专利名称：红球菌zjph1003及其在制备s-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可用于微生物催化不对称水解2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯制备 S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的新菌株——红球菌(Rhodococcus sp.)ZJPH1003及其在微生物催化不对称水解2，2_二甲基环丙烷甲酸乙酯制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸中的应用。
背景技术：
西司他丁的化学名为(+)-(Z)-7-K2R)_(2-氨基_2_羧基乙基) 硫]-2-[(lS)-(2，2-二甲基环丙烷甲酰胺基)]-2_庚烯酸，是第一个应用于临床的肾脱氢二肽酶抑制剂。西司他丁与亚胺培南(imipenem)以1 1比例制成的复合剂泰能 (tienam )，为碳青霉烯类抗生素，该药既有极强的广谱抗菌活性，又有β -内酰胺酶抑制作用，特别适用于多种菌联合感染以及需氧菌和厌氧菌的混合感染，是目前临床应用最广泛的抗生素之一。西司他丁的制备涉及S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸(甲酰胺)、7_溴 (氯)-2-氧代庚酸和L-半胱氨酸三个合成中间体，其中具有光学活性的S-(+)-2,2- 二甲基环丙烷甲酸是合成西司他丁药物的关键中间体之一。此外，2，2_ 二甲基环丙烷甲酸衍生物也是合成拟除虫菊酯类杀虫剂的关键中间体，用途十分广泛。2，2_ 二甲基环丙烷甲酸的合成及拆分技术近几年日益受到人们的关注。采用化学法制备S-(+)_2，2-二甲基环丙烷甲酰胺(或甲酸)的合成步骤较多， 反应条件比较苛刻，得率偏低，反应过程中需使用大量的有机溶剂，对环境造成污染，或是使用价格昂贵的手性催化剂(Wang Qinwei, etal. Tetrahedron =Asymmetry, 1998,9 3971-3977)。采用微生物催化制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸具有反应条件温和、选择性高和环境友好等优点。目前，文献已报道的生物催化合成S-(+)_2，2-二甲基环丙烷甲酸(或甲酰胺)的方法多采用以腈类底物为原料的生物合成路线，例如Wang Mei-Xiang φ (Journal of Molecular Catalysis B =Enzymatic 18,2002 267-272.)从土壤中筛选到菌种Rhodococcus sp. AJ270，可水解2，2-二甲基环丙烷甲腈得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，反应条件如下0. lmol/L的pH 7. 0磷酸钾缓冲液50ml， Immol的2，2- 二甲基环丙烷甲腈为底物，30°C下反应池，产物e. e.值为82%，产率为39%。 20°C下反应4. 5h时，e. e.值为88%，产率为44%。Yeom 等(Enzyme and Microbial Technology, 2007 (41) :842-848.)利用红球菌 Rhodococcus erythropolis ATCC 25M4，以2，2-二甲基环丙烷甲腈为底物，通过微生物细胞水解得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。反应条件如下50mmol/L的pH 7. 0磷酸钾缓冲液，10% (ν/ν)甲醇，底物浓度为100mmOl/L，20°C下反应64h后产物e. e.值达到81.8%， 产率为45%。郑裕国等(郑裕国等，中国发明专利，申请号200510061680. 9)采用Rhodococcuss equi CCTCC M 205114和Delftia tsuruhatensis CCTCC M205115双菌种联合转化外消旋2，2_ 二甲基环丙烷甲腈制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺，产率为47% 以上，e. e.值大于98%。上述文献中用到的底物2，2_ 二甲基环丙烷甲腈在合成过程中需使用剧毒的氰化物，在一定程度上影响到该路线的环境效益。而本发明系利用自行筛选得到的微生物新菌种一红球菌(Iihodococcus sp.)ZJPH1003细胞内含有的酯水解酶，以外消旋2，2- 二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，通过生物拆分制备得到光学纯S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，是一条不同于上述文献报道的“绿色”制备新方法。尽管采用脂肪酶Novozyme 435也可选择性水解外消旋2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸(王普等，催化学报，2010,31 (6) =651-655)，但商品脂肪酶的价格较高，在一定程度上也限制了其工业化应用。
发明内容
本发明目的是提供一株可用于微生物催化不对称水解2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的微生物新菌株——红球菌(Rhodococcus sp.) ZJPH1003,以及该菌种在催化不对称水解制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸中的应用。本发明采用的技术方案是红球菌(Rhodococcus sp. )ZJPH1003，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072 ；保藏编号CCTCC NO =M 2010371，保藏日期2010年12
月四日。与现有类似菌株相比，本发明菌种易培养，生物催化剂的制备成本低，并且底物转化反应时间较商品脂肪酶催化过程大大缩短。菌种来源红球菌(Rhodococcus sp. )ZJPH1003菌株系从采自浙江温州地区农田土样中分离筛选获得。该新菌种的特征如下菌落形态30°C培养48h，菌落呈圆形，表面湿润，光滑，略微隆起。菌落呈淡红色， 不透明，有光泽，颜色随菌种保藏时间的增加而逐渐变深。细胞形态细胞为球状，有些呈现短杆状，可单个、成对排列或聚集成丛。生理生化特征革兰氏染色阳性，不生芽孢，不运动，无荚膜，专性需氧。在Biolog 碳源自动鉴定仪检测结果中，可以利用的碳源有糊精、D-松二糖、α-D-乳糖、N-乙酰-D-氨基半乳糖、α -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖醇、D-葡萄糖-6-磷酸盐、D-天冬氨酸、甘氨酰-L-脯氨酸、L-组氨酸、果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖酸、葡糖醛酰胺、粘质酸、奎尼酸、D-乳酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、α -酮基戊二酸、L-苹果酸、溴代琥珀酸、吐温40、β -羟基-D，L- 丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸。不能利用的碳源有D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、木苏糖、D-蜜三糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β -D-甘露糖胺、N-乙酰神经胺糖酸、D-半乳糖、3-甲基葡萄糖、D-岩藻糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇、肌醇、甘油、D-果糖-6-磷酸盐、D-丝氨酸、明胶、L-丙氨酸、L-精氨酸、 L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-半乳糖酸内酯、D-葡萄糖醛酸、D-糖二酸、P-羟基苯乙酸、甲基丙酮酸盐、D-苹果酸、Y-氨基-丁酸、α-羟基丁酸、α-酮基丁酸、甲酸。菌种的16S rDNA序列特性以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物Pl和Ρ2 扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳切胶纯化。再经测序确认所述红球菌ZJPH1003的16S rDNA基因序列如下GTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTACAGGGGGTGATCTGCC CTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAATGGGTCTAATACCGGATACGACCAAAGGCTGCATGGTTTTTGGTGGAAAGG TTTACTGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGC CGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT TGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTT TCAGC AGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAG CTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCG TGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACG GGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGA CGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATA CCGGACCGCCGTAGAGATACGGTTTCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGA GACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACAT GCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCG GGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGGTGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCG。 该序列已提交GenBank (GenBank登录号为No. HQ840650)，将ZJPH1003菌株的 16SrRNA 序列在 NCBI 网站(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)上进行同源性比对(BLAST), 结果表明ZJPH1003菌株与红球菌属(Iihodococcus sp.)的部分菌株序列同源性较高。 ZJPH1003 菌株与 Rhodococcus sp. BFXJ-2 菌株(GenBank 登录号为 No. EUO17404)的序列同源性达到100%。根据生理生化特性并结合分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为红球菌 (Rhodococcus sp.)ZJPH1003。采用Box-Behnken旋转中心组合实验设计法对甘油浓度、蛋白胨浓度和NaCl浓度三个对产酶影响显著的因素进行优化，得到红球菌(Miodococcus sp.)ZJPH1003菌株的优化培养基组成为甘油5 30g/L，蛋白胨10 30g/L, NaCl 1. O 4. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0· 3 0. 6g/L, K2HPO4O. 5 4g/L, KH2PO4O. 5 2g/L, pH 6· O 7· 5。红球菌(Rhodococcus sp. )ZJPH1003的培养条件为初始pH 6. O 7. 5，摇瓶装液量80 100mL/250mL锥形瓶，培养温度30°C、摇床转速180 220rpm，接种量4 12%， 培养时间36 48h。本发明所涉及的微生物菌种是通过以下方法筛选得到1)富集培养取采自全国各地的土样2 3g加入到装有50mL富集培养基的250mL摇瓶中，300C，200rpm,培养3 5d，待培养液变混浊后，取5mL培养液转接至新鲜的富集培养基中，继续培养3 5d，如此重复富集培养3 5次。富集培养基中以2，2- 二甲基环丙烷甲酸乙酯为唯一碳源。富集培养基配方如下2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯50mmol/L， (NH4) 2S044g/L, K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 0. 5g/L, MgSO4 · 7H200. 5g/L, pH 7. 0。2)平板培养富集培养液经梯度稀释至10_6 10_8，涂布到分离平板上，30°C培养 3 5d，平板培养基组成为富集培养基中加入15-20g/L的琼脂。3)斜面培养从平板中生长的菌落中挑取单菌落进行斜面培养，30°C培养2 3d 至出现丰满的菌苔后，置于4°C冰箱保存，备用。斜面培养基配方如下葡萄糖10g/L，蛋白胨 5g/L，酵母膏 3g/L，(NH4) 2S044g/L，K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 0. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，琼脂 20g/L，pH 7.0。4)种子培养从培养成熟的斜面挑一环菌体接入装有IOOmL种子培养基的250mL 摇瓶中，30°C，200r/min培养M小时。种子培养基配方如下葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L， 酵母膏 3g/L，(NH4) 2S044g/L，K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 0. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，pH 7. 0。5)发酵培养以10%的接种量将种子液转接到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中，30°C，200r/min培养48小时。发酵培养基配方同种子培养基。6)生物转化反应将离心得到的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入一定量的2， 2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，置30°C摇床中转化一定时间。转化结束后，转化液用等体积乙酸乙酯萃取，经离心后得到上清液，采用手性气相色谱法分析目的产物和残留底物的含量， 以及产物的光学纯度。7)分析检测反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取ImL萃取液加入IyL十二烷进行分析。气相色谱条件日本岛津GC-2014气相色谱仪；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱Q5mX0. 25mmX0. 25μπι)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min ；进样量1 μ L，分流比为 15 1;检测器和进样口温度均为250°C;色谱柱温度80 180°C;升温速度8°C/min;检测器为FID。气相色谱图见图1 3。本发明还涉及所述红球菌(Iihodococcus sp. ) ZJPH1003在微生物催化不对称水解制备S- (+) -2，2- 二甲基环丙烷甲酸中的应用。具体的，所述应用为以2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以红球菌ZJPH1003 湿菌体细胞为酶源，20 40°C下，于pH为5.四 9. 18的缓冲液中进行转化反应12 48 小时，反应结束后反应液经分离纯化得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。所述缓冲液转化体系中，底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的初始浓度为10 50mmol/L缓冲液，红球菌ZJPH1003湿菌体细胞的用量以湿重计为300 500g/L缓冲液。所述缓冲液为常规用于细胞反应的缓冲液，如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、 Tris-HCl缓冲液等，优选的，所述反应在pH 6. 98的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中进行。所述湿菌体细胞可按照常规方法由菌株发酵后分离获得，优选的，所述红球菌 ZJPH1003湿菌体细胞由如下方法制备得到将红球菌ZJPH1003接种至适用于红球菌的发酵培养基，30°C、200rpm摇床培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到所述湿菌体细胞。所述适用于红球菌的发酵培养基为本领域常规用于红球菌培养的培养基，本发明中，作为优选的技术方案，所述发酵培养基终浓度组成如下甘油5 30g/L，蛋白胨10 30g/L, NaCl 1. 0 4. 5g/L, MgSO4 · 7Η20 0· 3 0. 6g/L, K2HPO4O. 5 4g/L, KH2PO4O. 5 2g/L, pH 6· 0 7· 5。具体的，所述应用方法如下(1)将红球菌ZJPH1003接种至发酵培养基，30°C、200rpm振荡培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下甘油15g/L， 蛋白胨 25g/L, K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 1. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, pH 7. 0 ；(2)取pH为6. 98的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞，所述湿菌体细胞浓度以湿重计为400g/L缓冲液，加入底物2，2- 二甲基环丙烷甲酸乙酯至底物浓度为30mmol/L缓冲液，30°C摇床200rpm振荡反应M小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，于有机相中得到S- (+) -2，2- 二甲基环丙烷甲酸。本发明从土样中筛选获得了一株新的微生物转化菌种，提出了生产S-(+)_2， 2-二甲基环丙烷甲酸的一种新方法，即利用酯水解酶产生菌水解2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯得到S- (+) -2，2- 二甲基环丙烷甲酸，该方法尚未见有文献报道，从而在研究微生物催化法制备西司他丁药物关键手性中间体S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸方面提供了有益的参考。本发明的有益效果主要体现在提供了一株可用于微生物催化不对称水解2， 2-二甲基环丙烷甲酸乙酯制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的微生物新菌种，采用该新菌种催化制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸具有路线新颖，生物催化剂制备成本低，催化效率高，环境友好等优点；通过采用红球菌(Miodococcus sp.)ZJPH1003细胞为催化剂的生物催化，当底物浓度为30mmol/L时，目的产物S-(+)-2，2- 二甲基环丙烷甲酸的e. e.达到82. 5%，产率达到41.3%。
图1为底物标准品气相色谱图；图2为产物标准品气相色谱图；图3为红球菌ZJPH1003菌株生物催化反应萃取液气相色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 产物的检测方法GC法测定目标产物的光学纯度和产率反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物是十二烷。取ImL萃取液加入IyL十二烷进行分析。气相色谱条件日本岛津GC-2014气相色谱仪；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱O5mX0. 25mmX0. 25μπι)。载气为高纯氮气，流量为2mL/min ；进样量1 μ L，分流比为15 1 ；检测器和进样口温度均为250°C ；色谱柱温度80 180°C ；升温速度:8°C /min ；检测器为FID。用相对校正因子分别计算出反应液中的底物和产物的浓度。进而求出反应的产率 (Yield)。计算式为产率=CVCciX100%式中Q、Ci分别为反应起始底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess, e. e.)来表示。e. e. = (Cs-Ce) / (CS+CE) X 100 %式中Cs和Ck分别为S型和R型2，2_ 二甲基环丙烷甲酸的摩尔浓度。实施例2 湿菌体细胞的获得种子培养基配方葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，(NH4) 2S044g/L, K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 0. 5g/L, MgSO4 · 7H200. 5g/L，溶剂为水，pH 7. 0。发酵培养基配方甘油15g/L，蛋白胨 25g/L，K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 1. 5g/ L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶剂为水，pH 7. 0o从培养成熟的斜面挑一环菌体(CCTCC NO =M 2010371)接入装有IOOmL种子培养基的250mL摇瓶中，30°C，200rpm培养M小时得种子液，再以体积比10%的接种量将种子液转接到装有IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中，30°C，200rpm培养48小时。培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤一次，收集湿菌体细胞，备用。实施例3 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入lOmmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为4.65mmol/L，光学纯度e. e.值80. 1%，产率46. 5%。实施例4 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入20mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为8. 57mmol/L，光学纯度e. e.值82. 4%，产率42. 9%。实施例5 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为11.53mmol/L，光学纯度e. e.值83. 5%，产率38. 4%。实施例6 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98)中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L;加入40mmol/L的2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为12. 86mmol/L，光学纯度e. e.值84. 7%，产率32. 2%。实施例7
将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入50mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为13.09mmol/L，光学纯度e. e.值85. 1%，产率沈.2%。实施例8 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 5. 29) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为7. 38mmol/L，光学纯度e. e.值84. 9%，产率6%。实施例9 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 5. 91) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于30°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为8. ^mmol/L，光学纯度e. e.值84. 2%，产率27. 6%。实施例10 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6. 47) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为9. 57mmol/L，光学纯度e. e.值83. 8%，产率31. 9%。实施例11 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应Mh。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为11. 19mmol/L，光学纯度e. e.值83. 4%，产率37. 3%。实施例12 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应12h。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为7. 03mmol/L，光学纯度e. e.值84. 5%，产率23. 4%。实施例13 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2,2- 二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于20°C，200rpm的摇床中反应20h。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为9. 72mmol/L，光学纯度e. e.值83. 8%，产率32. 4%。实施例14 将实施例2所得的湿菌体悬浮于IOmL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 98) 中，湿菌体以湿重计浓度为400g/L ；加入30mmol/L的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯作为底物，置于30°C，200rpm的摇床中反应^h。采用实施例1的检测方法，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的浓度为12. 39mmol/L，光学纯度e. e.值82. 5%，产率41. 3%。
权利要求
1.红球菌(Rhodococcussp. )ZJPH1003，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编=430072 ；保藏编号:CCTCCN0 =M 2010371，保藏日期:2010年12月 29日。
2.红球菌(Rhodococcussp.) ZJPH1003在微生物催化不对称水解制备S- (+) -2，2- 二甲基环丙烷甲酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为以2，2_二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以红球菌ZJPH1003湿菌体细胞为酶源，20 40°C下，于pH为5.四 9. 18的缓冲液中进行转化反应12 48小时，反应结束后反应液经分离纯化得到S-(+)-2，2- 二甲基环丙烷甲酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液转化体系中，底物2，2_二甲基环丙烷甲酸乙酯的初始浓度为10 50mmol/L缓冲液，红球菌ZJPH1003湿菌体细胞的用量以湿重计为300 500g/L缓冲液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在pH6. 98的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中进行。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述红球菌ZJPH1003湿菌体细胞由如下方法制备得到将红球菌ZJPH1003接种至适用于红球菌的发酵培养基，30°C、200rpm摇床培养 48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到所述湿菌体细胞。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下甘油5 30g/L，蛋白胨 10 30g/L, NaCl 1. 0 4. 5g/L, MgSO4 · 7Η200· 3 0. 6g/L, K2HPO4O. 5 4g/L, KH2PO4O. 5 2g/L，pH 6· 0 7· 5。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下(1)将红球菌ZJPH1003接种至发酵培养基，30°C、200rpm振荡培养48小时，发酵液经离心、洗涤沉淀，收集得到湿菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下甘油15g/L，蛋白胨 25g/L, K2HP042g/L, KH2PO4lg/L, NaCl 1. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, pH 7. 0 ；(2)取pH为6.98的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞， 所述湿菌体细胞浓度以湿重计为400g/L缓冲液，加入底物2，2_ 二甲基环丙烷甲酸乙酯至底物浓度为30mmol/L缓冲液，30°C摇床200rpm振荡反应M小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，于有机相中得到S-⑴-2，2- 二甲基环丙烷甲酸。
全文摘要
本发明提供了一株可用于微生物催化不对称水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的新菌株——红球菌(Rhodococcus sp.)ZJPH1003及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072；保藏编号CCTCC NOM 2010371，保藏日期2010年12月29日。本发明的有益效果主要体现在提供了一株可用于微生物催化不对称水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的微生物新菌种，采用该新菌种催化制备S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸具有路线新颖，产率高，环境友好等优点。通过采用红球菌ZJPH1003细胞为催化剂的手性生物催化，当底物浓度为30mmol/L时，目的产物S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸e.e达到82.5％，产率达到41.3％。
文档编号C12N1/20GK102161978SQ20111002598
公开日2011年8月24日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者何军邀, 吕亚萍, 王普, 许江丽, 钟成刚 申请人:浙江工业大学