专利名称：一种壳聚糖-二氧化硅复合空心微球的制法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机无机复合纳米材料的制备以及药物释放应用领域，具体涉及一种 具有大孔、介孔壳聚糖-二氧化硅复合纳米空心微球的制备方法和作为药物释放的载 体、分子筛方面的应用。 技术背景
从20世纪60年代以来，药物的控制释放和在人体内的耙向性给药研究一直是化 学、医学和药物学领域的一项研究热点。与传统的给药模式相比，药物的控制释放具 有很多优点，比如(1)药物释放到环境中的浓度比较稳定；(2)能十分有效的利用 药物，使其有很高的利用率；(3)能够使得药物的释放尽可能的接近病灶部位，提高 了药效，避免发生全身性的副作用；(4)可以适当减少用药次数，对患者更安全。因 此，鉴于上述种种优点，药物控制释放的研究对临床医学具有很广泛的应用价值。
药物控制释放技术的关键在于制备性能良好的药物载体。在众多的高分子材料 中，天然多糖材料以其较好的生物相容性和细胞亲和性得到了研究人员的广泛关注。 目前，作为药物载体的天然生物可降解高分子主要有壳聚糖、海藻酸、琼脂、纤维 蛋白和胶原蛋白等。其中，壳聚糖以其无毒性、生物相容性和可降解性，己经在药学 和生物学领域得到了广泛的应用。(Biometerial, 1993, (20)， 7-16; J Control Rel, 1998， (52), 109-18)。在本发明中，正是利用具有良好生物性能的壳聚糖空心微球作为模板， 制备复合的壳聚糖-二氧化硅的空心微球。
国内外很多课题组致力于壳聚糖微球的制备和研究，迄今为止，制备壳聚糖微球 的方法主要有交联法、凝聚法、乳化-溶剂蒸发法、喷雾干燥法等。以上几种方法制 备过程相对复杂，而且有时不免要用到对人体有害的有机溶剂。在本发明中，我们所 用的模板壳聚糖-聚丙烯酸的空心微球，制备过程简单，且完全在水相中进行，因此 十分环保(Advanced Materials, 2004， (16)， 933-936.)。在进一步制备壳聚糖-二氧化硅 复合微球的过程中，聚丙烯酸分子在处理过程中被自然的去除。
有序介孔二氧化硅微球具有较大的比表面积，孔径和体积大小可调，生物惰性及 生物相容性，因此它是作为药物载体的较好的无机材料。但是，未改性的二氧化硅微 球不能对包裹的药物进行可控的释放，因此如果能将壳聚糖和二氧化硅两者的优点结 合起来，那将是一项十分有意义的工作，因为介孔二氧化硅大的比表面积可以使其具 有较大的载药量，而壳聚糖链段上具有多种官能团(氨基、羟基)，通过调控官能团 和药物之间的化学作用力，可以达到对药物控制释放的目的。本发明正是体现了这一 特色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可生物降解的、具有生物相容性的壳聚糖-二氧化硅 复合纳米微球。本发明的另一目的在于提供一种具有大孔、介孔的壳聚糖-二氧化硅复合纳米空 心微球的制备方法。本发明采用模板法，以壳聚糖-聚丙烯酸中空微球为模板，以正 硅酸乙酯为二氧化硅前驱物，在醋酸或氨水催化剂作用下，正硅酸乙酯经水解、縮聚 沉积在壳聚糖-聚丙烯酸微球的表面，最终得到具有大孔、介孔两种孔结构的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。
本发明的技术方案如下壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球，采用正硅酸乙酯经 水解、縮聚沉积在壳聚糖-聚丙烯酸微球的表面的方法，最终得到具有大孔、介孔两
种孔结构的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球，平均粒径为50-200nm,其中壳聚糖的分 子量为10000-200000,脱乙酰度为70~95%。
制备壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球的方法，将壳聚糖-聚丙烯酸空心微球溶解 在碱性蒸馏水中，将其在搅拌条件下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，水解完全后即 得壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球。室温搅拌12-24小时后，再在5(TC条件下静置 12-24小时，过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球。
尤其是壳聚糖-聚丙烯酸乳液与等体积的l-2M的氨水混合，静置48小时，并将 正硅酸乙酯溶于乙醇中，将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴加到正硅酸乙酯的乙 醇溶液中，室温搅拌12-24小时，之后放在5(TC条件下静置12-24小时，经过滤、离 心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。
另一方法是将壳聚糖-聚丙烯酸空心微球溶解在酸性蒸馏水中，将其在搅拌条件 下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，水解完全后即得壳聚糖-二氧化硅的复合空心微 球。在室温搅拌条件下，将酸性的壳聚糖-聚丙烯酸空心微球乳液加入到正硅酸乙酯 的乙醇溶液中，室温搅拌24小时后，再在5(TC条件下静置24小时，过滤、离心即 得壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球。所述的纳米微球的用途，作为药物、蛋白的载 体，还可以作为分子筛来分离蛋白质。负载具有广谱性的抗肿瘤药物盐酸阿霉素。壳 聚糖-二氧化硅微球具有较大的空腔，因此可以大大提高其载药量，而且通过改变外 界环境的某些条件，达到对药物控释的目的。酸性和碱性蒸馏水对应pH值可在 pH4-pH10的范围内。
本发明还涉及采用上述方法制备的壳聚糖-二氧化硅复合纳米微球作为分子筛， 分离具有不同分子量和等电点的蛋白质。而且通过改变外界环境的某些条件，达到对
蛋白质的分离。
作为药物的载体，它可以在本发明的壳聚糖-二氧化硅复合微球的溶液中加入要 负载的药物，经常温搅拌24-48小时后离心，即可得到包裹有药物的壳聚糖-二氧化硅 复合空心微球
作为分子筛，它可以在本发明的壳聚糖-二氧化硅复合微球的溶液中加入细胞色 素C和牛血清蛋白，经常温搅拌48小时以上，通过离心分离出上层清液。将下层包 裹蛋白的复合微球溶于一定pH值的溶液中，常温搅拌48小时以上，离心，即可将两 种蛋白质分离。本发明提供了一种平均粒径为50-200nm的壳聚糖-二氧化硅复合纳米空心微球， 它是亲水性的，在广泛的pH范围内具有较好的稳定性，生物相容性。实验过程完全 在水相体系中进行，没有使用任何有机溶剂和表面活性剂。微球表面规则，外壳二氧 化硅壁上有很多孔道，为药物的吸附和释放提供了通道，而且二氧化硅壳层的机械强 度高，不易变形。因此，该微球作为一种载体，在性能上符合生物医学和生物化学工 程领域的应用需要。
图1为壳聚糖-二氧化硅复合空心微球的模型图1为壳聚糖，2为二氧化硅。
图2为壳聚糖-二氧化硅复合空心微球的透射电镜图(放大5万倍) 图3为负载盐酸阿霉素的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球在缓冲溶液pH4和pH7.4 交替变换条件下测试的释放曲线
图4为负载盐酸阿霉素的二氧化硅空心微球在pH4和pH7.4条件下的释放曲线。
具体实施例方式
实施例1:
首先制备壳聚糖-聚丙烯酸的空心微球。将0.25g的壳聚糖和0.12g的丙烯酸溶于 25mL的蒸馏水中，待其完全溶解后，升温至8(TC，加入0.05g的过硫酸钾引发丙烯 酸聚合。当体系出现乳白色时，将体系冷却至室温，之后加入O.lmL的戊二醛来选择 性的交联壳聚糖，即得到壳聚糖-聚丙烯酸空心微球的乳液，可参考本申请人的在先 中请。
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL与等体积的2M的氨水混合，静置48小 时。将520微升的正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢 滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在50'C条件下静置24 小时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。
上述体系中的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球，用透射电镜观察纳米粒子为较规 则的球形结构，而且外层的二氧化硅和壳聚糖-聚丙烯酸模板界限很明显，平均粒径 为120nm，在广泛的pH值范围内可以稳定存在。
实施例2:
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL，用2M的醋酸将乳液调至pH3，静置 48小时。将520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将酸性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓 慢滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在50'C条件下静置24 小时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。
上述体系中的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球，用透射电镜观察纳米粒子为较规 则的球形结构，平均粒径为110nm，在广泛的pH值范围内可以稳定存在。
实施例3:
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL与等体积的2M的氨水混合，静置48小 时。将520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在50。C条件下静置24小 时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。将此产品多次洗涤后分散在 蒸馏水中，冷冻结冰，之后在冻干机中将其冻干。取冻干的壳聚糖-二氧化硅复合空 心微球粉末15mg与一定质量的盐酸阿霉素混合于蒸馏水中，室温搅拌48小时，离 心、洗涤三次，除去上层液体即得负载盐酸阿霉素的壳聚糖-二氧化硅复合微球。
上述复合微球中，当加入盐酸阿霉素的质量为1.5mg时，粒子的载药量为8.9%， 载药效率为97.5%。药物释放实验表明当释放媒介溶液为pH4和7.4的缓冲溶液交 替变换时，所释放的盐酸阿霉素的质量呈现脉冲式；也就是说，在外界溶液的pH值 为4时，大量的药物被释放出来，在外界溶液的pH值为7.4时，只有少量的药物被 释放出来。
实施例4.
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL与等体积的2M的氨水混合，静置48小 时。将520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在50'C条件下静置24小 时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。将此产品多次洗涤后分散在 蒸馏水中，冷冻结冰，之后在冻干机中将其冻干。将冻干的粉末在马弗炉中55(TC的 条件下煅烧4小时得到二氧化硅纳米空心微球。取煅烧后的二氧化硅空心微球粉末 15mg与一定质量的盐酸阿霉素混合于蒸馏水中，室温搅拌48小时，离心、洗涤三 次，除去上层液体即得负载盐酸阿霉素的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。
上述复合微球中，当加入盐酸阿霉素的质量为1.5mg时，粒子的载药量为4.2%， 载药效率为43.5%。药物释放实验表明当外界溶液的pH值为4时，大量的药物被 释放出来，在外界溶液的pH值为7.4时，只有少量的药物被释放出来。
实施例5
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL与等体积的2M的氨水混合，静置48小 时。将520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在5CTC条件下静置24小 时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。将此产品多次洗涤后分散在 蒸馏水中，冷冻结冰，之后在冻干机中将其冻干。取冻干的样品15mg，细胞色素C 5mg， 溶于2mLpH7.4的PBS缓冲溶液中常温搅拌96小时。之后，将此溶液离心，分离出 上层溶液进行测试，即得得到被包裹的细胞色素C的质量。
实施例6
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL与等体积的2M的氨水混合，静置48小 时。将520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在5(TC条件下静置24小 时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。将此产品多次洗涤后分散在 蒸馏水中，冷冻结冰，之后在冻干机中将其冻干。取冻干的样品15mg，牛血清蛋白5mg，溶于2mLpH7.4的PBS缓冲溶液中常温搅拌96小时。之后，将此溶液离心， 分离出上层溶液进行测试，即得得到被包裹的牛血清蛋白的质量。 实施例7
取新制备的壳聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL与等体积的2M的氨水混合，静置48小 时。将520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室温搅拌24小时，之后放在5(TC条件下静置24小 时，经过滤、离心即得壳聚糖-二氧化硅复合空心微球。将此产品多次洗涤后分散在 蒸馏水中，冷冻结冰，之后在冻干机中将其冻干。取冻干的样品15mg,牛血清蛋白 5mg，细胞色素C5mg，溶于2mL pH7.4的PBS缓冲溶液中常温搅拌96小时。之后， 将此溶液离心，分离出上层溶液。将下层沉淀溶于pH10的缓冲溶液中，常温搅拌48 小时。将此溶液离心，即可将两种蛋白质进行分离。
权利要求
1.一种壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球，其特征是正硅酸乙酯经水解、缩聚沉积在壳聚糖-聚丙烯酸微球的表面，最终得到具有大孔、介孔两种孔结构的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球，平均粒径为50-200nm，其中壳聚糖的分子量为10000-200000，脱乙酰度为70～95％。
2. —种制备壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球的方法，其特征是将壳聚糖-聚丙烯酸空 心微球溶解在碱性蒸馏水或氨水中，静置48小时，并将正硅酸乙酯溶于乙醇中， 将碱性的壳聚糖-聚丙烯酸乳液缓慢滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室温搅拌 12-24小时，之后放在50'C条件下静置12-24小时，经过滤、离心即得壳聚糖-二 氧化硅复合空心微球。将其在搅拌条件下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中(正硅 酸乙酯/乙醇的体积比约为1: 4)，水解完全后即得壳聚糖-二氧化硅的复合空心微 球。
3. —种制备权利要求1所述的纳米微球的方法，其特征是将壳聚糖-聚丙烯酸空心微 球溶解在酸性蒸馏水中，将其在搅拌条件下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，水 解完全后即得壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球。
4. 一种制备权利要求2所述的纳米微球的方法，其特征是在室温搅拌条件下，将碱 性的壳聚糖-聚丙烯酸空心微球乳液加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室温搅拌24 土8小时后，再在50土1(TC条件下静置24±16小时，过滤、离心即得壳聚糖-二 氧化硅的复合空心微球。
5. —种制备权利要求3所述的纳米微球的方法，其特征是在室温搅拌条件下，将酸 性的壳聚糖-聚丙烯酸空心微球乳液加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室温搅拌24 土8小时后，再在50土1(TC条件下静置24土16小时，过滤、离心即得壳聚糖-二氧 化硅的复合空心微球。
6. 根据权利要求1所述的纳米微球的用途，其特征是作为药物、蛋白的载体，作为 分子筛来分离蛋白质。首先在壳聚糖-二氧化硅复合微球的溶液中加入细胞色素C 和牛血清蛋白，然后经常温搅拌48小时以上，再通过离心分离出上层清液，然后 将下层包裹蛋白的复合微球分散于一定pH值的溶液中，常温搅拌48小时以上，再 经离心，即可将两种蛋白质分离。
全文摘要
一种壳聚糖-二氧化硅的复合空心微球，正硅酸乙酯经水解、缩聚沉积在壳聚糖-聚丙烯酸微球的表面，最终得到具有大孔、介孔两种孔结构的壳聚糖-二氧化硅复合空心微球，平均粒径为50-200nm，其中壳聚糖的分子量为10000-200000，脱乙酰度为70～95％。
文档编号C07K14/435GK101601986SQ20091003214
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月9日 优先权日2009年7月9日
发明者寅 丁, 雪 王, 勇 胡, 蒋锡群, 闫尔云 申请人:南京大学