专利名称：羊外周血淋巴细胞的分离方法
技术领域：
本发明涉及细胞的分离方法，具体涉及羊外周血淋巴细胞的分离方法。
背景技术：
T淋巴细胞是介导细胞免疫的细胞，B淋巴细胞是产生抗体的细胞，介导机体的体液免疫，T、B淋巴细胞是机体特异性免疫应答必不可少的免疫活性细胞，对两者功能及活化机制等方面的研究一直是免疫学研究的热点，而制备高活性和高纯度的T、B淋巴细胞是进行这些研究的先决条件。密度梯度离心分离不同体积大小、不同质量的细胞，使得不同类型的细胞得以分离和纯化，通过体外扩增、工程操作后应用于细胞转基因、疾病诊断、功能基因组学研究和细胞治疗等领域。淋巴细胞分离液就是基于密度梯度离心原理设计的淋巴细胞分离试剂，利用淋巴细胞分离液能够获得高纯度的淋巴细胞。但是不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，这极大地限制了淋巴细胞分离液的通用性。根据文献报道，针对羊的淋巴细胞分离液和其淋巴细胞分离方法尚未建立起来。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够获得高存活率的羊外周血淋巴细胞分离方法。此外，此方法能够得到良好的分离效果，利于淋巴细胞的收集。为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案一种羊淋巴细胞分离的方法，其特征在于包括如下步骤a.准备有抗凝剂的注射器，从羊颈静脉中采取静脉血；b.用等体积的Hank’ s液稀释外周血，后混勻；c.将人淋巴细胞分离液以0. 6-1. OmL/管的量分别置于容器中；d.吸取稀释血液l_3mL，沿容器壁缓缓的叠加到界面上，将容器放入离心机；e.使容器在离心力作用下，其内部的溶液形成不同层次的区带，使得容器中由下至上分别为红细胞层、分离液层、淋巴细胞层、血浆层；f.吸取淋巴细胞层。在本发明的一个实施方式中，上述c步骤还包括将试管放入离心机中进行离心。在本发明的一个实施方式中，采血方式为静脉采血。在本发明的一个实施方式中，吸出淋巴细胞层的方式为使用移液器吸取。在本发明的一个实施方式中，上述离心机转速为2000-3000rpm.在本发明的一个实施方式中，上述离心机的离心时间为25-30min.在本发明的一个实施方式中，还包括用Hank’ s液洗淋巴细胞层2_3次。在本发明的一个实施方式中，所述的羊为绵羊，进一步优选为卡拉库尔羊。
图1羊淋巴细胞的分离效果照片；
图2羊淋巴细胞吉姆萨瑞氏染色照片(10X100)。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1绵羊外周血淋巴细胞的分离准备有抗凝剂的注射器，从卡拉库尔羊颈静脉中采取外周血，每次实验均采1Oml 卡拉库尔羊血液，添加1ml (3% 5% )枸橼酸钠溶液抗凝剂。用等体积的Hank’ s液稀释混勻，取人淋巴细胞分离液以0. SmL/管的量分别置于容器中，再用移液枪吸取稀释血液2mL，沿容器壁缓缓地叠加到界面上，注意不要破坏分离液界面，将试管放入离心机；离心机转速为2000-3000rpm，离心时间为25-30min，使容器在离心力作用下，其内部的溶液形成不同层次的区带，使得容器中由下至上分别为红细胞层、 分离液层、淋巴细胞层、血浆层(参见说明书附图1)；吸取淋巴细胞层后，用Hank’ s液洗 2-3次后得到较纯的淋巴细胞。实施例2淋巴细胞的检测将分离培养后的淋巴细胞取少量按常规方法进行染色，观察其纯度。取一滴细胞悬液滴在计数板上，加0. 2%台盼蓝溶液一滴充分混勻，3-5min内在显微镜照相。细胞活力检测，死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色，计数200个淋巴细胞， 计算出活细胞的百分率，按公式活细胞百分率=活细胞数/总细胞数X 100%。计数后得到的淋巴细胞团在无菌的RPMI1640培养液中按照1. OX 107个/mL的密度进行重悬，于37°C、5%的C02培养箱中以4h、6h、》i、iai的不同时间段培养，经台盼蓝染色计算出活细胞百分率分别为93. 1%,92. 4%,91. 5%和90. 6%。由此可见，根据本发明的方法，能够分离出较纯的淋巴细胞，且保证了淋巴细胞的成活率，极大地提高了绵羊淋巴细胞分离实验的效率。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种羊淋巴细胞分离的方法，其特征在于包括如下步骤a.准备有抗凝剂的注射器，从羊颈静脉中采取外周血；b.用等体积的Hank’s液稀释外周血，后混勻；c.将人淋巴细胞分离液以0.6-1. OmL/管的量分别置于容器中；d.吸取稀释血液l_3mL，沿管壁缓缓的叠加到界面上，将容器放入离心机；e.使容器在离心力作用下，其内部的溶液形成不同层次的区带，使得容器中由下至上分别为红细胞层、分离液层、淋巴细胞层、血浆层；f.吸取淋巴细胞层。
2.根据权利要求1所述的淋巴细胞分离的方法，其特征在于所述采血为静脉采血。
3.根据权利要求1所述的淋巴细胞分离的方法，其特征在于所述吸取淋巴细胞层的方式为使用移液器吸取。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的淋巴细胞分离的方法，其特征在于所述的步骤d 中离心机转速为2000-3000rpm。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的淋巴细胞分离的方法，其特征在于所述的步骤d 中离心时间为25-30min.
6.根据权利要求1-3任意一项所述的淋巴细胞分离的方法，其特征在于还包括用 Hank’ s液洗淋巴细胞层2-3次。
7.根据权利要求1-6任意一项所述羊淋巴细胞分离方法，其中所述的羊为绵羊，进一步优选为卡拉库尔羊。
全文摘要
本发明公开了一种羊淋巴细胞分离的方法，其特征在于包括如下步骤a.准备有抗凝剂的注射器，从羊颈静脉中采取外周血；b.用等体积的Hank’s液稀释外周血，后混匀；c.将人淋巴细胞分离液以0.6-1.0mL/管的量分别置于容器中；d.吸取稀释血液1-3mL，沿管壁缓缓的叠加到界面上，将容器放入离心机；e.使容器在离心力作用下，其内部的溶液形成不同层次的区带，使得容器中由下至上分别为红细胞层、分离液层、淋巴细胞层、血浆层；f.吸取淋巴细胞层。本发明的方法能够得到良好的分离效果，利于淋巴细胞的收集，同时，分离出来的淋巴细胞具有较高的存活率。
文档编号C12N5/0783GK102154204SQ20111002572
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者刘书东, 左文斌, 李剑, 李莲瑞, 潘辉, 贺艳艳 申请人:塔里木大学