专利名称：用作体外和体内dna转染与基因治疗载体的完整微细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用完整细菌微细胞将寡核苷酸和多聚核苷酸转运至宿主细胞，尤其但不专属于基因治疗的背景中。本发明还涉及一种药学上兼容的方法，用于提纯完整的细菌微细胞。
背景技术：
Salser等人的一项U. S. patent No. 4，497，796阐述了在1980年左右可用于转化哺乳动物细胞的各种早期方法。特别的，Salser等人公布使用DNA共沉淀技术和磷酸钙将编码二氢叶酸还原酶的基因(其能够产生甲氨蝶呤耐药性)转染至小鼠的L1210细胞或骨髓细胞中。Salser等人还提到了“许多其他方法……，用于将遗传物质插入细胞”，除了 “病毒载体，，外，还包括某些细胞融合技术“细胞-细胞融合涉及将包裹在核膜中的有限数量的染色体融入细胞中；……微细胞融合；……与含有质粒DNA的细菌原生质体融合；以及与用DNA包裹的红细胞影融合”(第18-30行，第5栏；引用被省略)。这些技术的共同点是使用一种通过单层膜界定的含有DNA的细胞结构，在存在细胞融合促进剂，例如聚乙烯乙二醇(PEG)的条件下，将其与目标哺乳动物细胞接触。哺乳动物细胞与细胞结构融合，形成一种杂交细胞，后者所含有的DNA被释放入前者的细胞质中并传输至杂交细胞的细胞核中，随后该杂交细胞可能表达DNA。Salser公布的内容提到了“红细胞影”，即缺乏细胞质成分但保持原始形态学的红细胞残余物，以及“细菌原生质”，或者被剥离了外膜(细胞壁)的细菌细胞，其典型的通过水解酶或抑制肽聚糖合成的抗生素产生。Salser等人还间接提到了使用简化细胞结构的第三种类型，即微细胞原生质。微细胞是大肠杆菌或其他细菌细胞的一种无核形式，其通过在分离DNA的细胞分裂二分体中干扰协调机能产生。原核染色体的复制物被联接至正常的二分体，其涉及细胞中隔的形成。例如，在大肠杆菌中，min基因的突变，比如minCD，可以在细胞分裂过程中解除对细胞极处隔膜形成的抑制作用，导致产生一个正常的子细胞和一个无核微细胞(de Boer 等人，1992 年；Raskin&de Boer, 1999 年；Hu&Lutkenhaus，1999 年；Harry, 2001 年)。除了 min操纵子突变外，还可以通过一类影响隔膜形成的其他基因重排或突变， 例如在枯草杆菌的divIVBl中产生无核细胞(Reeve和Cornett，1975年；Levin等人，1992 年)。还可以在细胞分裂/染色体分离过程中通过在蛋白质的基因表达水平进行干扰形成微细胞。例如，minE的过度表达会导致极性分裂并产生微细胞。类似的，染色体分离的缺陷也可能产生少染色体微细胞，例如枯草杆菌中的smc突变(Britton等人，1998年)，枯草杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等人，1994年)，大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等人，1989年)，以及大肠杆菌中的ParC突变(Mewart和D’Ari，1992年)。可以提供反式基因产物。 例如，当cafA通过一种高拷贝数质粒过度表达时，可以提高细胞分裂的比例和/或在复制后抑制染色体的分离(Okada等人，1994年)，导致连锁细胞和无核微细胞的形成(Wachi等人，1989 年；Okada 等人，1993 年)。微细胞与在某些情况下同时产生并释放的其他小泡截然不同，后者与微细胞相反，它们不是特殊基因重排或游离基因表达所产生的。这种其他小泡的例子有细菌气泡，它是小膜泡(Dorward等人，1989年)。在例如农杆菌、芽孢杆菌、博尔德氏杆菌、埃希氏菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门氏菌和志贺氏菌等数种细菌中已经观察到了气泡。细菌气泡可以通过比如操纵生长环境(Katsui等人，1982年)以及使用外源性膜失稳剂(Matsuzaki等人， 1997年)产生。存在其他亚细菌成分，比如细菌影(Lubitz等人，1999年)，它是当phiX174溶解基因E表达时，在多种革兰氏阴性菌中形成的细菌空壳。细菌影的形成来自一种穿透细菌细胞包膜的跨膜管道结构。由于细胞内的高渗透压，细胞质成分被排出至周围介质中，导致形成细菌细胞空壳。因为原核细胞内的质粒复制依赖于染色体复制，所以在上述异常细胞分裂过程中，质粒可以分离入正常的子细胞和微细胞中。因此，来自重组min大肠杆菌的微细胞携带大量的质粒拷贝，具有除染色体外的全部细菌细胞成分，并且已经被用作比如体外表达质粒编码基因的研究中。参见Brahmbhatt (1987年)，Harlow等人(1995年)和Kihara等人 (1996年)。Brhambhatt (1987年)证明，例如，大肠杆菌微细胞可以携带含有201Λ DNA插入物的重组质粒，不含有任何染色体DNA，并且能够同时表达9种或更多种重组蛋白质。这种无复制性但具有代谢活性的完整微细胞已经被用于分析质粒运载基因所编码的蛋白质。但是，在&ilser等人所提到的“微细胞融合”背景中，微细胞被剥离外膜以产生一种类似于细菌原生质的结构，当与PEG或其他细胞融合促进剂一起培养时，其能够与靶细胞融合。同样与细菌原生质相仿，这种微细胞原生质必须保存在等张条件下以防止渗透性溶解，并且它们极易受到酶的攻击。因此，它们不适合用于基因治疗。另外，随着其他更方便的转化方法的出现，Salser等人所说的微细胞技术便陷于无用的境地。新近，基因治疗的进展已经突出了多种用于介导外源性遗传物质进入受体哺乳动物基因组的方法。参见Romano等人(1998，1999年)，Balicki和Beutler (2002年)以及 Wadhwa等人(2002年)的回顾。由于严重的安全性考虑，这些技术的临床应用，比如腺病毒和重组逆转录病毒载体的使用，已经被搁置。目前转化方法学所提出的直观问题是用野生型病毒进行重组、插入和致癌潜力、病毒诱导的免疫抑制、病毒载体携带治疗性DNA大片段的能力有限、减毒病毒的毒性回复、重组病毒的制造和分布困难、稳定性差以及不良反应， 例如现有免疫性造成的炎症反应。能够解决这些问题的方法将提供显著的收益，使得基因治疗更加安全并且更加有效。已经研究了活的减毒细菌载体作为人类基因治疗的基因传输载体，包括沙门氏菌 (Darji 等人，1997 年；Paglia 等人，2000 年；Urashima 等人，2000 年)，志贺氏菌(Sizemore 等人，1995 年；GriIlot-Courvalin 等人，2002 年)，李斯特氏菌(Dietrich 等人，1998 年) 和侵袭性大肠杆菌(Grillot-Courvalin等人，1998年)。但是，细菌载体具有显著的局限性，因为活的细菌尽管被减毒，还必须经过操作以携带吞噬溶酶体结构以使足够数量的重组DNA逸出至哺乳动物细胞液与细胞核中。这种操作对于大量的细胞内细菌病原体而言困难较大并且或许是不可能的。此外，只有少数细菌种类的减毒细菌突变体是已知的，例如沙门氏菌、大肠杆菌以及志贺氏菌的芳香氨基酸生物合成基因突变体。由于许多细菌种类的减毒突变体仍然未知，细菌基因传输系统就无法使用大组的细菌性细胞内病原体。由于部分染色体DNA可以被转染至接受基因治疗的人或动物宿主体内的其他微生物群落中，故细菌载体提出了有关染色体DNA存在的其他问题。由于可能出现新型的有毒和/或耐药菌，这种细菌物种之间的混杂DNA转染是不符合要求的。
发明内容
为了说明这些和其他需要，本发明根据一方面提供了一种组合物，其含有(i)重组的完整微细胞以及(ii) 一种药学上可接受的载体，其中微细胞含有一种治疗性核酸分子，其编码例如白介素-2。在一个优选实施例中，该组合物含有的污染细胞少于1个污染亲代细胞/IO7, IO8或IO9个微细胞。根据另一方面，本发明为重组完整微细胞在药物制剂中的使用提供了含有治疗性核酸分子的微细胞，用于治疗疾病或通过将该药物给予细胞、组织或器官以改变特性的方法。在此范围内治疗的疾病可以是比如肿瘤，或者一种获得性疾病，比如艾滋病、肺炎、肺气肿，或者由先天性代谢失调产生的疾病，比如囊性纤维化。换句话说，该治疗可以影响特性， 比如繁殖能力或者与一种变态反应原或传染剂相关的免疫反应。根据另一方面，本发明还提供了一种遗传转化方法，其包括(i)提供含有由一种核酸序列，优选编码治疗性表达产物的核酸序列所组成质粒的重组完整微细胞，以及随后 (ii)将微细胞与具有噬菌作用或内吞作用的哺乳动物细胞相接触，使得微细胞被哺乳动物细胞吞噬，后者借此产生核酸序列的表达产物。微细胞与哺乳动物细胞的接触可以在体外或体内进行。前面提到的质粒也可以含有功能为调节成分的第二核酸片段，例如促进子、终止物、增强子或一种信号序列，其经过操作连接至第一核酸片段。另外，质粒可以含有一种指示成分，例如一种编码绿色荧光蛋白的核酸片段。根据本发明的另一方面提供了一种提纯方法，其包括将含有微细胞的样品通过 (i) 一系列横向流动滤器以及随后(ii)通过终端滤器，借此将微细胞与该样品中的污染物分离以获得纯化的微细胞制剂。此方法选择性的包括用抗生素处理提纯的微细胞制剂。还可以选择一个预备步骤，对含有微细胞的样品进行差速离心。在一个优选实施例中，该系列横向流动滤器包括(A)至少一个或两个孔径大于或等于0.45微米的滤器以及(B)至少一个或两个孔径小于或等于0. 2微米的滤器。
图1显示了一幅正常细菌细胞分裂以及min基因突变如何导致微细胞形成的示意图。图2显示了一幅用于产生产微细胞细菌株的质粒制剂示意图。特别的，该图显示了可用于生成一种产伤寒杆菌来源微细胞细菌株的质粒结构。显示了克隆的插入DNA以及环形质粒载体部件的素描。质粒的名称以粗体显示在插入DNA的左侧以及环形载体图的内部。在使用PCR引物产生克隆的地方，引物编号显示在邻近虚线箭头处。
图3显示了一幅可用于产生一种产微细胞细菌株的质粒制剂示意图。特别的，该图显示了一种质粒结构，以产生一种产志贺氏痢疾杆菌加来源微细胞的细菌株。图4显示了一幅可用于产生一种产微细胞细菌株的质粒制剂示意图。特别的，该图显示了一种质粒结构，以生成一种产李斯特单胞菌来源微细胞的细菌株。图5A-图5F显示了经伤寒杆菌来源的微细胞转染的小鼠巨噬细胞的透射电子显微镜像。对于每一幅照片提供了转染后的时间和放大倍数。照片显示了巨噬细胞空泡内的微细胞样电子致密颗粒(箭头)。图6A-图6C显示了微细胞介导的基因传输至乳腺癌细胞和异种基因表达。照片图 6A显示用非重组微细胞转染96小时后的对照乳腺癌细胞系SK-BR-3，标记物为抗HER-2抗体，检测物为与Alexafluor结合的第二抗体。照片图6B显示了用携带pEGFP-Cl质粒的重组微细胞转染96小时后，SK-BR-3细胞中GFP的表达(GFP的真核表达)。照片图6C显示了用微细胞/pEGFP-Cl转染的SK-BR-3细胞，标记物为抗HER-2抗体，检测物为与Alexaf Iuor 结合的第二抗体。图像可以用共焦显微镜观察。图7显示了腹膜内给予携带pEGFP-Cl质粒的重组微细胞和灭活伤寒沙门氏菌14 天后的小鼠血清抗GFP反应。在图例以及图8-10的图例中，10*8和10*9分别代表IO8和 IO90图8显示了腹膜内给予携带pEGFP-Cl质粒的重组微细胞和灭活伤寒沙门氏菌14 天后的小鼠血清抗LPS反应。图9显示了腹膜内给予携带pEGFP-Cl质粒的重组微细胞14天后，小鼠的血清抗 GFP反应。图10显示了腹膜内给予携带pEGFP-Cl质粒的重组微细胞14天后，小鼠的血清抗 LPS反应。
具体实施例方式本发明者已经测定具有完整细胞壁的微细胞(“完整微细胞”)是用于在体外或体内将寡核苷酸与多聚核苷酸(总的说来，“核酸分子”)传输至宿主细胞(优选人或动物体内的哺乳动物细胞)的有效载体。因此，发明者发现完整的微细胞可以被哺乳动物细胞所吞噬，就像吞噬取得微细胞的细菌细胞(“亲代细菌细胞”)那样。另外还发现，令人惊讶的，完整重组微细胞的成分被宿主细胞吞噬后，经过这种方式的处理，至少有一些来自微细胞的质粒DNA能够逃脱降解并被运输穿过胞浆，直至宿主细胞核，随后宿主细胞可以表达该质粒DNA。因此，依据本发明，将一种携带需要进行异源性表达之DNA的完整微细胞在体内或体外与一种能够以细胞内细菌致病原的方式吞噬亲代细菌细胞的哺乳动物细胞相接触。 出于同样的原因，那种哺乳动物细胞，这里表示为“有吞噬能力的”，能够吞噬微细胞并表达所讨论的DNA。在完整微细胞被给定类型宿主细胞吞噬的过程中涉及到多种机制，而本发明在这方面不依赖于任何一种特殊机制。例如，噬菌作用是一种经过良好证明的程序，其中巨噬细胞以及其他吞噬细胞，例如嗜中性粒细胞，通过伸展伪足覆盖颗粒表面直至完全包裹颗粒来摄入颗粒。尽管被描述为“非特异性”的噬菌作用，在此过程中仍然显示涉及到特异性受体。见 Wright&Jong(l986 年)；Speert 等人(1渊8 年)。因此，一种形式的噬菌作用涉及表面配体与伪足膜上配体受体之间的相互作用 (Shaw和Griffin，1981年)。这种由特殊受体介导的附着步骤被认为依赖于细菌表面的粘附因子。至于毒性更低的细菌，例如不产肠毒素的大肠杆菌，噬菌作用还可以在缺乏噬菌细胞受体的表面配体的条件下发生。例如，参见Pikaar等人(19%)。因此，本发明包括但不局限于具有或缺乏表面粘附因子的完整微细胞的使用，其保持了它们亲代细菌细胞的特性，并且为噬菌细胞(例如“具备噬菌能力”的宿主细胞)所吞噬，哺乳动物体内的主要噬菌细胞类型是嗜中性粒细胞和巨噬细胞。另一种吞噬过程是内吞作用，其中细胞内致病原的示例为进入哺乳动物上皮细胞并在那里复制的沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌、哈比特属菌、假单胞菌和乳酸杆菌等菌属。 在这一点上的两种基本机制是内涵素依赖受体介导的内吞作用，又称作“被膜小窝内吞作用”(Riezman，1993年)以及内涵素非依赖的内吞作用(Sandvig&Deurs，1994年)。根据本发明，当一种具吞噬能力的细胞通过内吞作用(例如，“具内吞能力的1主细胞)吞噬完整的重组微细胞并表达微细胞所携带的DNA时，可以涉及一种或两种机制。代表性的具内吞能力的细胞有乳腺上皮细胞、胃肠道内的肠细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞以及尿道和膀胱上皮细胞。本发明尤其可以用于将核酸分子导入具吞噬能力的细胞，通过转录和/或翻译， 用于改善或另外治疗疾病或改变与患者的特殊细胞、组织或器官类型相关的特性。为了进行此项描述，这些分子被划分为“治疗性核酸分子”。例如，给定治疗性核酸分子的转录或翻译可以用于治疗肿瘤或一种获得性疾病， 比如艾滋病、肺炎、肺气肿，或纠正先天性代谢失调，比如囊性纤维化。治疗性核酸的转录和翻译还可能实现绝育性灭菌，包括野生动物的绝育性灭菌。依据本发明，通过给予治疗性核酸分子，在患者体内表达，影响与相应的变态反应原和感染因子相关的免疫反应，还能够抵抗变态反应原介导的炎性疾病以及感染因子介导的炎性疾病。一种治疗性核酸分子还可以具有一种表达产物，或者有一种表达产物的翻译后变体的下游产物，能够减少与移植相关的免疫后遗症或帮助促进组织生长和再生。换句话说，表达产物或相关的翻译后介质可以是一种蛋白质，其代表为促红细胞生成素，一种生长因子比如TGF-β，一种细胞因子比如IL-2、IL-10、IL-12或其他白介素， 一种血清无色蛋白酶抑制剂，或者一种抗体比如CTLA4-Ig，其能够为宿主提供所需的受益。 其他类型的该种蛋白包括，没有限制的，α-、β-和γ-球蛋白，胰岛素，粒-巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，促红细胞生成素，肿瘤坏死因子，MGF，腺苷脱氨酶，肿瘤表面相关抗原比如病毒、突变或错误表达的抗原(⑶Κ4，0-连接素，&111-￥，01印8)，肿瘤特异性抗原比如MAGE、BAGE, GAGE、PRAME和NY-ES0-1，分化抗原比如酪氨酸酶、Melan-A/ MART-I、gplOO和TRP-l/gp75，以及过度表达的抗原比如Her2/neu和CEA。治疗性核酸分子的进一步分类示例为分别编码囊性纤维化跨膜调解器(CFTR)，VIII因子或其他血液蛋白，低密度脂蛋白受体，β-葡糖脑苷脂酶，α-和β-半乳糖苷酶，胰岛素，甲状旁腺素， α -1-抗胰蛋白酶，fasR以及fasL的DNA。依据本发明，由宿主细胞进行的治疗性核酸分子的表达能够提供一种所需的化合物，其能够调解靶向免疫反应或干扰病变。例如，一种治疗性核酸分子可以用于反义或核糖酶治疗。在此背景下，反义治疗涉及引介一种依据本发明的多聚核苷酸序列拷贝，使得拷贝的转录产物与多聚核苷酸序列相应的信使RNA (mRNA)转录产物进行原位杂交。这种杂交能够典型的防止转录产物被翻译成蛋白或者开始破坏mRNA的降解途径。治疗性核酸还可以在哺乳动物细胞中编码短干扰RNA 二联体(siRNA’ s)。更确切的说，siRNA’ s已经显示能够在哺乳动物细胞中抑制目标基因。干扰RNA(RNAi)的这种过程是一种发生于动物、人类以及植物中的，序列特异性的转录后基因静默法，并且由与被静默基因同源的双链(ds) RNA所发动。在多种细胞类型中已经成功的显示了 SiRNA的病毒介导传输能够特异的减少目标基因的表达(Haibin等人，2002年)。对于所有这些以及其他各种治疗性核酸分子的使用，本说明采用的标题为“基因治疗”，它的意思也包含短语“基因转染”、“基因传输”以及“基于基因的疫苗”，涉及用于将治疗性核酸分子在体内和体外转染入宿主细胞的方法学或系统，就像例如U. S. patent No. 5，399，346中所描述的。因此，本发明的含微细胞组合物可以用于达到原位治疗效果，以及用于在体外转化细胞然后将其介导入患者体内。依据本发明，适合于体内和体外方法的细胞可以是那些具有吞噬能力的细胞，例如噬菌细胞和上皮细胞。如上所述，基因治疗可以治疗或防止遗传性或获得性疾病或病症。治疗性核酸分子编码一种产物，比如功能性RNA(例如，反义或siRNA)或一种肽、多肽或蛋白，需要其在体内产生。例如，所关心的遗传物质可以编码一种具有治疗价值的激素、受体、酶或(多)肽。 这种方法可以导致非整合的被转染DNA的短暂表达、染色体外复制以及被转染复制子比如游离基因的表达，或者被转染遗传物质整合入宿主细胞的染色体组DNA。治疗性核酸分子可以是一种基因的正常对应物，其编码的蛋白质功能异常或在疾病状态下以异常水平存在，通常是这样，例如囊性纤维化中的囊性纤维化跨膜传导性调解器(Kerem等人，1989年；Riordan等人，1989年；Rommens等人，1989年)，镰刀状细胞贫血中的β-球蛋白，以及地中海贫血中的任一种α-球蛋白、β-球蛋白和Y-球蛋白。如上所述，治疗性核酸分子可以具有一种反义RNA转录产物或小的干扰RNA。因此，依据本发明， 使用一种经过操作含有质粒的完整微细胞，基因治疗可以改善特性为α-球蛋白相对于 β-球蛋白过度产生的β-地中海贫血，该质粒整合了一种序列，其具有与α-球蛋白mRNA 的目标序列相对的反义RNA转录产物。在肿瘤的治疗中，依据本发明适合使用的治疗性核酸分子可以具有一种序列，其相应于或来自与肿瘤抑制相关的基因，例如P53基因、视网膜母细胞瘤基因、以及编码肿瘤坏死因子的基因。依据本发明，通过这种方法可以治疗多种实体肿瘤-癌、乳头瘤以及疣。 在这一点上的代表肿瘤包括结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、头部和颈部肿瘤以及淋巴瘤。 作为例证的乳头瘤是鳞状细胞乳头瘤、脉络丛乳头瘤以及喉部乳头瘤。疣病的实施例为生殖器疣、足底疣、疣状表皮发育不良以及恶性疣。用于本发明的一种治疗性核酸分子还可以含有一个DNA片段，其编码将无活性前体药物转化成一种或多种细胞毒性代谢物的酶，使得在体内引入前体药物时，有效的靶细胞被强迫，可能与邻近细胞一起，进行自杀。Spencer (2000年)，Siangra等人(2000年) 以及^zawa等人(2002年)回顾了该种非人类来源和人类来源“自杀基因”的临床前以及临床使用。非人类来源自杀基因的例子包括那些分别编码HSV-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(rk)、胞嘧啶脱氨酶(CDA) +尿嘧啶磷酸核糖转染酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转染酶(GPT)、硝基还原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，DeoD)、细胞色素P450 (CYP4B1)、羧肽酶 G2(CPG2)以及D型氨基酸氧化酶(DAAO)的基因。人类来源自杀基因的例子包括分别编码羧肽酶 Al (CPA)、脱氧胞苷激酶(dCK)、细胞色素 P450 (CYP2B1，6)、LNGFR/FKBP/Fas, FKBP/ Caspases以及ER/p53的基因。依据本发明的自杀基因疗法可以用于治疗艾滋病。该方法已经使用自杀载体进行了测试，一旦经处理的哺乳动物细胞被HIV-I感染，该载体就表达一种毒性基因产物。在被 HIV-I感染后，这些载体使用HIV-I调节成分，Tat和/或Rev来诱导毒性基因比如α -白喉毒素、胞嘧啶脱氨酶或干扰素_a2的表达(Curiel等人，1993年；Dinges等人，1995年； Harrison等人，1992a ；Harrison等人，1992b ；Ragheb等人，1999年)。使用本发明的重组微细胞法，在HIV感染后，细胞可以被这些载体转换并比未转换细胞清除的更快，以细胞死亡为代价防止病毒的复制。通过本发明的方法引入的一种核酸分子可以包括一种指示成分。指示成分典型的通过编码一种在其他情况下宿主无法产生的多肽，使得它的重组宿主具有易于检测的表型或特性，经过表达后，该多肽可以被组织学或原位分析，比如体内成像技术所检测到。例如， 依据本发明的完整微细胞所传输的一种指示成分可以编码一种能够在吞噬性宿主细胞中产生比色分析或荧光分析改变的蛋白，该变化可以通过原位分析检测并且是转录活性的一种定量或半定量函数。这些蛋白的示例包括酯酶、蛋白酶和其他酶，它们的活性能够产生一种可检测的发色团或荧光团。优选的实施例是大肠杆菌β -半乳糖苷酶，其通过裂解产靛青底物吲哚-β -D-半乳糖苷来导致色彩变化，以及一种荧光素酶，其能够氧化一种长链醛(细菌荧光素酶)或一种杂环羧酸(荧光素)，伴随光的释放。在此范围内同样有用的是一种指示成分，其能够编码水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(GFP)，正如Prasher等人所述(1995年)。 两项已经发布的PCT申请，WO 095/21191(公布了编码一种238个氨基酸的GFP脱辅基蛋白的多聚核苷序列，该脱辅基蛋白含有从氨基酸65至氨基酸67组成的发色团)和WO 095/21191 (公布了 A. Victoria GFP脱辅基蛋白cDNA的一种变体，其提供了一种肽，具有改变的荧光特性)举例说明了 GFP相关技术的领域，并且Heim等人(1994年)报告了一种突变GFP，其特性为激发振幅提高了 4至6倍。其他类型的指示成分涉及一种表达产物，其能够使重组微细胞抵抗毒素。例如， neo基因能够保护宿主抵抗毒性水平的抗生素G418，而一种编码二氢叶酸还原酶的基因能够产生甲氨蝶呤耐药性，并且氯霉素乙酰基转染酶(CAT)基因能够赋予对氯霉素的耐药性。用作指示成分的其他基因包括那些能够转化宿主微细胞以表达特异细胞表面抗原，例如病毒外壳蛋白比如HIV gpl20或疱疹gD的基因，其易于为免疫测定所检测到。按照本发明方法引介的核酸分子还可以具有操作连接至调节成分，例如启动子、 终止子、增强子和/或信号序列的所需编码片段。一种合适的启动子可以是组织特异性或者甚至肿瘤特异性的，如同治疗范围所规定的那样。当启动子偏向于在特定的组织中激活，并且因此在靶组织中生效，促进操作连接的结构序列表达时，它是“组织特异性”的。组织特异性启动子的范畴包括，例如白蛋白和 al_抗胰蛋白酶各自的肝细胞特异性启动子；弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺泡细胞中是具有活性的；胰岛素基因控制区，在胰腺β细胞中具有活性；小鼠乳腺肿瘤病毒控制区， 其在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性；髓磷脂基础蛋白基因控制区，其在大脑的少突细胞中具有活性；以及促性腺释放激素基因控制区，其在下丘脑细胞中具有活性。参见 Frain 等人，(1990 年)，Ciliberto 等人(1985 年)，Pinkert 等人(1987 年)，Kelsey 等人 (1987 年)，Swift 等人(1984 年)，MacDonald (1987 年)，Hanahan (1985 年)，Leder 等人 (1986 年)，Readhead 等人(1987 年)以及 Mason 等人(1986 年)。还有偏向于在某些肿瘤细胞或本质是肿瘤细胞中表达的启动子，依据本发明其可以用于治疗不同的肿瘤。此类肿瘤细胞特异性启动子的示例有酪氨酸酶启动子，目标为黑色素瘤；MUCl/Df3启动子，目标为乳腺癌；杂交myoD增强子/SV40启动子，表达目标为横纹肌肉瘤(RMS)；癌胚抗原(CEA)启动子，其为CEA表达细胞比如大肠癌细胞特异性的，以及己糖激酶II型基因启动子，目标为非小细胞肺癌。参见Hart(1996年)， Morton&Potter (1998 年)，Kurane 等人(1"8 年)以及 Katabi 等人(1"9 年)。依据本发明，可以使用一种信号序列来实现表达产物的分泌或将一种表达产物定位至特殊的细胞室。因此通过完整微细胞传输的一种治疗性多聚核苷酸分子可以包括一个位于合适的阅读框架中的信号序列，使得所关心的表达产物由吞噬细胞或其子代分泌，从而影响周围的细胞，与所选择的治疗范例相一致。信号序列的示例包括U. S. patent No. 5，143，830中描述的溶血素C末端分泌序列，U. S. patentNo. 5，037，743中公开的BARl 分泌序列，以及U. S. patent No. 6，025，197中描述的zsig32多肽的信号序列部分。如上所述，本发明的完整重组微细胞保持体内完整性的能力使得它们可以用于基因治疗。完整微细胞不携带重组细菌细胞例如，志贺氏痢疾杆菌、李斯特单胞菌、大肠杆菌或伤寒沙门氏菌中存在的细菌染色体组DNA，而其他细胞已经用其将真核表达质粒转染入宿主细胞。参见Sizemore等人(1"5年)；Gentschev等人(2OOO年)；Catic等人(1"9 年)；Dietrich等人(1998年)；以及Courvalin等人(1995年)。因此，依照本发明使用完整微细胞的基因治疗不会伴有与使用重组细菌和将一种细菌或耐抗生素标记基因无意识的转染至患者固有微生物菌丛相关的风险。另外，必须通过细胞介导的免疫性从患者体内清除重组细菌，因此重组细菌不适合用于对患有例如肿瘤或艾滋病的免疫受损患者进行基因治疗。可以从任何革兰氏阳性或革兰氏阴性来源的细菌细胞中制备微细胞。由于本发明使用完整微细胞而不是微细胞原生质，本发明不需要并且优选不涉及对微细胞进行任何抗生素或化学预处理。可以通过min基因的突变，例如min⑶E基因序列的部分缺失来生成产微细胞细菌株，如下面的实施例1和2中所示。为了获得重组的完整微细胞，依据本发明， 通过标准技术对所选择产微细胞菌株的细菌细胞进行转化，标准技术包括但不局限于使用电穿孔(Shigekawa&Dower, 1988年)，化学方法(Hanahan, 1983年)，往复式载体 (Marcil&Higgins，1992年)以及结合作用(Firth等人，1996年)或传导(Davis等人，1980 年)。为了这种转化，将来自任何真核、原核或合成来源的治疗性核酸分子插入一种合适的市售或终端用户专有的质粒载体中。所选择的DNA可以被操作连接至所需控制成分，用于体内的基因传输和/或DNA在吞噬重组微细胞的细胞中进行表达。优选在体外对重组微细胞进行分析以确保它们能够将重组质粒或DNA序列传输至靶细胞核，并且在靶细胞中发生重组基因的表达。对表达的检测将取决于异源性基因的特性。可以通过多种方法监测表达，包括免疫学、组织化学或活性检验。荧光标记基因的表达可以通过显微镜观察，并且此特性提供了一种特别方便的检验。例如，处于真核基因表达启动子，例如CMV启动子控制下的编码绿色荧光蛋白的基因，可以在质粒上通过重组微细胞转染至真核靶细胞(参见下面)。另外，使用合适的DNA或RNA探针，northern印迹分析或逆转录酶PCR(RT-PCR)可以用于评价转录。如果可以获得异源性基因所编码多肽的抗体，Western印迹分析、免疫组化或其他免疫学技术均可用于评价多肽的产生。如果异源性基因是一种酶，则也可使用合适的生化检验。例如，如果异源性基因编码抗生素耐药性，那么测定被感染细胞对抗生素的耐药性可以用于评价抗生素耐药基因的表达。可以通过测定培养物中的DNA传输效率来评价推定宿主(“靶”)细胞的吞噬能力。因此，可以对靶肿瘤进行活检，所产生的组织样品将以传统方式使用，通过培养获得代表肿瘤细胞，以测定其吞噬本发明中携带，例如，一种合适指示成分的重组微细胞的能力。除了测定这种主要细胞培养物外或者另外，依据本发明，可以通过测试治疗方案中关键类型组织的代表细胞系来测量吞噬微细胞的能力。细胞培养技术的文献很多，例如 Freshner(1992)。依据本发明，可以通过数种方法从母细胞中提纯重组微细胞。一种方法使用例如 Reeve (1979年)和Clark-Curtiss等人(1983年)所描述的蔗糖梯度法，随后用抗生素，比如庆大霉素进行处理O00微克/毫升，2小时)以杀灭残存的活菌。使用传统方法所获得的最佳纯度为1个污染母细胞/IO6-IO7个微细胞。依据本发明，对于体内使用而言，所需剂量高于IO6并且可能高达101°/每剂，按照前述污染比率，将转化为10，000个活母细胞/每剂。这种污染水平会是致命的，尤其是在免疫受损的患者中。另外，传统方法使用含有梯度形成剂的介质，比如蔗糖、甘油或Percoll ·，它们的存在对于体内使用是有害的，正如现在所考虑的。因此，Percoll ·的毒性将其限制于“仅用于研究目的”的范围内，而用于产生梯度的蔗糖会产生高渗透压，导致微细胞发生生理学改变。因此，为了应用于依据本发明之基因治疗，优选将母细胞污染最小化并使用生物兼容性更好的介质。为了达到这些目标，本发明者已经发现将横向流动过滤(供液与膜表面平行)与终端过滤(供液与膜表面垂直)联合使用会有意想不到的好处。通常的，参见 Forbes (1987年)。在这种联合前可以选择进行差速离心，在低离心力下除去一部分细菌细胞并从而使微细胞的上清液浓缩。还可以选择在联合后进行抗生素处理以杀灭残存亲代细菌细胞。横向流动过滤可以依靠滤器的孔径将微细胞从更大的污染物，比如亲代细菌细胞，以及更小的污染物，比如细菌气泡、游离内毒素、核酸细胞碎片以及多余的液体中分离。 为了从更大的污染物中分离微细胞，横向流动滤器的标称孔径应当允许微细胞透过滤器， 而留下更大的细菌细胞。优选0. 45微米的孔径用于此目的，因为微细胞的直径大约为0. 4 微米，而细菌细胞更大。为了从更小的污染物中分离微细胞，横向流动滤器的标称孔径应当允许更小的污染物透过滤器，而留下微细胞。优选0. 2微米的孔径用于此目的，其他更小的污染物都小于0.2微米。在此条件下有效的使用活性流动滤器典型的需要至少有一个步骤涉及大孔径，大约0. 45微米，然后至少有一个步骤涉及小孔径，大约0. 2微米。在连续横向流动过滤的步骤之间或之中，可以进行透滤以尽可能多的回收微细胞。横向流动过滤的使用可以容纳携带大量颗粒物质的悬浊液，例如细菌培养物，其携带的细胞负荷为IO11至IO13个细菌和微细胞群体/升培养物。为了使滤器淤塞与随后的微细胞丢失最小化，可以将细菌/微细胞培养物进行稀释，优选稀释5至10倍。稀释后还能使用适当的低大气压与流率。为了在横向流动过滤后除去残存的亲代细胞残余物，进行终端过滤。为此，优选使用大约0. 45微米的孔径进行至少一次终端过滤。通常，过滤可以提供适合于转基因研究的微细胞无菌制剂。为了进行体内基因转染，优选进一步用抗生素处理以降低细菌细胞污染的风险。例如，可以用含有亲代细菌株敏感抗生素的生长介质重悬微细胞。事先可以用传统技术测定为此应给予抗生素的合适数量。连续横向流动过滤/终端过滤排列，正如所述，不但省却了梯度形成剂的使用， 还提供了超过10_7的纯度(也就是少于1个亲代细胞/IO7个微细胞)。优选纯度超过 IO-8,并且更优选近似于10_9的纯度。连续横向流动过滤/终端过滤还提供了更好的质量控制。另外，无需氨卞青霉素、环丝氨酸或其他抗生素的耐药基因，如Clarke-Curtiss和 Curtiss (1983)的技术所需的。此外，与Sancar等人(1979年)描述的方法不通，连续纯化法不使用任何破坏DNA的射线；因此，使用通过连续横向流动过滤/终端过滤排列制备的微细胞所传输的治疗性核酸分子不含有放射线诱导的非特异性突变。本发明中实质由重组微细胞组成的组合物(更确切的说，一种化合物，其包括该微细胞和其他不对组合物的DNA传输质量产生不当影响的成分)可以使用一种和多种生理学上可接受的载体和赋形剂，通过传统方法制造。用于注射的配方可以以单位剂量的形式，例如在安瓿或小瓶，或在多剂容器中提供，含有或不含辅助额外的防腐剂。配方可以是溶液、悬浊液或在油性或水性媒介中的乳剂，并可以含有配剂，比如悬浮、稳定和/或分散剂。合适的溶液是接受者血液的等张液，其示例有生理盐水、林格氏液以及右旋糖溶液。另外，微细胞可以是冻干粉的形式，用于与合适的媒介，例如无菌、无热源水或生理盐水重新复原。微细胞还可以制成长效制剂。这种长效配方可以通过移植(例如，皮下或肌肉内) 或者肌肉内注射给药。本发明的含有微细胞组合物可以通过各种途径给药至哺乳动物身体的各种部位， 以获得所需的局部或全身治疗效果。可以通过例如口服、将制剂用于体腔、吸入或吹入、或经肠道、肌肉内、静脉内、门脉内、肝内、腹膜、皮下、肿瘤内或皮内给药完成传输。所考虑应用的特性同样影响(或者受影响)用于传输治疗性核酸分子的重组微细胞细菌源的选择。例如，沙门氏菌、埃希氏菌和志贺氏菌属携带的附着因子能够被胃肠道中肠细胞上的内吞作用介导受体所识别，可能适合于口服给药，用于传输对结肠癌细胞有效的治疗性核酸分子。类似的，来自幽门螺旋杆菌的微细胞携带胃上皮细胞特异性的附着因子，适合于目标为胃癌细胞的口服传输。对于来自假单胞菌属的完整微细胞，其携带的附着因子能够为肺上皮细胞所识别，则吸入或吹入可能是理想的给药方法；将编码比如CFTR蛋白的治疗性核酸分子传输至囊性纤维化患者的肺部。来自乳酸杆菌的微细胞携带尿道和膀胱上皮细胞特异的附着因子，非常适合于将治疗性核酸分子从尿道内传输至尿道或膀胱肿
本发明可以用于传输一列核酸分子，它可以是cDNA和染色体组DNA或RNA，并且其方向可以是顺义或反义。依照本发明，在完整微细胞中存在的核酸分子可以是质粒、表达载体或其他遗传结构的形式，但不能是来自产生微细胞的细菌细胞的染色体组DNA。适合于在本发明中使用的序列包括来自真核、原核或合成来源的任何所需DNA或RNA序列，其能够受控于真核基因表达启动子的翻译和转录控制，或能够使用来自宿主细胞的反激活因子在哺乳动物细胞中表达。实施例^MMl^从革兰氏阴性细菌，伤寒沙门氏菌，大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌中产生细菌微细胞如这里所述(A，B和C)以及图2和3所示，从革兰氏阴性细菌中产生产微细胞细菌株。常规材料和方法在下面的例子中所用的细菌株列在并请参考表1。所有的细菌都生长自保存于-80摄氏度的甘油原料。沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌以及李斯特菌株都生长在胰酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB) (BBL 牌，购自 Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australia)中。根据制造商的说明制备成30克/升，并在121摄氏度高压灭菌15分钟。液体培养物生长于37摄氏度的摇动培育箱内。通过放置于XLD琼脂(木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐)盘上分别产生红色和黄色群落来区分志贺氏菌株与大肠杆菌。XLD购自Oxoid (Melbourne，Australia)。 根据生产商的说明制备成53克/升，然后煮沸2分钟。在液体和固体媒介中按照下列浓度使用抗生素氨卞青霉素，100微克/毫升，氯霉素，30微克/毫升，卡那霉素，30微克/毫升。表1.所用的细菌株
权利要求
1.一种组合物，其包括(i)重组的完整微细胞以及(ii)为此的一种药学上可接受的载体，其中所说的微细胞含有一种治疗性核酸分子。
2.根据权利要求1的组合物，其中所说的组合物所含污染物低于1个污染亲代细菌细胞/IO7个微细胞。
3.根据权利要求1的组合物，其中所说的组合物所含污染物低于1个污染亲代细菌细胞/IO8个微细胞。
4.根据权利要求1的组合物，其中所说的组合物所含污染物低于1个污染亲代细菌细胞/IO9个微细胞。
5.一种组合物，其实质上由含有一种治疗性核酸分子的重组完整微细胞所组成。
6.一种遗传转化方法，其包括(i)提供重组的完整微细胞，其含有一种由第一核酸序列组成的质粒，以及(ii)将上述微细胞与具有噬菌作用或内吞作用的哺乳动物细胞接触， 使得上述微细胞被该哺乳动物细胞吞噬，哺乳动物细胞借此产生该第一核酸序列的一种表达产物。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的哺乳动物细胞位于体内，并且所说的第一核酸序列编码治疗性表达产物。
8.—种提纯方法，其包括将含有微细胞的样品(i)通过一系列横向流动滤器，然后 (ii)通过一个终端滤器，借此从该样品的污染物中分离微细胞，以获得纯化的微细胞制剂。
9.根据权利要求8的一种方法，其进一步包括用抗生素处理该纯化微细胞制剂的步马聚ο
10.根据权利要求8的一种方法，其进一步包括一个预备步骤，将上述含有微细胞的样品进行差速离心。
11.根据权利要求8的一种方法，其中所说的一系列横向流动滤器包括至少1个孔径大于或等于0. 45微米的滤器，以及至少一个孔径小于或等于0. 2微米的滤器。
12.根据权利要求11的一种方法，其中所说的终端滤器的孔径为大约0.45微米。
13.根据权利要求12的一种方法，其中所说的一系列横向流动滤器包括至少2个孔径为大约0. 45微米的滤器，以及至少1个孔径为大约0. 2微米的滤器。
14.根据权利要求13的一种方法，其进一步包括用抗生素处理该纯化微细胞制剂的步马聚ο
15.一种重组完整微细胞在药物的制备过程中的用途，该微细胞含有治疗性核酸分子， 用于治疗疾病或通过将该药物给予细胞、组织或器官以改变特性的方法。
全文摘要
本发明涉及用作体外和体内DNA转染与基因治疗载体的完整微细胞。具体而言，本发明公开了一种组合物，其包括(i)重组的完整微细胞以及(ii)为此的一种药学上可接受的载体，其中所说的微细胞含有一种治疗性核酸分子。本发明还公开了一种遗传转化方法，其包括(i)产生可利用的重组完整微细胞，其含有一种由第一核酸片段组成的质粒，以及(ii)将微细胞与具有吞噬能力的哺乳动物细胞接触，使得微细胞被哺乳动物细胞吞噬，其随后产生第一核酸片段的一种表达产物。另外，本发明还公开了用于提纯这种微细胞制剂的方法以及重组完整微细胞在药物的制备过程中的用途。
文档编号C12N1/21GK102172406SQ20111002640
公开日2011年9月7日 申请日期2002年10月15日 优先权日2001年10月15日
发明者H·布拉姆哈特, J·麦克戴尔米德 申请人:恩吉尼克分子传递私人有限公司