶点。已经有几个抗人⑶20的单抗被成功用于与该靶点相关的恶性肿瘤的治疗，例如rituximab, Ibritumomab tiuxetan和tositumomab,它们都是治疗B细胞淋巴瘤和白血病的有效药物。抗人CD20单抗Ofatumumab (GenMab公司产品)2009年被FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病，正在开发的其他抗人⑶20抗体治疗药物还有AME-133v(AME开发)andIMMU-106(veltuzumab)(Morrow KJ, Methods for Maximizing Antibody Yields. GeneticEngineering&Biotechnology News (Mary Ann Liebert, Inc.) :p. 36)。Rituximab,商品名为Rituxan和MabThera，是人鼠嵌合的IgGlkappa型抗人⑶20基因工程抗体，其分子量为145kD，与人⑶20的亲和力大约是8. OnM，可有效地破坏B细胞。抗人⑶20抗体治疗可以单独注射，也可以与第二种放射性标记的或偶联了化学治疗剂的抗人CD20抗体联用。FDA已经批准了用一种这样的抗⑶20抗体Rituxan用于治疗复发性及已治疗过的低度非霍金奇淋巴细胞瘤(NHL)。尽管Rituxan对于治疗B细胞淋巴瘤有治疗效果，但被治疗的病人经常复发。最近发现，Rituxan对类风湿关节炎有疗效(Edwards J, et al, 2004, N Engl JMed350 (25) :2572-81)，并被FDA批准与MTX联用治疗对一种或多种抗TNFa治疗方法无效的中重度活动性类风湿关节炎。已有证据表明，Rituxan对多种自身免疫疾病有效，并已被off-label用于治疗难治性多发性硬化(Stephen LH, et al,2009, N Engl J Med 2008 ；358 :676-688)、系统性红斑狼疮以及自身免疫性贫血。尽管CD20在促进B细胞增值和分化方面的实际功能和机理还不清楚，但是它是以抗体为基础的控制或杀死与癌症和自身免疫疾病有关的B细胞的重要靶点已是不争的事 实。特别是，在NHL这样的癌症细胞中CD20的表达使其成为以抗体为基础的治疗方法的重要靶点，用于使治疗剂特异性地攻击⑶20阳性癌症细胞。然而，在至今已经获得的证据证明CD20是免疫治疗的有效靶点的同时，也发现现有的鼠源、嵌合甚至人源化或全人源的抗体因为其HAMA或HACA反应、高达375mg/m2的剂量和因为注射间隔过短而导致的频繁注射，作为治疗剂仍不够理想。因此，存在着进一步改进抗人⑶20抗体，使其在治疗或预防与⑶20表达有关的疾病方面更为有效的现实需求。PEG化是一种有效的改进蛋白质特性的方法。与蛋白分子共价结合的PEG可以起到遮蔽作用，使其免疫原性和抗原性降低，借以逃避免疫系统的攻击，提高其流体动力学体积，通过降低肾排而延长在循环系统的滞留时间。PEG化还可以为疏水性药物或蛋白提供良好的水溶性。因此，PEG化可以用于改进抗体，特别是scFv，Fab这类半衰期短的分子形式的特性。纯化的scFv, Fab分子可以定点共价链接上带分支的PEG分子。现在需要的是具有高亲和力和低解离速率的抗人CD20分子，使得治疗过的B细胞淋巴瘤病人不再复发，并且给未进行免疫抑制的病人施用后不引起HAMA或HACA反应或引起的可能性大大降低，在循环系统中的半衰期长以延长注射间隔。当然，也期望产品的成本能够大大降低。
发明内容
本发明提供了一种全人源抗人⑶20单克隆抗体(以下简称抗人⑶20单抗分子)及其编码核酸序列。特别是，本发明的这种分子对人CD20分子具有高亲和力和低解离速率。本发明中，所述抗体分子的重链和轻链是全人源的，尽管嵌合的或人源化的也可以使用，但是用于人体时，全人源的可以避免很多副作用，例如HAMA和HACA反应引起的副作用。本发明的某些实施例提供了包括抗人CD20单抗分子的组合物，所述分子包含(a) 一个由可变区和Fe片段等部分构成的完整的或不完整的轻链，其可变区由氨基酸序列SEQ IDNO 1或由SEQ ID NO 3或编码同样氨基酸序列的等效序列编码的SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列组成jPb) —个由可变区和Fe片段等部分构成的完整的或不完整的重链，其可变区包含SEQ. ID NO 2或由SEQ. ID NO 5或其等效序列编码的SEQ. ID NO 6所示的
氨基酸序列。本发明的抗人⑶20单抗分子包括重链与轻链；所述轻链包含有序列如SEQ IDNO: I所示的轻链可变区或其一部分，所述重链包含有序列如SEQ ID NO :2所示的重链可变区或其一部分；或所述轻链包含有序列如SEQ ID NO :4所示的轻链可变区或其一部分，所述重链包含有序列如SEQ ID NO 6所示的重链可变区或其一部分。本发明的优选抗人⑶20单抗包含全人源Fe区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。本发明中，轻链和重链的框架区都是全人源的，其框架区来自人 IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型；优选的是来自人IgGl,最优先选择的是来自IgGl kappa。本发明中，重链和轻链的Fe区都是全人源的，其Fe区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型，优选的是人IgGl。本发明所述抗体分子的Fe可以是天然的，也可以是修改过的。所述Fe区可以是采用任何有效的基因工程方法或其他方法改造过的，其效应功能得到提高或降低的变异体。本发明的全人源框架和Fe区是直接或间接从人体得到的。所述的直接方法包括但不限于基因组DNA克隆、cDNA、cDNA文库。所述的间接方法包括但不限于根据包括但不限于GenBank或其他出版物提供的生物信息为基础部分合成或完全从头合成完整的DNA。DNA合成技术包括但不限于以PCR为基础的DNA合成方法。在某些实施例中，所述抗人⑶20抗体分子包括全长分子或其一个片段(例如Fv、Fab、F(ab’)2等)。在特定实施例中，所述抗人CD20抗体分子包含一个单域(即CDR)，单链 Fv、Fab 或 F (ab)2 等。在某些实施例中，轻链可变区包括全人源框架。在另一些实施例中，轻链可变区包含一种人源的种系框架。在特定的实施例中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在特定的实施例中，重链可变区包含人的种系框架区。在另外一些实施例中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。在某些情况下，所述抗人CD20抗体分子可以是为延长其在循环系统中的半衰期用化学方法进行了 PEG修饰的。PEG修饰是通过活化scFv、Fab或Fab ’ 2分子上截短的铰链区的一个氨基酸残基实现的，方法是Chapman AP等的论文中描述的(PEG)-Iysyl maleimide方案(Chapman AP, et al, 1999, Nature Biotechnology 17,780-783。其他替代方法的细节可以在许多出版物中找到，例如Knight DM, et al，2004，Platelets 15(7) :409-18和美国专利 US5824784。在某些实施例中，所述抗人⑶20单抗分子包含由轻链和重链组成的Fab分子。所述轻链是由SEQ ID NO 7所示的DNA片段或编码同样氨基酸序列的等效DNA序列编码的SEQ IDNO :8所示的氨基酸序列。其重链包括由SEQ ID NO :9或编码同样氨基酸序列的等效DNA序列编码的如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗人⑶20抗体分子包含一种Fab，并进一步包含完整的Fe区，从而形成全长的HiAb分子，或者进一步包含Fe的一部分，从而形成不完整的mAb分子。此外，Fe区应当具有补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。这些功能可以通过氨基酸替换进行修饰，以减少或消除或增强其效应功能。
本发明的抗人CD20抗体分子是在真核或原核受体细胞中表达的。在某些实施例中，编码轻链和/或重链的核酸序列包含在一种质粒或其他表达载体中。本发明还提供了在治疗疾病时施用这种抗体的方法。这些方法包括(I) 一种包含本发明所述抗人⑶20抗体分子的药物组合；(2)对客体施用这种药物组合。所述客体是指具有本品适应症症状的病人。在某些实施例中，所述适应症可从以下疾病中选择=(I)B细胞相关的疾病复发性霍金奇病、B细胞急性淋巴白细胞瘤(B-CLL)、抗性霍金奇病和高度、中度和低度非霍金奇淋巴细胞瘤(NHLs)、弥散性大细胞淋巴细胞瘤(DLCL)、Burkitt淋巴细胞瘤(BL) ；(2)自身免疫疾病类风关、牛皮癣、系统性红斑狼疮、强制性脊柱炎、多发性硬化等。(3)其他与CD20有关的疾病。本发明提供了抗人CD20单抗分子及其编码核酸序列。特别是，本发明提供了具有 高亲和力和低解离速率的抗人CD20单抗分子。优选地，本发明所述的所述抗人CD20单抗分子由具有全人源框架的轻链和/或重链可变区组成。为方便描述，本发明就此内容分成以下几方面I.抗人CD20单抗分子；II.制备抗人CD20单抗分子；III.用于治疗的配方和使用方法。以及IV.抗人⑶20抗体分子的应用。I.抗人⑶20单克隆抗体分子本发明的单抗可以用多种技术获得，包括但不限于Kohler and Milstein,Nature256:495(1975)发表的标准的杂交瘤技术。尽管原则上这一技术是受偏爱的，但其他获得单抗的技术也可以应用，例如转基因小鼠或杂交瘤技术。小鼠中的杂交瘤技术已经十分成熟。免疫和融合伙伴已经十分清楚。但是，用小鼠或其他非人动物杂交瘤产生的抗体会引起HAMA反应，从而导致用于人体疾病治疗时会引起副作用。以这些抗体为基础获得的嵌合的或人源化的单抗用于人体时仍然能够引起HACA反应，从而导致类似的免疫反应，尽管比起原型分子轻微。全人源杂交瘤技术仍然处于开发状态，尚不足以获得用于人类疾病治疗的单抗。对于人类疾病治疗来说，需要全人源抗体以减少或消除引起副作用的HAMA或HACA反应。尽管转基因小鼠已经有很成功的记录，其他技术也是可以选择的。抗体库技术，特别是由CAT及其他机构建立的全人源抗体库技术就是其中值得考虑的一种选择。CAT建立的技术在一些治疗性抗体的开发上获得了某种程度的成功，引起了国际上的关注，但是它依然有非常明显的问题获得高亲和力scFv分子的几率很低。这就需要对该技术进行改进，以满足治疗性抗体的需要。本发明对现有抗体库技术的最重要的改进有(I)用3000位来自于不同民族和地区的健康成年人血样构建了超大规模全人源天然Fab抗体库,称之为HuLib。显然，与已发表的抗体库相比，该抗体库具有更丰富的遗传变异。对于熟知本领域的人员来说，不难理解这将大大提高遗传复杂性和通过淘筛或其他方法获得高亲和力Fab分子的可能性。此处可以使用的其他抗体库可以是合成的或部分合成的，也可以是scFv，起始材料也可以是其他非人动物，例如小鼠。(2)为了提高亲和力和改变获得的Fab分子亲和力以外的其他性状以满足治疗的需要，采用了分子进化技术。通过分子进化改进的分子可以借助哺乳动物细胞、酵母菌细胞或细菌细胞进行生产。本发明中的原型Fab分子是用人CD20作为抗原上述抗体库进行淘筛获得的，它将被用于后续通过分子进化的原型分子，以获得亲和力等技术指标达到治疗性药物要求的候选单抗。本发明的分子进化技术是通过PCR引入突变的，它包括(1)关键氨基酸(KA)扫描。KA扫描被用来在人工进化之前检定最有意义、最有可能获得有用突变体的位点，以减少无效突变。KA扫描是检定可以通过任何可能的突变方案并通过亲和力测定获得有效突变体的氨基酸位点的过程。若一个具有一个特定氨基酸位点突变的突变子的亲和力发生了变化，该位点就是有用的突变位点，反之亦然。基于这样的扫描方法就可以确定有效的和无效的突变位点，并可借助Cunningham和Wells (Science, 1998, 244 :1081-1085)的方法在设计突变方案之前对各位点进行分类。借此可以大大简化突变设计的数据处理，并减少甚至避免无效突变，这又使突变后亚库的构建和淘筛大大简化。(2)突变引物设计。突变引物设计是这一技术中获得足够数量的有用突变的关键步骤，本发明中采用了以GCR引物设计方案，详细情况见PCT/CN2009/074839。本发明中所述的目标区域(即拟突变的区域)是一个抗体分子的CDR区，优先选择的是轻链和重链的CDR3。本发明中，所述的随机突变优先选择的是在每一个有用突变位点以19种或20种天然氨基酸进行饱和随机突变。(3)此外，根据Kabat计数法确定的目标CDR的侧翼序列也有一些氨基酸对于产生对亲和力有意义的突变 子是重要的，至少在某些情况下，某种程度上是这样。因为此，KA扫描应当覆盖CDR及其侧翼氨基酸以获得更广泛的亲和力改善的变异。在本发明，有用的氨基酸位点可以用本领域熟知的方法突变为随机氨基酸或特定的氨基酸。突变为拟定的氨基酸序列可以通过改变编码该氨基酸的核酸序列来实现。这种编码在特定CDR区具有一个或多个突变的突变子的核酸分子可以用本领域熟知的方法获得。所述的突变方法包括但不限于对已经提前制备的编码CDR区的核酸进行定点突变、寡核苷酸介导的突变、位点特异性突变或随机PCR突变、表达框突变等。制备这种取代突变子的一种优选方法是定点突变。这一技术在本领域是广为熟知(see, e.g., Carter et al,1985，NAR, 13 :4431-4443, and Kunkel et al, 1987，PNAS，82 :488-492)。以 PCR 为基础的突变方法，其突变核苷酸被置入到了引物中，从而使相应的PCR产物带有突变，这也是可达到此目的的一种优选的方法，详细情况可参考see Vallette et al, (1989)NAR，723-733。本发明中最佳的突变方法是用根据GCR方法(详见PCT/CN2009/074839)或其他可用的方法设计引物，通过PCR在特定的位点进行随机突变。必要时可以同时对一个以上的位点进行突变，从而获得具有多个突变的突变子。本发明米用Kabat 方法编码各个CDR 区(EA, et al, 1991, Sequences of proteinsof immunological interest，5th ed. U. S. Department of Health and Human Services,National Institutes of Health，Bethesda，Md.)。在某些实施例中，抗人⑶20单抗分子由一条轻链和带有全人源恒定区的一条重链组成。对于本领域技术人员，不难理解当本发明的抗人CD20单抗分子用于人体治疗疾病时将很少或没有免疫反应。本发明的某些实施例中，抗人CD20单抗分子带有Fe区，其优选来源是直接从人种系获得或通过其他途径例如全长DNA合成，人基因组库等。本发明提供一种亲和力高、解离速率低的抗人CD20单抗，该单抗在低剂量下是有效的。本领域技术人员不难理解，本发明的抗人CD20单抗分子特别适合用于人体疾病的治疗，它不像带有鼠源成分的嵌合型抗人CD20单抗分子(例如Rituxan)那样容易引发HACA反应。本发明所述的⑶R可以与任何类型的框架区整合为有功能的scFv、Fab和/或进一步与Fe区整合从而形成有功能的全长抗体分子。优选的CDR区与全人源框架区或其亚区和种系的或经过修饰的Fe区进行整合。可以用于与本发明的CDR区整合的全人源框架包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(见 (I)Kabat et al, 1991, Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services,and(2)NIH，USA ;and Wu et al，1970，J Exp Med 132:211-250)。II.产生结合⑶20分子的方法本发明的抗体或抗体片段可以通过轻链和重链基因在受体细胞中的重组表达来实现。所述受体细胞可以是哺乳动物细胞，也可以是酵母或细菌细胞。本发明中轻链和重链的表达可以通过瞬时或稳定表达来实现。两种表达策略都包括用一种或多种带有编码抗体轻链和重链的DNA片段的表达载体转染(哺乳动物和酵母系 统)或转化(细菌系统)受体细胞，从而使轻链和重链在受体细胞中表达，优选的表达方式是分泌到培养基中，可以用本领域技术人员熟知的层析等方法从中回收抗体。标准的重组DNA方法可以有效地用于轻链和重链基因的获得、克隆至表达载体以及引入到受体细胞。本发明中在分子进化之前或之后通过淘筛获得的抗体分子是Fab形式的。这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成scFv、全长抗体或其他形式。本发明中，一旦通过上述方法获得了编码所需VL和VH区的DNA片段，就可以用标准基因工程方法进一步转换成全长的抗体轻链和重链基因、Fab片段基因或scFv基因。为获得全长轻链基因，可以把编码VL区的DNA整合到人轻链恒定区。优先选择的是人kappa或lambda恒定区,最优先选择的是人kappa恒定区。为了获得全长重链基因，可以把编码VH区的DNA整合到重链的恒定区。重链恒定区可以从以下几种中选择，IgG，、IgA、IgE、IgM或IgD。优先选择的是IgGl IgG4,最优先选择IgGl (gamma)的恒定区。为了获得单链Fv基因，可以用PCR方法从上述Fab分子进一步获得VH-和VL-DNA编码区，然后用(Gly4) 3编码区作Linker把两个片段连接成一个完整分子，使得所述VH和VL序列可以用McCafferty et al, 1990, Nature 348 :552-554描述的方法以单链Fv蛋白的方式在E. coli中表达。为了表达本发明所述的抗体或抗体的片段，可以把其相应的轻链和重链编码序列插入到表达载体的转录和翻译控制序列之间。本发明所述的表达载体包含调控序列如启动子、增强子等。所述的表达载体及其控制序列应当与受体细胞兼容。编码轻链和重链的基因可以分别插入到两个独立的载体，也可以插入到同一个载体。所述表达载体可以预置了恒定区，也可以不预置恒定区。如果一个抗体基因只含有可变区，应当使用预置了恒定区的表达载体。除了转录和翻译调控序列，本发明的表达载体还含有(I)在每一个表达框有一个信号肽序列，它可以促进抗体从受体细胞分泌到培养基中；(2)至少一个复制起点；(3)一个或多个选择标记基因，借此可方便地对引入了表达载体的受体细胞进行筛选。典型的选择标记基因可为受体细胞提供抗性，例如细菌对抗生素的抗性，哺乳动物细胞或其他受体细胞对G418、潮霉素和MTX等的抗性。所有这些信息对本领域的人员都已经广为熟知。
优选的用于本发明的受体细胞包括具有或不具有DHFR的CHO细胞系、HEK293细胞系。抗体的表达是通过培养携带有上述表达载体的受体细胞，然后对产物进行纯化进行的。本发明的受体细胞也可易用来生产截短的抗体片段，如Fab或scFv。为此目的，尽管哺乳动物或其他受体细胞也可以使用，但以E. coli为代表的细菌是优先选择的受体细胞。本发明中抗体或抗体片段的回收和纯化主要包括(I)对样品进行调适，即为纯化做准备。首先要去除细胞、细胞碎片、脂质和凝聚物。为此，可先离心，然后0.45 μ m过滤的方法。(2)层析，包括但不限于亲和、离子交换、分子筛的等层系方法。，在有些情况下，超滤或透析也可选用。本发明优先选择的纯化方法是Protein A/G亲 和后在目标抗体可结合到柱子上、阴离子可穿过的低PH下进行阳离子交换层析。也可以在抗体分子可穿过，但阴离子可结合到柱子上的高PH下用阴离子层析。在离子交换层系中，许多具有不同等电点的杂蛋白可以被去除。(3)如有必要，可用分子筛对已经获得的原液进行进一步纯化。为获得高纯度的单抗，本发明中在过滤后经过GE HealthCare生产的MabselectSuRe,CaptoS和Capto Q进行纯化。为建立更有效的方法，也可以使用包括MabselectSuRe和CaptoAdhere两种组分的两步法。III.制剂及其应用本发明的抗人CD20单抗，包括全长的和截短的，都是治疗或诊断与CD20相关的人体疾病的有用材料。如上所述，抗人CD20单抗可用于治疗B细胞淋巴瘤或CD20相关的其他肿瘤或疾病，自身免疫疾病例(如RA、SLE等)。本领域的技术人员都知道，与各种放射性或非放射性标记物偶联的抗人CD20对于诊断和治疗是有用的。可用于此目的放射性标记物包括但不限于131I，125I，"Tc和9°Y，可用于此目地的非放射标记物包括但不限于酶(例如HRP，AP等)、荧光染料、毒素等。在优选的案例中，接受治疗的客体是非免疫抑制的(如SLE和RA病人)。尽管机理仍然不清楚，但本领域的技术人员很清楚，本发明的抗人CD20抗体分子引起HACA反应的可能性比以前知道的抗人CD20抗体要低很多，特别是对非免疫抑制的病人来说更是如此。因此，非免疫抑制的病人可以不用过分顾忌引起副作用的HACA反应。此外，本发明的抗体分子的亲和能力显著提高，因此其有效剂量可明显降低。这进一步避免了可能的HACA反应。本发明的抗人CD20单抗分子可以与包括但不限于化疗或放疗等其他抗肿瘤治疗方法联用，在某些情况下，也可以与一些细胞因子，如G-CSF联用。本发明的抗人CD20抗体分子可以制备成适于给病人使用的剂型，其含有一种人CD20结合分子，例如抗体或抗体片段，和一种或多种作为医药可接受的载体，例如溶剂、分散介质、包裹剂、抗生素、抗真菌物质、等渗物质、减缓吸收物质以及其他的生理学上能接受的物质。可接受的载体物质包括以下一种或多种水、盐、磷酸盐缓冲液、葡聚糖、甘油、乙醇等，可单用或组合使用。优选的等渗剂是糖、聚乙醇如mannitol, sorbito,也可以是氯化钠。最优先选择的等渗剂是海藻糖。所述载体可进一步含有微量auxi I iary物质,如润湿剂、乳化剂、防腐剂或缓冲液，这些物质有助于提高所述分子的货架期或有效性。本发明的组分可以形成多种多样的形式，例如注射或输液、分散液或悬浮液等。本发明的优选方式是注射液或输液。IV.抗人⑶20单抗的其他应用本发明的抗人⑶20单抗可用于样品中⑶20定性或定量免疫检测。免疫检测是一种检测在含有复杂混合物的溶液中是某种物质是否存在或浓度的方法。除了结合的特异性夕卜，所有免疫检测的主要共同特点是可产生可检测的信号。当今，多数多数免疫检测方法都依赖于与可测标记相关的分析试剂。本发明可用的标记可以从以下物质中选择放射性同位素、酶、荧光物质、磷光物质和合学发光染料、磁性颗粒、染料、金和银等的胶体、金属螯合齐U、辅酶等。本发明中优选方案是酶(例如HRP和AP)，以及荧光染料。其中最选的是HRP和AP等酶。本领域中的许多检测方法都是广为熟知并在临床或科学研究中广泛应用，例如疾 病检测、生物化学研究等。
图I是Fab表达载体pGPIO结构示意图。其中，Plac是在E. coli中表达的启动子，ompA和pelB是信号肽编码序列，GPIII是噬菌体尾部蛋白GPIII的编码序列，MCSl和MCS2是Fab轻链和重链的克隆位点。图2是全长抗体分子在哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)瞬时或稳定表达的双元表达载体PGP6C构建过程及结构示意图。为了在哺乳动物细胞表达抗体的轻链和重链，用如下方法构建了双表达框表达载体。(I).用PCR为基础的全基因合成方法(Xiong A S，Yao Q H, PengR H, et al. , 2004, Nucleic Acids Research, 32 (12) e98.)按照 GenBankAccessionNo. AB608262. I序列资料合成人IgGl轻链(Kappa)恒定区CL,5’增加多克隆位点 Pstl/Nhel/Bglll/EcoRI/EcoRV/XhoI, 3’ -端增加 SV40 poly A signal 编码区(简写为pASV40)5’ -端22个碱基(以pCI-Neo为模板)，以便于通过重叠PCR与Pcmv片段进行拼接。片段长度为 345bp。(2)以 P3(ttccctttagtgagggttaatg, pASV405’ -端引物区)和 P4(ccggatcgatccttatcggattt/ACCACATTTGTAG AGGTTTTACTTG, Pcmv3，-端引物区/PA 5’-端引物区)为引物，pCI-Neo为模板扩增pASV40片段，长度为295bp。以Pl (ctgcag(PstI) gctagcagatctgaattc gatatcctcgag,多克隆位点-CL 片段 5’ _ 端引物区)和P4为引物进行重叠PCR对上述两个片段拼接，获得多克隆位点-CL-pA片段，长度为 618bp。 (3)以 P5(caagtaaaacctctacaaatgtggta/aaatccgataaggatcgatccgg, pASV403’ -端引物区/Pcmv5’ -端引物)和 P6 (ggtacc (KpnI)CTGTGGAGAGAAAGG CAAAGTG，KpnI 位点/PCMV 3’-端引物区)为引物，pCI-Neo (Invitrogen)为模板进行PCR扩增，获得1151bp片段。用Pl和P6为引物通过重叠对上述两个片段拼接，其最终结构为=PstI-多克隆位点-CL-pA-PCMV-Kpnl，长度为1791bp。该片段克隆至pUC57上，测序验证无误后，插入到phCMVI (Gene Therapy Systems, Inc.)载体的 Pstl/Kpnl 位点，即构成预置了 CL 的双表达框表达载体。最后，把根据GenBank Accession No. BC092518. I人工合成的人CH(Gamma)片段插入到上述载体的Acc65I/NotI位点，即构成预置了人轻链恒定区CL和重链恒定区CH的双表达框载体PGP6C。图3是从7F2分子进化群体中获得的几个Fab分子、阳性对照(C2B8_Fab)和阴性对照(Humira-Fab)亲和力的比较图。阴性对照和阳性对照是本公司制备的。亲和力数据是用Friguet方法测定的。图4是全长F8G3及自备阳性对照C2B8 (即Rituxan)和2F2 (即HuMax-CD-20)亲和力比较图。亲和力数据是用Friguet方法测定的。图5是F8G3、C2B8和2F2从hCD20的解离情况图。可以看出，F8G3解离常数显著低于C2B8和2F2。图6是抗人⑶20抗体在免疫缺陷型荷DHL4瘤小鼠中抑制肿瘤生长的情况。图7 是 F8G3、2F2 和 Humira 诱发 Daudi cells (图 7A)和 Raji cells (图 7B)细胞裂解比较图。加入抗体可在五分钟内诱导到细胞裂解，F8G3和2F2在两种B细胞可分别诱导90%以上和80%以上细胞裂解。阴性对照未发现诱导细胞裂解，此处未显示。图8是F8G3和2F2以MNC作为效应细胞时诱导Raji细胞ADCC能力的比较图。抗人⑶20单抗有明显剂量效应。F8G3和2F2均可诱导诱导Raji细胞发生特异性裂解，2F7 最高仅诱导35%，而F8G3则高达47%。阴性对照Humira不能诱导特异性裂解。
具体实施例方式以下实施例是为了说明或进一步阐释本发明的某些优选的实施方案以及某些论点，并非要限制本发明的范围。实施例I.大规模全人源抗体库构建这一实施例描述如何构建Fab形式的超大规模全人源天然抗体库。本发明的Fab抗体库是用来自不同地区、不同民族的3000多名健康成人的血样，参照以下文献构建的，详细构建过程在文献目录之后描述。I. Dantas, BC, et al,2005, Construction of a human Fab phage displaylibrary from antibody repertoires of osteosarcoma patients.Gene. Mo. Res, 4(2)126-140.2. Hiroshi, T，et al,1999, Preparation of Recombinant Human MonoclonalAntibody Fab Fragments Specific for Entamoeba histolytica, Clinical andDiagnostic Labor Immunol, May 1999,383-387.3. Wu, BP, et al,2001, Construction and selection of the natural immuneFab antibody phage display library from patients with colorectal cancer， WorldJGastroenterol,7(6) :811-815.4. Lee , CV, et al, 2004 , Hi gh_af f in i t y Human Antibodies fromPhage-displayed Synthetic Fab Libraries with a Single Framework Scaffold，J MolBiol，340，1073-1093.5. Michael H，et al,2005, Antibody phage display, Mod Asp Immunobiol，15 47-49.6. De Haard HJ,et al,1999,A large non-immunized human Fab fragment phagelibrary that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinityantibodie. J Biol Chem，1999，274 :18218-18230.7.Fel louse，FA，2007，High-throughput generation of synthetic antibodiesfrom highly functional minimalist phage-displayed libraries. J Mol Biol 373，924-940.I.血样和cDNA合成取每个供体的血样I毫升混合，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，然后用Invitrogen或Roche公司的试剂盒分离总mRNA,用GIBCO的逆转录试剂盒合成cDNA的第一链。所有步骤按照制造商的说明书进行。2.扩增重链和轻链的Fab区
为了扩增编码kappa和lambda轻链以及gamma重链的Fd区,采用了表I所示的引物组。除了上述轻链或重链的互补序列外，引物上了带有特定的酶切位点和保护碱基以便于克隆。用IOOy I体系进行PCR扩增，正义链和反意链引物均采用ImM终浓度，PCR按下述条件进行25个循环94°C 30秒，500C 30秒，72°C I分钟；94°C 4分钟预变性，72°C 5分钟后延伸。用 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, Hi I den, Germany)纯化扩增的DNA片段。纯化的片段用Sacl/Hindlll或Xhol/Spel酶切后琼脂糖电泳分离，用QIAEXGelExtraction Kit进行胶回收。表I.用于人免疫球蛋白基因PCR扩增的引物组，下划线部分是增加的酶切位点，兼并密码为M = A or C，Y = C or T, W = A or T, R = A or G, H = A, C, or T, S = C orG, and K = T or G.
权利要求
1.一种全人源抗人CD20单克隆抗体，所述全人源抗人CD20单克隆抗体能特异性地与人⑶20结合。
2.如权利要求I所述的全人源抗人CD20单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人CD20 单克隆抗体为 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2，分泌型 IgA、IgD 或 IgE 型的抗体。
3.如权利要求I所述的全人源抗人CD20单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人⑶20单克隆抗体包括重链与轻链；所述轻链包含有序列如SEQ ID NO :1所示的轻链可变区或其一部分，所述重链包含有序列如SEQ ID NO 2所示的重链可变区或其一部分；或所述轻链包含有序列如SEQ ID NO :4所示的轻链可变区或其一部分，所述重链包含有序列如SEQID NO 6所示的重链可变区或其一部分。
4.如权利要求3所述的全人源抗人CD20单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人CD20单克隆抗体是一种全长的抗体、抗体的一个片段或片段的组合物或单链抗体。
5.如权利要求3所述的全人源抗人CD20单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人CD20单克隆抗体为scFv、Fab、F(ab)2、F(ab’)2，或具有与人CD20结合能力的其他形式。
6.如权利要求I所述的全人源抗人CD20单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人⑶20单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO :8，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO=IO0
7.如权利要求I所述的全人源抗人CD20单克隆抗体，其特征在于，所述全人源抗人⑶20单克隆抗体是PEG化或非PEG化的。
8.一种转染子、真核或原核受体细胞、转基因的非人动物或者植物，其特征在于，所述转染子、真核或原核受体细胞、转基因的非人动物或者植物能产生权利要求3所述抗体或权利要求3所述抗体一部分的抗体，其中，权利要求3所述抗体一部分的抗体选自权利要求3所述抗体的scFv、Fab、F(ab)2、F(ab’)2或其他形式的能与人⑶20结合的抗体。
9.一种用于治疗或预防与人CD20或CD20表达细胞有关的疾病的药物组合物，它包治疗有效量的权利要求1-7任一权利要求所述全人源抗人CD20单克隆抗体及药学上可接受的辅料。
全文摘要
本发明涉及抗人CD20单抗及其编码核酸序列。本发明特别与高亲和力低解离速率的抗人CD20单抗有关。本发明的优选抗人CD20单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。本发明还披露了这种全人源抗体组成的药物组成及其在人疾病的治疗中的应用以及在治疗中使用这种全人源抗体的方法。
文档编号A01K67/033GK102875678SQ20111019625
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者刘庆法 申请人:无锡天演生物技术有限公司