制备rna探针的方法及装置的制造方法

制备rna探针的方法及装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核苷酸序列，特别是制备RNA探针的方法及装置，以及能够用以捕获 特定区域的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 目标序列捕获实验的主要用途之一是研究导致疾病发生的遗传变异。全外显子捕 获技术的出现，极大的推动人们对基因和疾病关系的研究。根据统计，大概85%的单基因疾 病突变位点位于外显子区域，与全基因组重测序相比，相同成本下，覆盖度更深、数据准确 性更高，更加简便、经济、高效。它也可用于寻找复杂疾病如癌症、糖尿病、肥胖症的致病基 因和易感基因等的研究。在全基因组测序成本大幅下降之前，捕获测序的方法仍然是疾病 等领域研究的热门测序法，年需求量巨大。
[0003] 2009年，基因组定向捕获工具的出现，让外显子组的捕获成为可能。基于杂交的序 列捕获技术作为低成本高通量对基因组连续或不连续候选区域进行研究的技术，在过去的 三年中已经被广泛用于疾病相关研究，其不仅费用更低，数据的阐释也更为简单。基于杂交 的序列捕获技术作为低成本高通量对基因组连续或不连续候选区域进行研究的技术，在过 去的几年中已经被广泛用于疾病相关研究。目前，Agilent公司的SureSelect液相探针、 Roche NimbleGen的固相芯片以及Roche NimbleGen的EZ液相探针是市场上最成熟的序 列捕获试剂，几乎占领了 90%以上的基于杂交的序列捕获技术市场。由于序列捕获试剂在 生命科学、基因组学及医学方面的火爆市场，从2010年，也有几家其他机构在研发和推出 序列捕获试剂，例如，Illumina在2010年推出了其TruSeq捕获试剂，Life Techonologies 公司2011年秋也将推出了其TargetSeq序列捕获试剂，还有一些小的公司或研究机构正在 研发序列捕获芯片或试剂。

【发明内容】

[0004] 本发明一方面提供一种制备RNA探针的方法，该方法包括：依据目标区域的参考 序列获取多个DNA片段，所述目标区域为基因组的一部分或是整个基因组，所述DNA片段的 全部覆盖所述目标区域的一次或多次，所述DNA片段长度为25-250nt ;修饰所述DNA片段， 使得每个DNA的一个末端带有至少一个启动子、另一个末端带有一段序列（沁" ;扩增修饰 后的DNA片段，获得DNA扩增产物；转录所述DNA扩增产物，获得多个RNA片段，所述多个 RNA片段构成所述RNA探针；其中，N为A、T、C或G，m为N的个数，4〈m〈20。
[0005] 本发明另一方面提供一种试剂盒，其包括利用本发明一方面的方法制备得的RNA 探针，所述RNA探针游离于溶液中，所述RNA探针能够特异性识别人全外显子组。
[0006] 本发明的再一方面提供本发明一方面的试剂盒在捕获外显子区域中的用途。
[0007] 本发明的又一方面提供一种制备RNA探针的装置，该装置能够用以执行完成本 发明一方面的RNA探针制备方法的所有或者部分步骤，该装置包括：DNA片段获取单元， 用于依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段，所述目标区域为基因组的一部分或是 整个基因组，所述DNA片段的全部覆盖所述目标区域的一次或多次，所述DNA片段长度为 25-250nt ;修饰单元，与所述DNA片段获取单元连接，用于修饰所述DNA片段，获得修饰后的 DNA片段使得每个DNA的一个末端带有至少一个启动子、另一个末端带有一段序列（N)"，N 为A、T、C或G，m为N的个数，4〈m〈20 ;扩增单元，与所述修饰单元相连，用于扩增所述修饰 后的DNA片段，获得DNA扩增产物；转录单元，与所述扩增单元相连，用于转录所述DNA扩增 产物，获得多个RNA片段，所述多个RNA片段构成所述RNA探针。
[0008] 根据本发明提供的制备RNA探针的方法，和或制备RNA探针的装置，和/或包含能 够捕获全外显子组RNA探针的试剂盒，能够简单方便的获得RNA探针、RNA液相探针或者获 得能够捕获目标区域的的试剂盒，目标区域可以使人类全外显子区域，人类基因组的其他 区域，如疾病相关区域、全染色体、高变区域等，或者是其它基因组物种的与人类外显子裙 部或部分区域序列相似度高的区域，或者同一环境中混合物种样本恒变区等相似区域。利 用本发明的RNA探针制备方法也能够方便的获得相对较长的RNA探针序列，能够高特异性 捕获目标区域。也能用于其它物种的相似区域的捕获。利用本发明的RNA探针制备方法或 装置制备的探针捕获区域可控、制备成本较低，所需时间较短。
【附图说明】
[0009] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将 变得明显和容易理解，其中：
[0010] 图1是本发明的一个【具体实施方式】中的制备RNA探针的装置示意图；
[0011] 图2是本发明的一个【具体实施方式】中的使用Agilent-51M的测序结果，其中，A为 碱基累积深度图，B为碱基测序深度分布，C为染色体深度覆盖度图；
[0012] 图3是本发明的一个【具体实施方式】中的使用Nimblegen-70M的测序结果，其中A 为碱基累积深度图，B为碱基测序深度分布图，C为染色体深度覆盖度图；
[0013] 图4是本发明的一个【具体实施方式】中的使用本发明的试剂盒BGI kit的测序结 果，其中，A为碱基累积深度图，B为碱基测序深度分布图，C为染色体深度覆盖度图。
【具体实施方式】
[0014] 根据本发明的一个实施方式，提供了一种制备RNA探针的方法，该方法包括以下 步骤：
[0015] 步骤一：依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段。
[0016] 依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段，所述目标区域为基因组的一部分或 者整个基因组，所述DNA片段的全部覆盖所述目标区域的一次或多次，所述DNA片段长度为 25-250nt。参考序列为已知序列，并且参考序列上的各个碱基或核苷酸有位置编号，用于 其它片段序列上的碱基或核苷酸的参考定位，参考序列可以从公开网站或者他人公开的资 料中获得，比如从NCBI数据库获得人的参考基因组序列，也可以是自己测定和/或组装获 得的序列确定的基因组或者基因组的部分片段序列。在本发明的一个【具体实施方式】中，所 说的依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段包括：确定所述目标区域的参考序列，从 所述参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次获取DNA片段直至所述参考序列的另一 端，所述DNA片段之间可以完全重叠、部分重叠或完全不重叠。在本发明的一个具体实施方 式中，可以依据目标区域在参考基因组上的位置获取所述目标区域的参考序列，可以预先 设定DNA片段的长度为一个定值，比如120nt，从所述参考序列的第一个核苷酸开始拷贝所 述参考序列获取第一条DNA片段，接着从所述参考序列的第二个核苷酸开始拷贝所述参考 序列获取第二条DNA片段，这样依次获取后续DNA片段直至第K条DNA片段，第K条DNA片 段的一端超出所述参考序列，其中，K为所述DNA片段的总条数，这样实际上第K条DNA片 段的长度为119nt。在本发明的一个【具体实施方式】中，在获得K条DNA片段后，对DNA片段 进行筛选，以获得GC含量在40-50%的DNA片段，这样能使最终的一组RNA探针的GC含量 都在40-50%，利于这组RNA探针在同一反应体系和/或同一反应条件下进行捕获和/或洗 脱。在本发明的一个【具体实施方式】中，对DNA片段的筛选还包括，将DNA片段比回到目标区 域参考序列上，以获得在参考序列上具有唯一比对位置的DNA片段，这样能够增强最终获 得的一组RNA探针的特异性。
[0017] 本发明的该步骤的实施方式可以编写成程序，借助计算机可读媒介执行该程序来 实现。
[0018] 步骤二：修饰DNA片段。
[0019] 修饰获自步骤一的DNA片段，使得每个DNA片段的一个末端带有至少一个启动子、 另一个末端带有一段序列（沁"，其中，N为A、T、C或G，m为N的个数，4〈m〈20。这样修饰