启动子位点和3'端BsrDI酶切位点的公共序列，总长121nt ;探针的 设计包含两个阶段：第一阶段生成初始探针数据库，第二阶段为探针对比筛选阶段。在第一 阶段，首先利用参考基因组获取目标区域的参考区域信息，从区域的起始位置开始，每次生 成一条探针，生成后每次位置右移一位，直到生成探针的位置加上探针长度超出区域末端。 在第二阶段中，将第一阶段中生成的探针同参考区域进行比对，获得每一条探针在全基因 组上的比对次数，较佳地，保留只比对上全基因组唯一一处地方的探针；另外筛选过程中探 针位置信息即各探针能够特异性结合的区域来源于探针数据库构建阶段，探针要满足能覆 盖预计的区域、预计的的覆盖深度等条件。探针的筛选，一方面要满足区域覆盖，一方面要 满足选取最优的探针比如GC含量40-50%等，为了同时满足上述两个条件，在筛选过程中， 引入窗口筛选机制，在要设计的探针区域上首先设计生成窗口，探针的筛选在窗口中进行， 筛选依据GC含量、探针自身属性如自由能等来计算其分值，选择最优组合。上述设计过程， 包括生成初始探针集和探针的比对筛选过程可利用编写程序，将程序存储在计算机可读介 质上运行来实现。
[0036] 2、在合成仪（Oligo Array?)上合成全部区域的探针（oligo),由于该示例中目标 区域序列过多，使用多张固态芯片进行合成；
[0037] 3、将合成后的oligo从芯片上用氨水洗脱并进行乙醇沉淀法纯化，利用两端的公 共序列设计引物对进行PCR扩增，引物对中的上游序列能够与SP6启动子特异性结合，下游 序列能够与BsrDI酶切位点特异性结合；
[0038] 4、扩增后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收下目的片段进行柱或电泳纯化；
[0039]5、可选择的，酶切3'端公共序列并纯化产物；
[0040] 6、利用ATP、CTP、GTP、UTP、生物素化UTP(biotin-UTP)和RNA酶抑制剂（Rnase inhibitor)将上一步骤的产物体外转录合成RNA探针，可选择的，在完成后消化残留的 DNA，乙醇沉淀法纯化回收探针RNA。
[0041] 以上，多处产物纯化方式均可替换为其他适用的纯化方式，不影响探针制备效果。
[0042] 按上述步骤进行全外显子RNA液相探针制备，用其捕获同一正常男性人类基因组 样本，样本为炎黄（YH)样本，平行测试多个文库，并在Illumina Hiseq2000和Life Ion Proton测序平台分别测序，并统计分析结果，结果如表1和表2所示。
[0043] 表1 Hiseq2000测序平台结果展示
[0044]
[0045]
[0046] 表2 Ion Proton测序平台结果展示
[0047]
[0049] 与现行市场上的产品相比，本试剂盒可获得相对优或者相近的测序结果，包 含按本发明方法制备液相RNA探针的试剂盒与市面上2种试剂盒Agilent-51M和 Nimblegen-70M的捕获测序结果如表3所示，比较结果如图2、图3和图4所示。
[0050] 按照本发明的RNA探针制备流程制备探针的周期较短，对于大规模区域捕获样本 的项目来说成本较低，且可以在项目进行过程中对区域进行增加或修改，可操作性强。
[0051] 表3各试剂盒捕获同一样本同一区域的HiSeq2000/2500平台测序结果
[0052]
【主权项】
1. 制备RNA探针的方法，其特征在于，包括： 依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段，所述目标区域为基因组的一部分或是 整个基因组，所述DNA片段的全部覆盖所述目标区域的一次或多次，所述DNA片段长度为 25~250nt ； 修饰所述DNA片段，使得每个DNA片段的一个末端带有至少一个启动子、另一个末端带 有一段序列（N)m ; 扩增修饰后的DNA片段，获得DNA扩增产物； 转录所述DNA扩增产物，获得多个RNA片段，所述多个RNA片段构成所述RNA探针； 其中，N为A、T、C或G，m为N的个数，4〈m〈20。2. 权利要求1的方法，其特征在于，所述依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段包 括： 确定所述目标区域的参考序列，从所述参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次 获取DNA片段直至所述参考序列的另一端，所述DNA片段之间完全重叠、部分重叠或完全不 重叠。3. 权利要求1的方法，其特征在于，所述依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段包 括： 确定目标区域在参考基因组上的位置，获取所述目标区域的参考序列，从所述参考序 列的第一个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第一条DNA片段，接着从所述参考序列的第 二个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第二条DNA片段，这样依次获取后续DNA片段直至 第K条DNA片段，所述第K条DNA片段的一端超出所述参考序列，其中，K为所述DNA片段 的总数目； 任选地，对所述DNA片段进行筛选，以获得GC含量在40-50 %的DNA片段； 任选地，对所述DNA片段进行筛选，以获得在所述参考序列上具有唯一位置的DNA片 段。4. 权利要求1的方法，其特征在于，所述修饰DNA片段为，在每个DNA片段的5'端加上 至少一个启动子，并且在每个DNA片段的3'端加上所述（N)m; 任选地，所述启动子选自SP6启动子、T7启动子或者T3启动子。5. 权利要求4的方法，其特征在于，所述（N)ni包含至少一个限制性核酸内切酶的识别 和/或酶切位点； 任选地，获得DNA扩增产物后还包括，利用所述限制性内切酶酶切所述DNA扩增产物的 3，端； 任选地，所述限制性核酸内切酶为II型限制性内切酶。6. 权利要求1的方法，其特征在于，所述转录利用的RNA聚合酶，能够特异性识别所述 启动子。7. 权利要求1的方法，其特征在于，在所述转录DNA扩增产物之后，进行DNA消化。8. 试剂盒，其包含权利要求1-7任一方法制备的RNA探针，所述RNA探针游离于溶液 中； 任选地，所述RNA探针能够特异性识别人全外显子组。9. 权利要求8的试剂盒在捕获外显子区域中的用途。10.制备RNA探针的装置，其特征在于，包括： DNA片段获取单元，用于依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段，所述目标区域为 基因组的一部分或是整个基因组，所述DNA片段的全部覆盖所述目标区域的一次或多次， 所述DNA片段长度为25-250nt ; 修饰单元，与所述DNA片段获取单元连接，用于修饰所述DNA片段，获得修饰后的DNA 片段使得每个DNA的一个末端带有至少一个启动子、另一个末端带有一段序列（N)"，N为A、 T、C或G，m为N的个数，4〈m〈20 ; 扩增单元，与所述修饰单元相连，用于扩增所述修饰后的DNA片段，获得DNA扩增产 物； 转录单元，与所述扩增单元相连，用于转录所述DNA扩增产物，获得多个RNA片段，所述 多个RNA片段构成所述RNA探针。
【专利摘要】本发明提供了一种制备RNA探针的方法及装置，以及包含RNA探针的试剂盒，本发明的方法包括：依据目标区域的参考序列获取多个DNA片段，所述目标区域为基因组的一部分或是整个基因组，所述DNA片段的全部覆盖所述目标区域的一次或多次，所述DNA片段长度为25-250nt；修饰所述DNA片段，使得每个DNA片段的一个末端带有至少一个启动子、另一个末端带有一段序列(N)m；扩增修饰后的DNA片段，获得DNA扩增产物；转录所述DNA扩增产物，获得多个RNA片段，所述多个RNA片段构成所述RNA探针；其中，N为A、T、C或G，m为N的个数，4<m<20。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12M1/00, C12N15/10
【公开号】CN105039501
【申请号】CN201410584140
【发明人】谢林, 李振宇, 蒋慧, 林钊, 丘坤龙
【申请人】深圳华大基因科技服务有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年10月27日