专利名称：：一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法。更具体地说是制备一种可快速磁性分离，操作稳定性良好的磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶。
背景技术：
：酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质。由于它具有催化活性高、选择专一性强、反应条件温和等特点，酶已被广泛地应用于生物化工、医药化工、食品工业、轻工等许多领域。目前，已发现的酶达数千种。尽管水溶性酶有许多其他催化剂不能比拟的优点，但由于水溶性酶是根据生物自身的需要产生的，因而在实际应用中受到很大限制，其主要缺点是反应后，回收重复利用困难。而对酶进行固定化后制成的固定化酶能克服上述缺点。制备固定化酶的关键在于载体的选择，文献报道较多的可用于生物酶的固定化载体主要有表面富含功能基团的有机载体，机械稳定性较好的无机载体等。近年来，随着磁性分离技术的日益发展，磁性粒子用于生物酶的固定化逐渐受到人们广泛的关注。然而磁性粒子具有高表面能，以及粒子各向异性的偶极距作用使其很容易发生团聚，而且表现出较强的铁磁性，有些磁性粒子如Fe、Fe304很容易被氧化成Fe203,从而导致粒子发生聚集和沉淀，不能形成稳定的分散体系，使其在磁性分离的应用受到了限制。通过对磁性粒子的表面修饰可以降低其表面能，提髙粒子的抗氧化能力，得到分散性好的复合粒子；同时适当的表面修饰可以调节磁性粒子与酶材料的生物相容性和反应特性。二氧化硅可以屏蔽磁性粒子之间的偶极相互作用，阻止粒子团聚；具有良好的生物相容性及非常好的稳定性，因此二氧化硅包覆磁性粒子有无可比拟的优势。文献报道的二氧化硅包覆的磁性复合粒子，其核磁性粒子主要釆用共沉淀法[Massart，R.;Cabuil,V./Ok'w.P/z".1987，84，967.]或反相微乳法[Hyeon，T.;Lee,S.S.;Parl^J.;Chung，Y.;andNa^H.B./Jm.C;ze附.Soc.2001,123,12798.]制备。共沉淀法制备的磁性粒子粒径较小，但分散性较差，而且具有较强的憎水性，在用二氧化硅包覆之前，大多需要表面活性剂对其进行表面改性处理，以提高磁性粒子的亲水性，利于二氧化硅的包覆，而此过程较为繁瑣，而且所得二氧化硅包覆的磁性粒子，其核分布不均匀，饱和磁通量也较低，与实际磁性分离有一定距离。而反相微乳液制备的磁性粒子，，单分散性较好，但是磁性粒子粒径较小，制备成本较高，产率较低，与实际应用仍有一定距离。复旦大学的邓春晖等人以李亚栋等制备的超顺磁性Fe304微球[Deng，H.;Li,X.;Peng，Q.;Wang,X.;Chen，J.;Li，Y.C/e附./甜.￡d2005，44，2782.]为核，在其表面包覆二氧化硅，并将其应用于金属粒子的固定化[Xu，X.Q.;Deng,C.H.;Gao，M.X.;Yu，W.J.;Yang,P.Y.;Zhang.X.M.A/v.Mater2006,18,3289.]。赵东元等人[Deng,Y.H.;Qi,D.W.;Deng，C.H.;Zhang,X.M.;Zhao.D.Y.J」w.<Soc.2008,130，28.]在上述文献的基础上，首先用无定形二氧化硅包覆超顺磁性微球，然后在其外围继续包覆一层具有介孔结构的二氧化硅，应用于有毒藻类的去除。上述文献制备的磁性复合微球均具有较高的饱和磁通量和快速的磁响应性能。截止目前尚未见有报道将其用于生物酶的固定化研究中。本发明专利采用功能化的二氧化硅包覆磁性核徽球，并将其首次用于生物酶的固定化酶，所选用的磁佳/功能化二氧化硅复合微球除满足上述优点之外，并赋予固定化酶如下几个优点(1)载体的表面功能化确保固定化酶具有良好的搡作稳定性；(2)载体的粒径较大，而且性粒子的含量较高，可以满足实际磁性分离的需要，降低固定化酶的回收成本；(3)固定化酶制备成本低廉，便于工业化放大生产。
发明内容本发明的目的在于提供一种可快速磁性分离回收，操作稳定性良好的磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶。本发明的又一目的在于提供上述磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶的制备方法。为满足上述目的，本发明通过采用有机基团功能化的二氧化硅包覆磁性微球进行生物酶的固定化来实现。本发明提供了一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法，以青霉素酰化酶为例，其具体制备过程包括下列步骤a)超顺磁性微球的制备将铁盐或铁盐和其他金属盐的混合物，乙二醇和醋酸钠搅拌均句，然后转入晶化釜，与20(TC烘箱中静置472h，然后冷却至室温，乙醇洗涤数次，与60°C干燥可得磁性微球。所述的磁性微球包括Fe304，MnFe204，ZnFe204，和CoFe204等铁氧体，其微球粒径为100~800nm。b)磁性/功能化二氧化硅复合微球的制备将步骤a)中制备的0.2(^磁性微球用O.IOM的盐酸处理，然后超声均匀分散到醇水的混合体系中，加入正硅酸乙酯和有机硅烷化试剂，室温反应6h，磁性分离洗涤数次，于60'C干燥可得到磁性/功能化二氧化硅复合微球。所述硅烷化试剂选自？氨丙基三乙(甲)氧基硅烷、Y-缩水甘油氧丙基三甲(乙)氧基硅烷、，巯丙基三甲(乙傳基硅烷、苯基三甲(乙)氧基硅烷、乙烯基三甲(乙)氧基硅烷或4-三甲(乙)氧基硅烷丁腈中的一种。所述的醇水混合沐系特指乙醇、水和浓氨水(25%v/v)的混合体系，其体积比可调，能制备单分散性且单核包覆的最优体积比为160mL:37mL:5mL。所述的正硅酸乙酯和硅烷化试剂的总体积为0.05mL1.50mL,可制备具有单分散性、单核包覆和样品均匀的复合微球的最优总体积为0.10mL1.00mL。所述的硅烷化试剂与总硅源(正硅酸乙酯+硅烷化试剂)的体积比，即V娃统化试剂/(V桂坑化试剂+V正桂酸乙瞎)为0.05-0.90,可制备复合微球呈单分散且所得固定化酶活性较高的最优体积比为0.10~0.50。c)固定化青霉素酰化酶的制备将步骤b)中制备的复合微球可直接与青霉素酰化酶进行吸附固定化，或釆用戊二醛预活化与青霉素酰化酶以共价键结合，即通过共价方式进行固定化，可得到可磁性分离的搡作稳定性良好的固定化酶。例如在所述复合微球中加入pH-8.0的磷酸缓冲溶液稀释的青霉素酰化酶溶液，于30'C水浴振荡器中振荡固定24h，磁性分离并用磷酸缓冲溶液多次洗涤，可得到以吸附方式制备的青霉素酰化酶。在所述复合载体中加入戊二醛溶液活化2h，磁性分离并用去离子水多次洗涤后，在其中加入pH-8.0的磷酸缓冲溶液稀释的青霉素酰化酶溶液，于30。C水浴振荡器中振荡固定24h,磁性分离并用磷酸缓冲溶液多次洗涤，即可得用共价方式固定的青霉素酰化酶。所述的酶包括脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶、拉根过氧化酶、细胞色素C等水溶性酶。本发明提供了一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶的制备方法。与现有技术制备的固定化酶相比，本发明的优点之一在于，所制备的固定化酶具有很高的饱和磁通量，可快速用外加磁场进行分离和回收，显著提高了固定化酶的操作稳定性。本发明的优点之二在于，通过简单调变磁性/功能化二氧化硅复合微球制备过程中各因子的参数，可制备出性能不同的固定化酶。本发明的优点之三在于，制备方法简便，成本低廉，适用于工业化生产。本发明的优点之四在于，所选用的载体为磁性/功能化二氧化硅复合微球，该载体表面富含有机功能基团，有良好的生物相容性、机械稳定性、热稳定性、耐溶剂性和一定的耐酸碱性(强酸碱除外)，并在酶催化反应中表现出惰性。下面将以磁性Fe304/氨基化二氧化硅复合微球固定青霉素酰化酶为例，结合具体实施案例对本发明做进一步的阐述，但本发明的内容并不限于此。本发明中固定化青霉素酰化酶的初始表观活性测定采用碱滴定法测定[薛屏；卢冠忠；郭杨龙；王筠松.护房毐寧众学学叛，2004,25，361.];溶液酶的蛋白含量采用Bradford方法测定[Bradford.M.M.爿"a/.历oc/ie附.1976，72，248.],通过比较固定化之前加入载体中酶的蛋白含量和固定化之后上清液的酶蛋白含量，计算载体对酶蛋白的负载量和固定化后青霉素酰化酶的比活；通过磁性分离回收固定化酶，然后重新测定其活性，来考察多次循环操作之后固定化酶的活性保留。实施例l5.40gFea3'6H2O,200rnL乙二醇和14.40g醋酸钠搅拌均匀，然后转入晶化釜，与200'C烘箱中静置8h,然后冷却至室温，乙醇洗涤6次，在6(TC干燥可得磁性微球。然后取(X20g用lOOmLO.lM的盐酸超声处理，之后水洗3次，然后超声分散到160mL乙醇，37mL水和5mL氨水(25%)的混合体系中，加入0.36mL正硅酸乙酯和0.04mLY-氨丙基三乙氧基硅烷(V珪燒化试刺/(V絲化试刺+V正娃酸乙*)=10%),反应6h,磁性分离洗涤数次可得到磁性/氨基化二氧化硅复合微球。0.10g磁性/氨基化二氧化硅复合微球中加入1.60mL戊二醛溶液进行活化2h，磁性分离回收并用去离子水多次洗涤，然后在活性载体中加入1.20mL—定浓度的青霉素酰化酶稀释液，于3(TC水洛振荡器中振荡固定24h，磁性分离并用磷酸缓冲溶液多次洗涤，即可得用共价方式固定的青霉素酰化酶。实施例25.40gFeCly6H2O，200mL乙二醇和14.40g醋酸钠搅拌均句，然后转入晶化釜，与200'C烘箱中静置8h，然后冷却至室温，乙醇洗涤6次，在6(TC干燥可得磁性徽球。然后取0,20g用100mL0.1M的盐酸超声处理，之后水洗3次，然后超声分散到160mL乙醇，37mL水和5mL氨水(25%)的混合体系中，加入0.36mL正硅酸乙酯和0.04mL，氨丙基三乙氧基硅烷(V磁统化试拥/(V磁煤化试拥+V正鍵酸乙《)=10%)，反应6h,磁性分离洗涤数次可得到磁性/氨基化二氧化硅复合微球。0.10g磁性/氨基化二氧化硅复合微球中加入1.20mL—定浓度的青霉素酰化酶稀释液，于30X:水浴振荡器中振荡固定24h，磁性分离并用磷酸缓冲溶液多次洗涤，即可得用吸附方式固定的青霉素酰化酶。实施例3同实施例1,保持其他条件不变，将复合微球制备过程中正硅酸乙酯和？氨丙基三乙氧基硅烷的加入体积分别改为0.20mL和0.20mL,即V桂统化试剂/(V烷化试+v正硅酸乙瞎)=50%。实施例4同实施例l,保持其他制备条件不变，在Fe304制备过程中，将晶化釜于200'C的静置时间改为4h。实施例5同实施例l，保持其他制备条件不变，在Fe304制备过程中，将晶化釜于200'C的静置时间改为72h。实施例6同实施例1，保持其他条件不变，将复合微球制备过程中正硅酸乙酯和y-氨丙基三乙氧基硅烷的加入体积分别改为0.09mL和O.OlmL。实施例7同实施例1，保持其他条件不变，将复合微球制备过程中正硅酸乙酯和Y-氨丙基三乙氧基硅烷的加入体积分别改为0.90mL和O.lOmL。实施例8同实施例1,保持其他条件不变，将复合微球制备过程中0.04mL"氨丙基三乙氧基硅烷改为0.04mLy-縮水甘油氧丙基三乙氧基硅烷。以上实施例制备的磁性微球、磁性/功能化二氧化硅复合微球和磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶的性能列于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。图1为磁性/氨基化二氧化硅复合微球的制备及其相应固定化青霉素酰化酶的制备流程图。图2为实施例1制备的Fe304微球(a)和实施例1制备的磁性/氨基化二氧化硅复合微球(b)的XRD表征图。图3为实施例1制备的是Fe304微球(a)和实施例1制备的磁性/氨基化二氧化硅复合微球(b)的TEM表征图。图4为实施例1制备的磁性/氨基化二氧化硅复合微球固定化酶的磁响应图权利要求1.一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法，其特征在于，可通过简单快速的磁性分离进行回收和重复利用。所采用的磁性/功能化二氧化硅复合微球载体，是一种功能化二氧化硅包磁性微球的核壳结构，表面富含均匀的有机官能团，具有超顺磁性且快速的磁响应性能。2.权利要求1所述的磁性/功能化二氧化硅复合微球，其中磁性微球包括Fe304，MnFe204,ZnFe204,和CoFe204等铁氧体，其粒径为100~800nm。3.权利要求l所述的磁性/功能化二氧化硅复合微球，其中功能化基团包括氨基、环氧基、巯基、苯基、乙烯基和丁腈基。4.权利要求l所述的固定化酶，其制备方法为吸附固定法和共价固定法。5.权利要求1所述的磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶的制备方法包括如下步骤a)超顺磁性微球的制备。将铁盐或铁盐和其他金属盐的混合物，乙二醇和醋酸钠搅拌均勾，然后转入晶化釜，与200'C烘箱中静置472h,然后冷却至室温，乙醇洗涤数次，于60'C干燥可得磁性微球。b)磁性/功能化二氧化硅复合微球的制备将0.2g磁性微球用0.1M盐酸溶液处理，然后超声均勾分散到醇水混合体系中，加入正硅酸乙酯和有机硅烷化试剂，室温机械搅拌6h,磁性分离洗涤数次，于60'C干燥可得到磁性/功能化二氧化硅复合徽球。c)固定化酶的制备在所述复合微球中加入一定缓冲溶液稀释的酶液，于3(TC水洛振荡器中振荡固定24h，磁性分离并用缓冲液多次洗涤，可得到以吸附方式制备的青固定化酶。在所述复合微球中加入戊二醛溶液活化2h,磁性分离并用去离子水多次洗涤后，在其中加入缓冲液稀释的酶液，于3(TC水洛振荡器中振荡固定24h，磁性分离并用缓冲溶液多次洗涤，即可得用共价方式制备的固定化酶。6.权利要求5所述的制备方法，其中，步骤b)中的正硅酸乙酯和硅烷化试剂的总体积为0.05mL^1.50mL,其中可制备具有单分散性、单核包覆和样品均匀的复合微球的最优总体积为0.10mL1.00mL。7.权利要求5所述的制备方法，其中，步骤b)中的醇水体系特指乙醇、水和浓氨水(25%v/v)的混合体系，其体积比可调，能制备单分散性且单核包覆的最优体积比为160mL:37mL:5mL。8.权利要求5所述的制备方法，其中，步骤b)中的硅烷化试剂与总硅源(正硅酸乙酯+珪烷化试剂)的体积比，即V桂坑化试剂/(V桂统化试剂+V正桂酸乙瞎)为0.05~0.90，其中可制备复合微球呈单分散且所得固定化酶活性较高的最优体积比为0.10~0.50。9.权利要求1和5中的酶包括青霉素酰化酶、脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶、拉根过氧化酶、细胞色素C等水溶性酶。全文摘要该固定化酶所采用的磁性/功能化二氧化硅复合微球载体，其中核为磁性微球，壳为功能化的二氧化硅，功能化基团的种类和含量，复合微球中核的粒径和功能化二氧化硅的厚度均可调变。其制备方法是先合成超顺磁性微球，然后经盐酸处理后，超声均匀分散到乙醇/水的碱性体系中，用正硅酸乙酯和硅烷化试剂一步缩合包覆得到磁性/功能化二氧化硅复合微球，然后对生物酶进行吸附固定化和共价固定化。本固定化酶具有快速的磁响应性能和良好的操作稳定性。该方法制备简单，成本低廉，易于工业化生产。文档编号C12N11/14GK101613694SQ20091005223公开日2009年12月30日申请日期2009年5月31日优先权日2009年5月31日发明者任家文,刘晓晖,卢冠忠,张志刚,王筠松,王艳芹,石变芳,耘郭,郭杨龙申请人:华东理工大学