专利名称：Jak2外显子12基因突变及用途的制作方法
技术领域：
本发明属基因组学领域，涉及JAK2基因突变及用途。具体涉及位于JAK2外显子 12上的编码序列及其在骨髓增殖性疾病的基因诊断中的用途。
背景技术：
研究显示，Janus kinase 2 (JAK2)属于Janus激酶家族，由1132个氨基酸组成， 相对分子量为131 X IO3,定位于9号染色体短臂2区4带(9p24)，与JAKl、JAK 3以及TYK2 同属于JAK家族，均为胞内酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，PTK)。JAK2基 因由7个高度保守的同源结构域(JAK homology, JH)组成(JH1-JH7)，主要包括①N-端 FERM区(JH4-JH7)负责与相关细胞因子受体进行非共价结合；②N端JH3-JH4为假性SH2 区；③C-端酪氨酸激酶区(JHl区)为激酶结构域，靠近蛋白羧基端，是JAK2的催化功能 区，具有JAK2活性所必需的Phe-Trp-Tyr基团，该区的缺失将导致JAK2失活；④紧邻SH2 区的假激酶区域(JH2)，结构域类似于JHl，但没有激酶活性，主要起抑制JAK2活性的作用， 该区结构异常可导致 JAK2 异常活跃(Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ，et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in humanmyeloproliferative disorders. Lancet. 2005 ；365(9464) 1054-61)。JAK2基因突变研究是近年来血液病研究的突破性进展之一。现有技术公开了骨髓 增殖性疾病(myeloproliferative diseases,MPD),包括真性红细胞增多症(polycythemia vela, PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia, ET)和特发性骨髓纤维化 (idiopathicmyelofibrosis, IMF)是一组造血干细胞病变引发的恶性疾病，但这些疾病的 遗传学基础多年来一直未明了，直到2005年研究人员在本组疾病中发现存在JAK2点突 变(JAK2V617F)，才使MPD的诊治进入了一个新纪元。JAK2V617是在第14外显子v617位 点发生的点突变，缬氨酸(valine，V)被苯丙氨酸(phenylalanine，F)取代。在JAK2的 结构中，JHl为激酶域；而Val617位于与JHl相邻的JH2，后者为假激酶域，与JHl结合并 抑制其激活。V617F突变使JH2失去了对JHl激酶活性的抑制作用，导致了 JAK2的持续 活化，由此造成细胞的增殖活性增强[Kilpivaara 0，Levine RL. JAK2and MPL mutations in myeloprolifer-ative neoplasms :discovery andscience. Leukemia. 2008 ；22(10) 1813-7]。JAK2V617F突变在真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和特发性骨髓纤维化 患者中存在很高的发生率。通过等位基因特异性多聚酶链反应检测到JAK2 V617F突变在 真性红细胞增多症患者中的发生率为90% ；原发性血小板增多症和特发性骨髓纤维化患 者为 50%-60% [Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Lancet. 2005 ；365 (9464) 1054-61]。在未发现JAK2突变缺乏V617F突变患者的这些疾病的分子基础尚不清楚。2007 年，有研究在JAK2V617F突变阴性的MPD患者中发现了外显子12的突变，该突变同样也可 造成JH2丧失对JH激酶活性的抑制，这为JAK2 V617F阴性的骨髓增殖性疾病患者提供了 分子标志物和遗传机制[Scott LM, Tong W, Levine RL, et al. JAK2 exon 12mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. NEngl J Med 2007;356:459-68·]。
正常生理情况下，JAK2介导促红细胞生成素(EP0)、促血小板生成素(TP0)、粒-巨 噬细胞集落刺激因子、白细胞介素_3和生长因子在内的多种细胞因子的信号转导，并调节 和促进细胞增殖。JAK2基因在造血调节中发挥重要作用，其下游的STAT家族是一种能与 DNA结合的蛋白家族，与JAK磷酸化信号通路偶联(JAK-STAT信号通路)，发挥转录调控作 用。JAK-STAT能把细胞外信号与基因表达调控直接联系起来，启动响应基因的转录和表达， 完成细胞因子受体如促红细胞生成素受体(EP0R)和促血小板生成素受体(MPL/TP0R)介导 的信号转导过程，产生细胞增殖效应。这些位于外显子12上的突变不仅为这些疾病的发生提供了遗传学病因，也可 以作为特异性的生物标志物，用来诊断骨髓增埴性疾病。在修订的2008WH0分类系统 中，有无JAK2突变成为MPD主要的诊断指标(MurugesanG, Aboudola S, Szpurka H, et al. Identification of the JAK2 V617Fmutation in chronic myeloproliferative disorders using FRET probesand melting curve analysis. Am J Clin Pathol,2006, 125 625-633)，由于这些突变导致JAK2酪氨酸激酶活性持续生高，这些突变也可以作为药 物作用靶位，研究人员正在针对这些突变位点开发针对MPD高效的分子靶向药物，将为MPD 的治疗提高到一个新的水平。
发明内容
本发明的目的是提供JAK2基因突变及用途。尤其涉及位于JAK2外显子12上的 编码序列及在骨髓增殖性疾病(MPD)的基因学诊断或治疗中的用途。所述的骨髓增殖性疾病包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和特发性骨 髓纤维化等。本发明所述的JAK2基因突变其突变方式、突变序列和插入片段为在JAK2外 显子12上1640位碱基后面插入了序列1的GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATATT长 达33的碱基，导致其蛋白序列F547变为L547，插入的碱基编码的氨基酸序列为序列2的 FHKIRNEDLIFo本发明提供的JAK2基因突变为中国JAK2V617F阴性的MPD患者的突变位点，其表 现为在JAK2外显子12上1640位碱基后面插入了序列1的碱基，其蛋白序列F547变为 L547，插入的碱基编码的氨基酸序列为序列2的序列。本发明所述的JAK2基因突变通过下述步骤获得1)采集标本收集JAK2V617F阴性的MPD患者的外周血细胞，提取基因组DNA ；2)PCR 检测针对外显子12突变位点，设计引物序列3的上游引物 5，-AATGGTGTTTCTGATGTACC-3，，序列 4 的下游引物5，-AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3，，扩 增片段长度为127bp ；使用HotStar Taq Master Mix试剂盒，在ABI 9700扩增仪上进行PCR扩增，取扩 增产物电泳；结果显示，所测的扩增的目的条带长度为127bp ；所测的JAK2V617F阴性的MPD患 者DNA含有突变位点，其除了与其他标本相同的127bp条带外，还多了一条分子量更大的条 带 160bp ；
3)序列分析将上述PCR产物条带进一步做基因测序，结果显示，分子量较小的条带(127bp)为 野生型(正常)具有序列5的核苷酸序列和编码的序列6的氨基酸序列，与正常人JAK2基 因外显子12序列完全一致；所述的分子量较大的突变型条带(160bp)，其在JAK2外显子12 上1640位碱基后面有GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATATT 33个碱基插入，具有序列7 的核苷酸序列和编码的序列8的氨基酸序列。所述的JAK2基因突变，经实验证实，该突变可使特异性的受体酪氨酸磷酸化活性 持续增强，使红细胞对细胞因子如EP0的反应增强，持续激活JAK-STAT信号途径，从而发生 细胞增殖。该基因突变对MPD的分类、诊断和治疗能产生深远的影响；该突变能成为治疗 MPD的重要靶位，进一步制备针对该突变的Jak2抑制剂的靶向药物用于治疗骨髓增殖性疾 病 MPD。本发明中，可采用JAK2基因突变对临床表现为红细胞、粒细胞和血小板单系或多 系增多的MPD患者进行该突变位点检测，有助于诊断或者排除MPD。本发明中，可采用JAK2基因突变位点序列制备诊断探针，能更简便快捷的诊断 MPD 病。本发明中，可采用JAK2突变蛋白序列制备抗体，用于检测突变的JAK2抗原，能更 简便快捷的诊断MPD病。进一步，本发明中，按常规方法制备含有上述突变位点JAK2突变基因或者针对突 变蛋白抗体的试剂盒。本发明的有益效果为1)按照有无JAK2突变为MPD主要的诊断指标的2008 WHO分类系统，本发明所述 的JAK2基因突变对有关MPD的基因诊断工作带来了显著的便利，有利于进一步阐明MPD的 发病机制。2)由于JAK2突变广泛存在于MPD，因此抑制JAK2基因来治疗MPD的药物具有相当 广阔的应用前景；利用本发明将JAK2突变作为潜在的候选靶位，制备针对此突变的药物， 抑制JAK2基因表达，为MPD病的治疗提供新的方法。
图1是JAK2基因结构图其中，FERM 细胞因子受体结合区；SH2 细胞致敏区；Pseudo kinase 假激酶区；Kinase 激酶区。图2 为 JAK2_exonl2 电泳结果，其中数字2-17为标本编号，M代表分子量，长度单位bp，JAK2-eXOnl2(基因未发生突变)的目的条带长度为127bp ；标本2 (含有突变序列的患者)除了与其他标本相同的127bp条带外，还多了一条 分子量更大的条带(160bp)。图3 JAK2-exonl2野生型(基因未发生突变)测序结果。图4 2号标本(突变序列)测序结果。图5 2号标本突变的eXOnl2基因序列和蛋白序列突变表现示意图，其中，框内为插入的碱基序列，单划线为插入的蛋白序列，表示在JAK2外显子12上1640位碱基后面插入了 GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGA TTTGATATT长达33的碱基，其蛋白序列F547变为L547，插入的碱基编码的氨基酸序列为 FHKIRNEDLIFo
具体实施例方式实施例11)采集标本收集JAK2V617F阴性的疑似MPD患者的外周血细胞，提取基因组 DNA ；所述的患者，四肢麻木长达2周，血常规化验结果为
白细胞红细胞血红蛋白血小板中性粒 细胞％红细胞 压体红细胞平 均体积平均血红 蛋白量平均血红 蛋白27. 47 X109 /L5. 37 X 1012 /L185 g/L510X 109 /L84. 7%56.6105. 434. 5327血液骨髓细胞形态学检查报告特征描述为骨髓有核细胞增生活跃，粒红细胞比例属正常范围。粒系增生，以杆状分叶核细胞 居多，部分中性粒细胞可见空泡及中毒颗粒等退行性变，红系比例与形态大致尚可，偶见双 核早幼红细胞。片上浆细胞易见，散在及小簇状分布。全片找到巨核细胞272只，8/50颗 粒，41/50产板，1/50裸核。片上成簇及散在血小板易见，血小板形态大致正常。NAP 100% (+)，370 分。Fe 外铁 + ++，内铁 34% +，1-2 粒。2) PCR 检测设计引物序列3 的上游引物5，-AATGGTGTTTCTGATGTACC-3，，序列4 的下游引物5，-AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3，，扩增片段长度为127bp ；采用HotStar Taq Master Mix试剂盒，在ABI 9700扩增仪上进行PCR扩增；反应体系包括0. 5u 1上游引物(10pmol),0. 5u 1下游引物(lOmol), 12. 5 u 1 HotStar Taq Master Mix，1 ii 1 样本 DNA，去离子水补足至 25 ii 1。扩增条件95°C 15min, 94°C 30s、55°C 30s、72°C 30s, 40 个循环后，72°C 5min 延伸，取 8iU 产物电泳；结果显示，所测的扩增的目的条带长度为127bp ；所测的JAK2V617F阴性的疑似患 者DNA含有突变位点，其除了与其他标本相同的127bp条带外，还多了一条分子量更大的条 带 160bp ；3)序列分析将上述PCR产物条带进一步做基因测序，结果显示，分子量较小的条带(127bp)为 野生型(正常)，与正常人JAK2基因外显子12序列完全一致；分子量较大的条带(160bp) 为突变型，其表现为在JAK2外显子12上1640位碱基后面插入了 GTTTCACAAAATCAGAAATGAAGATTTGATATT 33 个碱基。实验显示，上述突变可使特异性的受体酪氨酸磷酸化活性持续增强，使红细胞对 细胞因子如EP0的反应增强，持续激活JAK-STAT信号途径，从而发生细胞增殖。根据实验及有关检测结果增生性骨髓象，粒系有退行性变，NAP积分明显增高， 临床拟诊断为骨髓增殖症。JAK2外显子12基因突变及用途序列表SEQUENCE LISTING<110>复旦大学附属华山医院<120>JAK2外显子12基因突变及用途<130>11<160>8<170>Patentln version 3. 1<210>1<211>33<212>DNA<213> 人<400>1gtttcacaaa atcagaaatg aagatttgat att33<210>2<211>12<212>PRT<213> 人<400>2Leu Phe His Lys lie Arg Asn Glu Asp Leu lie Phe1510<210>3JAK2外显子12基因突变及用途序列表<211>20<212>PRT<213> 人<400>3Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly151015Thr Ala Cys Cys20<210>4<211>24<212>PRT<213> 人0091]<400>40092]Ala Gly AlaCys Ala Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Thr0093]15 10 150094]Cys Thr AlaAla Thr Gly Ala Cys0095]200096]<210>50097]<211>1110098]<212>DNA0099]<213> 人0100]<400>50101]clclcltCBclclCCttctagtctt cagaacgaat ggtgtttctg atgtaccaac ctcaccaaca0102]ttacagaggcctactcatat gaaccaaatg gtgtttcaca aaatcagaaa t0103]<210>60104]JAK2外显子12基因突变及用途序列表0105]<211>130106]<212>PRT0107]<213> 人0108]<400>60109]Met Val PheHis Lys lie Arg Asn Glu Asp Leu lie Phe0110]15 100111]<210>70112]<211>1110113]<212>DNA0114]<213> 人0115]<400>70116]aaatcaaacc ttctagtctt cagaacgaat ggtgtttctg atgtaccaac ctcaccaaca0117]ttacagaggc ctactcatat gaaccaaatg gtgtttcaca aaatcagaaa t0118]<210>80119]<211>240120]<212>PRT0121]<213> 人0122]<400>80123]Met Val PheHis Lys lie Arg Asn Glu Asp Leu lie Leu Phe His Lys0124]15 10 150125]lie Arg AsnGlu Asp Leu lie Phe0126]20
权利要求
JAK2外显子12基因突变，其特征在于，在JAK2外显子12上1640位碱基后面插入序列1的碱基。
2.按权利要求1所述的JAK2外显子12基因突变，其特征在于，所述的插入的碱基编码 序列2的氨基酸序列。
3.权利要求1的JAK2外显子12基因突变的制备方法，其特征在于，通过下述步骤1)采集标本收集疑似骨髓增殖性疾病患者的外周血细胞，提取基因组DNA；2)PCR检测，针对外显子12突变位点，设计引物，获得所测的扩增的目的条带；3)序列分析，获得JAK2外显子12基因突变。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR检测中设计的引物为序列3的 上游引物5’ -AATGGTGTTTCTGATGTACC-3，，序列 4 的下游引物5’ -AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3，。
5.按权利要求1所述的JAK2外显子12基因突变，其特征在于，所述的突变，其所在序 列具有序列7的结构。
6.一种诊断探针，其特征是含有权利要求1所述的JAK2外显子12基因突变。
7.一种抗体，其特征是针对含有权利要求2所述的氨基酸序列。
8.一种试剂盒，其特征是含有权利要求1所述的JAK2外显子12基因突变。
9.一种试剂盒，其特征是含有权利要求7所述的抗体。
10.权利要求1所述的JAK2基因突变在制备诊断骨髓增殖性疾病诊断试剂中的用途。
全文摘要
本发明属基因组学领域，涉及位于JAK2外显子12上的编码序列及其在骨髓增殖性疾病基因诊断中的用途。所述的JAK2基因突变在JAK2外显子12上插入序列1的碱基，其蛋白序列F547变为L547。经实验证实，该突变使特异性的受体酪氨酸磷酸化活性持续增强，使红细胞对细胞因子如EPO的反应增强，持续激活JAK-STAT信号途径，从而发生细胞增殖。本发明的JAK2基因突变对有关骨髓增殖性疾病的基因诊断工作带来了显著的便利，有利于阐明该病的发病机制。利用该突变作为潜在的候选靶位，抑制JAK2基因表达，可为骨髓增殖性疾病的治疗提供新的方法。
文档编号C12P19/34GK101892251SQ200910051739
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者关明, 刘维薇, 张心菊, 许小平, 许笑, 陈勤奋, 陈波斌, 顾小叶, 马玮哲 申请人:复旦大学附属华山医院