半滑舌鳎cd94的应用
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎CD94的应用。CD94在用于制备凝集细菌或杀菌的制剂中的应用；所述CD94重组蛋白为经CD94在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。本发明重组CD94用于制备凝集细菌和杀菌的抗菌制剂。本发明的CD94能够凝集和杀死鱼类病原菌。CGMCC No.198520070322
【专利说明】
半滑舌鳎GD94的应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎CD94的应用。
【背景技术】
[0002]⑶94是自然杀伤细胞表面的Π型膜糖蛋白分子，分子量约为24kDa，属于C型凝集素家族V类的成员。CD94在绝大多数NK细胞中均有表达，同时还分布于γδΤ细胞和αβΤ细胞亚群。⑶94的C末端胞外区有一个C型凝集素结构域(CTLD)，可以结合蛋白和糖类分子。⑶94在哺乳动物中能够和自然杀伤细胞2型家族分子(NKG2)形成异质二聚体，其自身也能形成同源二聚体。CD94/NKG2异质二聚体能够识别靶细胞特异性的主要组织相容性复合体I分子(MHC I)，并且激活或抑制自然杀伤细胞的胞毒活性，进而在抗微生物、抗肿瘤、保持自身耐受性和控制自身免疫疾病的过程中发挥重要的作用。目前，对于CD94的研究主要集中在人和小鼠等哺乳动物中。在鱼类中CD94的同源序列已经被报道，但是其功能和应用研究尚缺乏。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种半滑舌鳎CD94的应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种半滑舌鳎CD94的应用，CD94在用于制备凝集细菌或杀菌的制剂中的应用。
[0006]所述CD94在用于制备鱼类病原菌的凝集细菌或杀菌的制剂中的应用。
[0007]所述CD94在用于制备鱼类病原菌鳗弧菌或哈氏弧菌的凝集细菌或杀菌的制剂中的应用。
[0008]所述CD94为重组CD94蛋白。
[0009]所述⑶94重组蛋白为经⑶94在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。
[0010]所述重组CD94蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，采用CD94F1/CD94R1为引物进行PCR扩增，PCR产物经过与载体pBS-T连接转换后与载体pET259连接，获得质粒pEtCD94，转化大肠杆菌BL21 (DE3)即可表达重组CD94。
[0011]所述CD94F1为5，-GATATCATGGATCCACCAGAGAGCTTCAC-3，； CD94R1 为5，-GATATCAAACTCCTTCGTACAAACCCATGGT-3’。
[0012]本发明具有如下优点:本发明的CD94能够凝集和杀死鱼类病原菌。
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例提供的纯化的CD94重组蛋白。其中，泳道I，分子量标准；泳道2，CD940
[0014]图2为本发明实施例提供⑶94重组蛋白的细菌凝集作用。其中鳗弧菌(上二图)和哈氏弧菌(下二图)与CD94重组蛋白分别在TBS和TBS-Ca2+中保温，随后细菌经DAPI染色，用显微镜观察细菌凝集。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0016]实施例1
[0017]CD94重组蛋白(rCD94)的制备
[0018]I)表达⑶94重组蛋白的质粒pEt⑶94的构建:
[0019]本发明中的CD94的序列已报道(GenBankaccess1n number XP_008320211.I)。CD94具有典型的自然杀伤细胞受体家族C-type lectin-like结构域(氨基酸81-207)。
[0020]pEtCD94的构建如下:以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物CD94F1和CD94R1进行PCR扩增。PCR条件为:94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s,62°C 60s,72°C 60s，5个循环后改为94°C 40s,65°C 60s,72°C 60s，30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2 — 4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5a后在含有lOOyg/ml安卡青霉素、40yg/ml 5_溴_4_氯_3_吲哚-β-D-乳糖苷和24yg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18 — 24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒PBSCD94。将表达载体pET259(pET259构建过程参见Hu YH,Zheng Wff,Sun L.1dentificat1n and molecular analysis of a ferritin subunitfrom red drum(Sciaenops ocellatus).Fish Shellfish Immunol2010;28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后回收5.3kb，同时将pBSCD94用EcoRV酶切回收0.6kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2 — 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pEtCDQLDNA测序表明pEt⑶94含有编码⑶94序列的基因，并具有⑶94相关特征。
[0021]所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5% 蒸馏水。所述 CD94F1 为 5 ’ -GATATCATGGATCCACCAGAGAGCTTCAC-3 ’ ； CD94R1 为 5 ’ -GATATCAAACTCCTTCGTACAAACCCATGGT-3’。
[0022]2)⑶94重组蛋白r⑶94的诱导表达和纯化
[0023]将上述的质粒pEtCD94用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18 — 24小时，挑取转化子，将其命名为BL21/pEtCD94。将BL21/pEtCD94于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养;取11111过夜后的培养液，加入10ml新鲜的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37 °C下转速200rpm摇动培养至OD6qq为0.6，加入终浓度为ImM的IPTG，16 °C继续以转速160印111摇动培养9-1011，而后以5000g，4°C离心1min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以1000g，4°C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns (购于美国GEHeal thcare公司)回收纯化，将纯化的蛋白悬浮于I3BS缓冲液。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25 — 30min，随后15v/cm电压下电泳2 — 2.5h)。结果表明，纯化的蛋白只有一条带，其分子量大小与CD94完全吻合(参见图1)。
[0024]所述裂解液为终浓度的1mM NaH2PO^lOmM Tris和8M尿素，pH 8.0。
[0025]所述PBS组成成分按重量百分比计:0.8% NaCl，0.02%KC1，0.358%Na2HPO4.12H20,0.024%NaH2PO4，余量为水。
[0026]实施例2
[0027]rCD94的细菌凝集作用
[0028]步骤I)细菌悬液制备
[0029]在LB培养基中分别培养鳗弧菌和哈氏弧菌，分别培养至OD6qq为0.8，然后离心(5000g，4°C，1min)，收集各自菌体;将获得菌体分别悬浮于TBS或TBS-Ca2+中至终浓度为19Cfu/ml，即为鳗弧菌TBS悬液、鳗弧菌TBS-Ca2+悬液、哈氏弧菌TBS悬液、哈氏弧菌TBS-Ca2+悬液。
[0030]所述暢弧菌购于美国ATCC(Americantype culture collect1n)，编号68554，分类名为Vibr1 anguillarum。所述哈氏弧菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为:CGMCC N0.1985,保藏日期2007.3.22，分类命名为哈氏弧菌(Vibr1 harveyi);保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号，。
[0031]所述TBS组成成分:50mMTris-HCl,100mM NaCl,pH 7.5。
[0032]所述TBS-Ca2+是TBS含有1mMCa2+。其组成成分:1mM Ca2+,50mM Tris-HCl，10mMNaCl,pH 7.5。
[0033]步骤2)细菌凝集
[0034]将实施例1纯化的rCD94加入上述步骤I)的鳗弧菌TBS悬液、鳗弧菌TBS-Ca2+悬液、哈氏弧菌TBS悬液、哈氏弧菌TBS-Ca2+悬液至终浓度为50uM，25°C保温lh。保温后细菌用4，6_diamino-2-phenyl indole(DAPI)(购于Invitrogen,美国)染色Ih，随后用显微镜观察细菌凝集情况。具体方法参见文献Zhou ZJ,Sun L.CsCTLl,a teleost C-type lectin thatpromotes antibacterial and antiviral immune defense in a manner that dependson the conserved EPN motif.Dev Comp Immunol.2015; 50:69-77。结果表明，在TBS-Ca2+中，rCD94诱引起明显的鳗弧菌和哈氏弧菌凝集，但是在TBS中则无凝集现象(见图2)，说明r⑶94是钙离子依赖型的细菌凝集因子。
[0035]实施例3
[0036]⑶94重组蛋白的杀菌作用
[0037]步骤I)细菌悬液制备
[0038]在LB培养基中分别培养鳗弧菌和哈氏弧菌T4，分别培养至OD6qq为0.8，然后分别离心(5000g，4°C，1min)，收集各自菌体，将获得菌体分别悬浮于PBS中至终浓度为14Cfu/ml，即为鳗弧菌悬液或哈氏弧菌悬液。
[0039]步骤2)杀菌效应
[0040]将上述实施例1获得的rCD94蛋白与上述步骤I)的鳗弧菌悬液、哈氏弧菌悬液或PBS(对照)等体积(1:1)混合。将混合液25 °C温育Ih，随后取10ul混合液涂布于LB平板，280C温育48h ο计算平板上出现的细菌数。结果表明，加入rCD94的鳗弧菌和哈氏弧菌的存活数分别为180和109，显著(P〈0.01)低于对照组鳗弧菌和哈氏弧菌的存活数(分别为720和881)。说明r⑶94蛋白可以杀死细囷。
[0041]这些结果表明，本发明的⑶94重组蛋白能够凝集鱼类病原细菌，并且具有杀菌作用。
【主权项】
1.一种半滑舌鳎CD94的应用，其特征在于:CD94在用于制备凝集细菌或杀菌的制剂中的应用。2.按权利要求1所述的半滑舌鳎CD94的应用，其特征在于:所述CD94在用于制备鱼类病原菌的凝集细菌或杀菌的制剂中的应用。3.按权利要求1所述的半滑舌鳎CD94的应用，其特征在于:所述CD94在用于制备鱼类病原菌鳗弧菌或哈氏弧菌的凝集细菌或杀菌的制剂中的应用。4.按权利要求1、2或3所述的半滑舌鳎⑶94的应用，其特征在于:所述⑶94为重组⑶94蛋白O5.按权利要求4所述的半滑舌鳎CD94的应用，其特征在于:所述CD94重组蛋白为经CD94在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。6.按权利要求5所述的半滑舌鳎CD94的应用，其特征在于:所述重组CD94蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，采用CD94F1/CD94R1为引物进行PCR扩增，PCR产物经过与载体pBS-T连接转换后与载体PET259连接，获得质粒pEtCD94，转化大肠杆菌BL21 (DE3)即可表达重组CD94。
【文档编号】A61K35/60GK105854001SQ201610305163
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】孙黎, 李学鹏
【申请人】中国科学院海洋研究所