水解过敏素的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种水解过敏素的制备方法。具体涉及天然过敏素的纯化的提取液的制备方法，包含步骤：提取包含致敏性蛋白的过敏素天然源以形成提取液；纯化所述提取液以去除非蛋白成分以形成纯化的提取液；将所述纯化的提取液变性以形成纯化的变性提取液，所述纯化的变性提取液包含蛋白，其中一起形成所有蛋白的至少60％的最丰富蛋白为至少两种蛋白，且所有蛋白占纯化的变性提取液干燥重量的至少60％。以及，天然过敏素的纯化的提取液的制备方法，其包含步骤：水解变性过敏素以形成过敏素水解产物；纯化所述过敏素水解产物以去除分子量超过10,000Da和低于1,000Da的肽，从而获得纯化的水解产物，其中70％更优选80％的肽介于10,000和1,000Da间。
【专利说明】
水解过敏素的制备方法
[0001 ] 本申请是申请号200780023913.3，申请日为2007年6月28日，发明名称为"水解过 敏素的制备方法"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及天然过敏素的提取液的制备方法、来自这些提取液的肽以及可由新型 方法获得的过敏素提取液。
【背景技术】
[0003] 普通的过敏素为花粉、尘螨、霉菌、药物、食物和动物毛发和皮肩。
[0004] 最普通的过敏反应疾病为鼻炎，哮喘和特应性皮炎。过敏性哮喘为慢性炎性紊乱。 通过使用抗阻胺药、诘抗剂(0-antogonists)和皮质类固醇实现过敏性紊乱的症状治疗。
[0005] 此外，所谓的"特效"免疫疗法基于脱敏作用。通常对患者实施特效冒犯性 (offending)过敏素的皮下注射。治疗起始于小的过敏素剂量并增加计量。通常治疗保持几 年。此类治疗遭受纯的患者顺应性，且因为患者经受严重的过敏性反应之苦，该类治疗由于 安全性原因而被质疑。
[0006] 除了包含重复的皮下注射的方法之外，还有口腔脱敏作用的方法。
[0007] 美国专利4，822，611公开了包含使用过敏素的口腔治疗的治疗过敏的方法。美国 专利4,822,611描述了显示来自不同制造商的提取液的逐批差异和不同的商购"散装"致敏 性提取液。未描述这些提取液的制备。
[0008] GB 1 247 614公开了提取过敏素的方法。该方法的目的是通过包括所有可提取的 过敏素成分得到更完全和有效的致敏性提取液。
[0009] 美国专利5,770,698公开了过敏性活性蛋白质提取液的提纯方法。图2的谱未显示 280nm的峰。这意味着所述提取液含有显著含量的非蛋白质杂质。W0 99/22762公开了类似的 方法，因此，产物也包含大量非蛋白质杂质。
[0010] 在另一方面，有发展基于单表位的高特效制剂的趋势。例如，W0 00/58349公开了 分离并纯化的包含两个肽键远离酪氨酸/精氨酸对的亮氨酸的肽。能使用这些肽制备药物 组合物以完成治疗或预防，在此情况下尤其用于狗的犬过敏反应。
[0011] 在一方面，使用方法以纯化特定识别的单个致敏性分子。在另一方面，人们试图制 造尽可能完全的致敏性提取液。
[0012] 根据第一选择，过敏素制剂无相关的表位以在确定的患者内引发耐受性一直都有 可能。第二选择具有逐批差异的缺点和存在能够引起免疫反应的化合物(如DNA分子、碳水 化合物、它们的络合物的脂)的缺点。
【发明内容】
[0013] 本发明的一个目标是克服现有技术的至少一些缺点，特别是提供来自天然过敏素 的抗原，所述抗原相比于粗过敏素提取液具有显著降低的引起变应原性反应的能力，但也 能够刺激T-细胞。
[0014] 通过提供过敏素提取液的制备方法解决了所述问题，该过敏素提取液包含大多数 蛋白质（该蛋白质含有部分过敏素提取液)但具有降低的，优选非常低含量非蛋白质成分 (如核酸、脂、糖等）。
[0015] 本发明制备的提取液优于现有技术的提取液，特别是本发明制备的提取液显示可 再生的蛋白质组合物而不会被纯化至单表位。
[0016] 本发明的过敏素提取液的制备方法包含如下步骤：
[0017] a)提取包含致敏性蛋白质的过敏素天然源以形成提取液，
[0018] b)纯化所述提取液以去除非蛋白质成分以形成纯化的提取液，
[0019 ] c)将所述纯化的提取液变性以形成纯化的变性提取液，
[0020] 所述纯化的变性提取液包含蛋白质，其中最丰富(w/w)的蛋白质(其一起形成所有 蛋白质的至少60% (w/w))为至少两种蛋白质，且所有蛋白质占纯化的变性提取液干燥重量 的至少60% (w/w)。
[0021] 该方法称为方法I。
[0022] 与现有技术的方法相反，本发明的方法制备主要包含蛋白质的过敏素提取液而不 会将所述提取液纯化至单肽或蛋白质。
[0023] 与现有技术的产物相反，本发明的产物具有如下优点：
[0024] -基本上去除了除蛋白质之外的免疫物质；
[0025] _天然过敏素提取液能够刺激T-细胞而具有降低的引起迅速过敏性反应(嗜碱性 粒细胞活化、肥大细胞脱颗粒)的能力。
[0026] 能使用不同的天然过敏素作为起始原料。典型的天然起始原料为牛奶、毒液、蛋、 杂草、草、树、灌木、花、蔬菜、谷物、菌类、水果、浆果、坚果、种子、豆类、鱼类、贝类、海产、肉 类、香料、昆虫、螨类、霉菌、动物、鸽子扁虱、蠕虫、海鸡冠、动物皮肩、线虫、巴西橡胶树，以 及它们的混合物。
[0027] 在材料提取之后，纯化提取液以去除非蛋白质成分，如糖、脂、核酸等。典型的几个 不同的蛋白质以纯化的提取液的蛋白馏分存在。
[0028] 根据现有技术，一种蛋白质被纯化而其他剩余蛋白质为"杂质"。
[0029]相反，本发明的目的是一起纯化蛋白质。使用如SDS-PAGE的方法并接着通过密度 测量法能轻易地测量纯化的提取液中的蛋白质的相对含量。
[0030]对于蛋白质总重量的60%，需要结合至少两种最主要的蛋白质，即，没有单个蛋白 质占所有蛋白质的60 %(w/w)或更多。更优选地，所有蛋白质的60 %由至少3种主要的蛋白 质形成，优选由至少4种主要的蛋白质且更优选由至少5、6、7、8、9或10种蛋白质形成。
[0031]例如，有如下蛋白质：
[0032] 蛋白质 1:27%
[0033] 蛋白质 2:13%
[0034] 蛋白质 3:34%
[0035] 蛋白质 4:19%
[0036] 蛋白质 5:17%
[0037] 一起形成至少60%( ? 60%或更多）的最主要的蛋白质为蛋白质3 + 1(34+27 = 61%)〇
[0038] 此外，纯化的提取液的蛋白质总含量为纯化的提取液的至少60重量％，所述含量 优选为纯化的提取液的至少70重量％或80重量％，更优选为90重量％。
[0039] 优选用水溶液进行提取。合适的盐为但不限制于如碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、醋 酸盐、TRIS 和 HEPES。
[0040] 也与许多其他提取方法不同，优选提取介质的量相对较大，即至少为过敏素天然 源重量的20倍，优选为所述重量的100倍或更多。
[0041 ]可通过如下的一种或多种进行提取液的纯化：
[0042] -离子交换色谱法步骤(包括阴离子交换色谱法和阳离子交换色谱法），
[0043] -体积排阻色谱法步骤(也称为凝胶过滤），
[0044] -沉淀步骤，
[0045]-疏水相互作用色谱法步骤，
[0046] -假亲合和亲合色谱法，和/或
[0047] -渗滤。
[0048] 在优选的具体实施方案中使用离子交换色谱法，其中在阳离子交换剂的情况下负 载溶液的pH介于阳离子交换剂的酸性官能pKa和具有提取液中的蛋白质的最低pKa的蛋白 质的pKa之间。在阴离子交换剂的情况下所述pH介于阴离子交换剂的碱性官能pKa和具有组 成提取液的蛋白质的最高pKa的蛋白质的pKa之间。
[0049] 通过该方法，所有的蛋白质结合于离子交换剂上，而中性杂质以及与离子交换树 脂具有相同电荷的杂质将被去除。
[0050] 在优选地具体实施方案中，用包含一种或多种表面活性剂和/或变性剂的溶液进 行至少一个纯化步骤。所述表面活性剂可为非离子型、阴离子型、阳离子型或两性的。合适 的变性剂为离液剂、还原剂和它们的混合物。合适的变性剂为例如尿素、盐酸胍、乙二醇、异 丙醇。尿素的合适浓度为3M或更高，优选4M或更高。胍盐的合适的浓度优选为2M，优选为3M 或更高。乙二醇和/或异丙醇的合适浓度为5重量％或更高，更优选为10重量％或更高，不超 过20重量％。
[0051] 在一些情况中，根据本发明的方法I制备纯化的提取液是足够的。此类提取液可用 于制备活体外/活体内以及试管内诊断、过敏性疾病的预防和治疗。本发明的进一步的具体 实施方案为由方法I的提取液或者由任何其他来源制备过敏素水解产物的方法。若所述提 取液来自任何其他纯化的过敏素源而非来自方法I，需要一个变性的初步步骤以改进消化 性。
[0052]所述方法(方法II)包含如下步骤 [0053] a)水解变性过敏素以形成过敏素水解产物，
[0054] b)纯化所述过敏素水解产物以去除分子量超过10，OOODa和低于1，OOODa的肽，从 而获得纯化的水解产物，其中70%，更优选80%的肽介于10，000Da和1，000Da之间。
[0055]由此获得的产物的优点是所述肽为变性蛋白质的消化结果。由于特定的大小标 定，所述肽具有降低的诱导快速过敏性反应以及促炎症反应的能力。
[0056]如需要，优选在离液剂、还原剂或它们的混合物的存在下进行变性。合适的离液剂 为例如尿素和盐酸胍。典型的还原剂为例如二硫苏糖醇(dithiotriethol)、0_疏基乙醇、硫 代甘油和它们的混合物。
[0057]通常用酶进行水解步骤。合适的酶为例如胃蛋白酶、胰岛素、糜蛋白酶。也能在离 液剂，优选尿素或盐酸胍的存在下进行该水解步骤。在水解过程中尿素和盐酸胍的浓度应 低于4M，优选低于3M。
[0058]在方法II的步骤b)中，分子量大于10,000Da或小于l，000Da的肽被去除。
[0059] 因此，纯化的水解产物的肽包含分子量介于1,000至10,000Da的肽。去除大或小的 肽的合适方法为超滤和体积排阻色谱法。该体积排阻色谱法也可在离液剂，例如尿素、盐酸 胍、乙二醇、异丙醇和它们的混合物的存在下进行。
[0060] 本发明的进一步的具体实施方案为可由本发明的方法I获得的过敏素提取液。通 常在该提取液中，以重量计最主要的蛋白质（其一起形成所有蛋白质的至少60重量％)为至 少2种蛋白质，优选至少3或4种蛋白质或更优选至少5、6、7、8、9或10种蛋白质。通过光密度 260?见到纯度:光密度280 nm-比率〈1，优选〈0.9，更优选介于0.75和0.9之间。
[0061] 进一步的具体实施方案为可由方法II获得的过敏素水解产物。所述过敏素水解产 物能用于：
[0062]-过敏性疾病的活体内诊断：点刺试验、皮内注射、结膜、吸气和吸入试验；
[0063] _过敏性疾病的活体外和试管内诊断:试验中所用的ELISA试剂盒或标准样品；
[0064] -过敏性疾病的预防和治疗：用于脱敏/脱敏作用治疗以及结合/不结合佐剂的免 疫应答调节。
[0065] 本发明的过敏素提取液能用于药物组合物和/或食物组合物的制备以诱导耐受 性。耐受性的诱导能用于治疗和防止过敏性反应。
[0066] 本发明的进一步的具体实施方案为包含完整形式或水解形式的本发明的过敏素 提取液的药物组合物。此外，药物组合物可包含一种或多种如下物质:三磷酸核苷、二磷酸 核苷、单磷酸核苷、核酸、肽核酸、核苷或它们的类似物、免疫抑制细胞因子、诱导免疫蛋白 酶体、1，25_二羟基维生素D3或它们的类似物的表达的化合物、脂多糖、内毒素、热休克蛋 白、具有NADPH或NADP-硫氧还蛋白还原酶的硫氧还蛋白、二硫苏糖醇、如舒喘灵的肾上腺素 能受体、如丁氧胺的肾上腺素能受体、调节粘连分子ICAM-1、N-乙酰基-L-半胱氨酸、y-L-谷 氨酰基-L-半胱氨酰-甘氨酸(还原的L-谷胱甘肽）、a-2-巨球蛋白的表达的化合物、Foxp3基 因表达的诱导物、黄酮类、异黄酮类、紫檀碱化七61'0〇3印3]1〇1(18)、如白藜芦醇的二苯乙稀、 速激肽受体拮抗剂、糜酶抑制剂、类似CpG或MPL的疫苗佐剂或类似酵母多糖、0-1，3_葡聚糖 的致耐受性佐剂、调节T-细胞诱导物、将粒子粘合至肠粘膜的粘膜-粘连剂(如植物凝集素、 锌、锌盐、多糖、维生素和细菌溶菌产物）。
[0067] 基于组合物中的天然过敏素源，可包含选自花粉过敏素、牛乳过敏素、毒液过敏 素、蛋过敏素、杂草过敏素、草过敏素、树过敏素、灌木过敏素、花过敏素、蔬菜过敏素、谷物 过敏素、菌类过敏素、水果过敏素、浆果过敏素、坚果过敏素、种子过敏素、豆类过敏素、鱼类 过敏素、贝类过敏素、海产过敏素、肉类过敏素、香料过敏素、昆虫过敏素、螨类过敏素、霉菌 过敏素、动物过敏素、鸽子扁虱过敏素、蠕虫过敏素、海鸡冠过敏素、动物皮肩过敏素、线虫 过敏素、巴西橡胶树过敏素的过敏素。
[0068] 在优选的具体实施方案中，制备药物组合物用于口腔施用、用于舌下药物传递、用 于肠道药物传递。
【附图说明】
[0069] 图1:通过IgG免疫印记确定的免疫反应性。带1:分子量标记，带2:粗蛋白质提取 液，带3:纯化的过敏素变性提取液。由BSA 5%和牛乳3%封闭膜。患者血清稀释至1/250。 IgG结合通过稀释至1/2,500的羊抗人IgG HRP检测并通过TMB载体揭示。过敏素1: ±61-541^)&，过敏素2:±36-311^)&。
[0070] 图2:通过IgE免疫印记确定的免疫反应性。带1:分子量标记，带2:粗蛋白质提取 液，带3:纯化的蛋白质。由BSA 5 %和牛乳3 %封闭膜。患者血清稀释至1 /5。IgE结合通过稀 释至1/10,000的羊抗人IgE HRP检测并通过TMB载体揭示。过敏素l:±61-54kDa，过敏素2: ±36-31kDa。
[0071]图3:SEC G25洗脱曲线的排阻峰。柱体积/样品体积的比率为12。使用三HC1 25mM、 尿素1.5M，pH 8.0以9毫升/分钟的流速平衡树脂。通过280nm的吸光度跟踪洗脱。
[0072] 图4:通过SDS-PAGE确定的蛋白质曲线。4-12%双-三凝胶。带1:分子量标记，带2: 纯化的过敏素变性提取液。使用考马斯亮蓝R-250进行染色。
[0073]图5:通过SDS-PAGE确定的蛋白质和肽曲线。4-12%双-三凝胶。带1:分子量标记， 带2:纯化的过敏素变性提取液(13微克），带3:水解产物（13微克）。使用考马斯亮蓝R-250进 行染色。
[0074] 图6:G50SEC洗脱曲线。使用尿素2M、NaCl 100mM，pH 3.0平衡柱子。流速为15毫升/ 分钟。柱体积/样品体积的比率为10。通过280nm的吸光度跟踪洗脱。
[0075]图7:HPLC分析的标定曲线。将10微升如下标准样品（1毫克/毫升)注射至BioSep-SEC S2000柱：1.牛血清白蛋白（66kDa)，2.乳球蛋白（18.5kDa)，3.细胞色素C( 12kDa)，4. 高血糖素(3.5kDa)，5. lkDa合成肽。
[0076] 图8 :体积排阻HPLC曲线。柱：BioSep-SEC S2000(reENOMENEX)。洗脱缓冲液： Na2HP〇4 50mM-SDS 0.5%(w/v)pH 6.8。流速为1毫升/分钟。在214_检测。注射10微升样品。 使用介于10kDa和lkDa界限之间的曲线下面积计算感兴趣的肽的百分率。
[0077] 图9:花粉衍生产物的变应原性性质。用增加浓度(0、1、10、100和1000纳克/毫升） 的花粉粗提取液，花粉纯化的蛋白质和花粉纯化的肽孵育来自花粉过敏志愿者的血样。通 过具有在IgE-阳性白细胞上的门控的流式细胞术测定gp53蛋白质表达。结果表述为活化细 胞中的gp53阳性细胞百分数(2次测量的平均±偏差）。
[0078]图10:通过花粉蛋白质和花粉肽进行的人类PBMC增殖性的刺激。在增加浓度（10 30和90微克/毫升）的花粉蛋白质或花粉肽存在下在37°C孵育由花粉过敏志愿者纯化的人 类PBMC 5天。将[3H]-胸腺嘧啶核苷加入细胞培养基16小时，并使用液体闪烁原理利用拆十 数器测定所述[ 3H]_胸腺嘧啶核苷的掺入。结果表述为5次测量的平均。本发明的方法进一 步通过如下非限制性的实施例示例。
【具体实施方式】
[0079] 实施例
[0080] 实施例1:提取
[0081 ]将1 % (w/v)花粉（来自 ALLERG0N的Lolium perenne)加入碳酸氢钠（12? 5mM)并在 搅拌下孵育2小时。然后通过加入2% (w/v)的硅藻土(ACROS)并通过0.2微米的过滤器使所 述溶液澄清并过滤。该样品构成粗提取液。
[0082]使用花粉过敏患者的血清通过免疫印迹分析提取液中过敏素的存在。用抗人IgG 或IgE抗体使IgG和IgE表位显影。
[0083]如图1和图2所示，在提取液中有两种主要的过敏素。
[0084] 将所述粗提取液酸化至pH 3.0并加入Tween 20(0.1%，v/v)。该样品构成酸化的 提取液。
[0085]实施例2:过敏素蛋白质的纯化 [0086] 所述过敏素提取液通过如下进行纯化：
[0087]-阳离子交换色谱法
[0088]用28X床体积（Bv)的碳酸氢钠 12.5mM、柠檬酸盐30mM，pH 3.0、Tween 20 0.1% (v/v)平衡微孔离子交换膜（sartobind)Sl莫(SART0RIUS)。将所述酸化的提取液加载至所 述平衡膜。最初用35XBv的碳酸氢钠12.5mM、梓檬酸盐30mM，pH 3.0、Tween 20 0.1%(v/v) 冲洗柱子，然后用42XBv的碳酸氢钠12.5mM、柠檬酸盐30mM，pH3.0冲洗柱子。用碳酸盐 0.1M、氯化钠0.5M，pH 9.15洗脱蛋白质。通过280nm的0D跟踪蛋白质的存在。集中感兴趣的 馏分(图3)。
[0089]-硫酸铵沉淀 [0090] 该步骤在〇-4 r下进行。
[0091 ]将达到90%饱和的一定数量的硫酸铵在搅拌下加入产物。在盐全部溶解之后停止 搅拌。所述悬浮液孵育过夜并在15分钟期间以10,000g离心2次。每次仔细丢弃上清液。 [0092]-变性
[0093] 将微粒以9毫克/毫升再悬浮于尿素6M、DTT 10mM、三HC1 0.1M，pH 8.0,并在37°C 下孵育1小时。
[0094]-在G25树脂(来自AMERSHAM的细Sephadex)上的体积排阻色谱法
[0095] 将所述变性样品加载至柱子并用三HC1 25mM、尿素1.5M，pH 8.0洗脱蛋白质。
[0096]通过在280nm的0D测量跟踪蛋白质的存在。集中感兴趣的馏分以构成纯化的变性 过敏素提取液。
[0097]进一步分析所述纯化的过敏素提取液。测定蛋白质含量(BCA测定)和干燥重量以 评估蛋白质纯度。通过去除碳水化合物(苔黑酚试验)并也通过0D26Q/0D28Q的降低跟踪纯化 效率。
[0098]表1:去除非蛋白质组分以形成纯化的提取液
[0100] 如表1所示，所述纯化方法允许：
[0101] -提取液中蛋白质百分率由~15%增加至80%;
[0102] -0D26q/0D28()比率趋于0 ? 5(其表示纯蛋白质）；
[0103] -碳水化合物的显著去除(剩余含量代表蛋白质的碳水化合物部分）。
[0104] 图4表示对于纯化的变性过敏素提取液得到的典型的SDS-PAGE曲线。由图可见，6 种蛋白质占纯化的提取液中的蛋白质总重量的至少60 %。
[0105] 实施例3:变性过敏素提取液的水解
[0106] 使用如下规程水解所述提取液：
[0107] 将所述纯化的过敏素提取液酸化至pH 2.0。以2.5毫克/毫升的花粉蛋白质和 lEu. Ph. U的胃蛋白酶(MERCK)(对于337毫克蛋白质)在37 °C和2小时期间进行消化。
[0108]图5显示了纯化的提取液(带2)和水解的提取液(带3)之间的比较。由图可见，在用 胃蛋白酶孵育之后，对应于变性未消化蛋白质的高分子量蛋白质消失。
[0109] 实施例4:纯化
[0110] 为了去除MW2 10,000Da和l，000Da的肽，通过如下方式纯化所述水解产物：
[0111] -在G50树脂(来自AMERSHAM的细Sephadex)上的体积排阻色谱法。
[0112] 将16.5%(v/v)的异丙醇和0.1M NaCl加入所述水解产物。迅速将该样品加载至 G50柱。洗脱所述肽并集中含有肽(Mff< 1 OkDa)的馏分，如图6所示。
[0113] -在lkDa膜上的渗滤(来自PALL的超滤卡Omega PES)。
[0114] 将所述肽浓缩10 X，用10体积的三HC1 50mM pH 7.4渗滤，并最终浓缩2.5 X。该样 品构成纯化的过敏素水解产物。
[0115] 通过体积排阻HPLC控制纯化的效率。用Na2HP〇4 50mM-SDS0.5%(w/v)pH 6.8以1毫 升/分钟的流速平衡BioS印-SEC S2000柱(PHENOMENEX)。在214nm处检测肽。
[0116] 如图7所示例由标定曲线计算10kDa和lkDa界限。
[0117] 如图8所示，分子量介于1，OOODa和10，OOODa之间的肽占纯化的水解产物中所有肽 的约75 %。
[0118] 实施例5:变应原性的降低
[0119] 通过测量其诱导嗜碱性细胞脱粒的能力评定花粉粗提取液(根据实施例1)、纯化 的花粉蛋白质(根据实施例2)和纯化的花粉肽(根据实施例4)的变应原性性质。
[0120]在试管内对用增加浓度的花粉粗提取液、纯化的蛋白质和纯化的肽孵育的来自花 粉过敏志愿者的新鲜人类血样进行试验。通过测量、通过流式细胞法、在活化细胞（即IgE阳 性细胞）的细胞膜上的gp53蛋白质标记的表达评定嗜碱性细胞脱粒。该蛋白质通常在剩余 细胞内的颗粒的膜中存在，且一旦细胞活化会出现在细胞表面（由于颗粒的膜与细胞质膜 的融合）。因此通过标记的特定抗-gp53抗体，该蛋白质变得可检测。如图9所示，相比于纯化 的蛋白质，纯化的肽为约30X较不致敏，且相比于花粉粗提取液，纯化的肽为100X较不致 敏。
[0121 ]实施例6:花粉蛋白质和花粉肽的致免疫性
[0122] 通过测量其激发人类外周血单核细胞(PBMC)的增殖性研究过敏素蛋白质和肽的 致免疫性。
[0123] 将通过密度梯度离心纯化的PBMC(其来自"花粉-致敏性"志愿者的血样)在增加浓 度的花粉蛋白质和花粉肽存在下在96-孔板中培养5天。在第5天，将[ 3H]_胸腺嘧啶核苷加 入细胞培养基并进一步在37°C下孵育所述板16小时。使用液体闪烁原理利用拆十数器测定
[3H]-胸腺嘧啶核苷的掺入(图10)。
[0124]花粉蛋白质(根据实施例2)和花粉肽(根据实施例4)以剂量浓度依赖性的方式激 发人类PBMC的增殖。由过敏素肽诱导的增殖略微低于在应答蛋白质中所观察到的增殖。这 些结果显示肽的制备方法保持了大多数在T细胞活化中牵涉的过敏素的表位。
【主权项】
1. 一种纯化的过敏素水解产物的制备方法，该制备方法包含如下步骤： -提取包含致敏性蛋白质的过敏素天然源以形成提取液， -纯化所述提取液以去除非蛋白质成分以形成纯化的提取液， -将所述纯化的提取液变性以形成纯化的变性提取液，其中使用离液剂和还原剂的混 合物进行变性，所述纯化的变性提取液包含蛋白质，其中一起形成所有蛋白质的60%或更 多(w/w)的最丰富(w/w)的蛋白质为至少两种蛋白质，且所有蛋白质占纯化的变性提取液干 燥重量的至少60% (w/w)， -水解所述纯化的变性提取液以形成过敏素水解产物， -纯化所述过敏素水解产物以去除分子量超过l〇,〇〇〇Da和低于l，000Da的肽，从而获得 纯化的水解产物，其中80 %的肽介于10，OOODa和1，OOODa之间。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在不含盐或包含选自碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、醋 酸盐、TRIS或HEPES的盐的溶液中进行所述提取。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中用提取介质进行所述提取，其中提取介质的重 量为过敏素天然源重量的至少20倍。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中用提取介质进行所述提取，其中提取介质的重 量为过敏素天然源重量的100倍。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包含一个或多个离子交换色谱法步骤、凝 胶过滤或体积排阻色谱法步骤、沉淀步骤、疏水相互作用色谱法步骤、假亲合或亲合色谱法 步骤或渗滤步骤。6. 根据权利要求5所述的方法，其中使用包含表面活性剂和/或变性剂的溶液进行至少 一个纯化步骤。7. 根据权利要求6所述的方法，其中 所述离液剂选自：尿素、盐酸胍、及其混合物，以及 其中，所述还原剂选自：二硫苏糖醇、硫代甘油、β-巯基乙醇及其混合物。8. 根据权利要求7所述的方法，其中尿素的浓度高于4Μ和/或盐酸胍的浓度超过3Μ。9. 根据权利要求7所述的方法，其中尿素的浓度高于5Μ和/或盐酸胍的浓度超过4Μ。10. 根据权利要求1或2所述的方法，其中使用酶进行水解。11. 根据权利要求1或10所述的方法，其中使用胃蛋白酶、胰蛋白酶或糜蛋白酶进行水 解。12. 根据权利要求1或10所述的方法，其中在离液剂的存在下进行水解。13. 根据权利要求1或12所述的方法，其中在尿素和盐酸胍的存在下进行水解。14. 根据权利要求1或10所述的方法，其中通过体积排阻色谱法和/或通过超滤进行肽 的去除。15. 根据权利要求14所述的方法，其中在离液剂存在下进行体积排阻色谱法步骤。16. 根据权利要求14所述的方法，其中在尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇或其混合物存在 下进行体积排阻色谱法步骤。17. 根据权利要求1或10所述的方法，其中 所述过敏素选自：花粉过敏素、牛乳过敏素、毒液过敏素、蛋过敏素、杂草过敏素、草过 敏素、树过敏素、灌木过敏素、花过敏素、蔬菜过敏素、谷物过敏素、菌过敏素、水果过敏素、 浆果过敏素、坚果过敏素、种子过敏素、豆过敏素、鱼过敏素、贝过敏素、海产过敏素、肉过敏 素、香料过敏素、昆虫过敏素、螨过敏素、霉菌过敏素、动物过敏素、鸽子蜱过敏素、蠕虫过敏 素、海鸡冠过敏素、动物皮肩过敏素、线虫过敏素和巴西橡胶树过敏素。18. 可通过权利要求1或10所述的方法获得的纯化的过敏素水解产物。19. 权利要求18的所述过敏素水解产物用于制备诱导耐受性的药物组合物的用途。20. 权利要求18的所述过敏素水解产物用于食物组合物的用途。21. 根据权利要求19所述的用途，其中耐受性的诱导用于治疗或防止过敏性反应。22. -种药物组合物，其包含权利要求18的所述过敏素水解产物。23. 根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述过敏素选自花粉过敏素。24. 根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述过敏素选自螨类过敏素。25. 根据权利要求22所述的药物组合物，用于口腔施用、用于舌下药物传递、用于肠道 药物传递。
【文档编号】A61K39/35GK105854012SQ201610191809
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2007年6月28日
【发明人】T·莱贡, S·皮罗顿, G·普拉希尔
【申请人】生物技术工具公司