专利名称：南瓜耐旱基因CmNAGS及其抗除草剂植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及南瓜耐旱基因CmNAGS及其抗除草剂植物表达载体。
背景技术：
随着全球水资源危机及环境的恶化，农作物经常遭受到干旱胁迫的危害。目前， 全球约有43%的耕地处于干旱、半干旱地区，由此造成的减产超过所有自然灾害的总和。 我国约有48%的土地处于干旱、半干旱地带，其中没有灌溉条件的旱地约占总耕地面积的 51.9%。干旱是限制我国农业生产的重要因素之一。植物遭受干旱胁迫后，脱水萎蔫，引起一系列生理生化代谢紊乱，如果持续过久，导致植物死亡。转基因技术是解决干旱危害的有效途径之一，克隆耐旱相关基因并转化作物，使其在作物中过量表达，将会大幅提高作物的耐旱能力。N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthase, NAGS)是生物体内L-精氨酸生物合成途径的关键酶，催化该途径的第一步反应，其主要功能是将谷氨酸乙酰化为 N-乙酉先谷氨酸(参考文献Slocum R D. Genes, enzymes and regulation of a rginine biosynthesis in plants. PlantPhysiology and Biochemistry· 2005，43 :729-745)。精氨酸是植物中一种重要的氮素储藏氨基酸，也是多胺合成的前体，多胺可缓解干旱条件下叶绿素损失(参考文献Capell TiEscobar CiLiu H. Overexpression of the oat a rginine decarboxylase cDNA in transgenic rice affects normaldevelopment patterns in vitro and result in putrescine accumulation in transgenic plants. Theoretical md Applied Genetics. 1998,97 :246-2 )，该途径的中间产物瓜氨酸在干旱条件下是一种新型高效的羟自由基清除剂，在抗旱性良好的野生西瓜中含量较高(参考文献:Akashi K，Miyake C，Yokota A. Citrulline, a novel compatible solute in d rought-tolerant wild watermeIonleaves, is an efficient hyd roxyl radical scavenger. Federation of European Biochemical SocietiesLetters. 2001，508 :438-442)，另一个中间产物鸟氨酸参与脯氨酸的生物合成(参考文献Delauney A JiVerma D P S. Proline biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant Journal. 1993,4(2) :215-223)。Kalamaki 等首次从番茄中分离出S/NAGS1基因，将该基因连接到CaMV35S启动子后转化拟南芥，干旱胁迫下，转基因拟南芥中鸟氨酸、瓜氨酸含量明显提高，萎蔫时间迟于对照组，复水后可恢复健康生长状态，表现出较好的耐旱性，而对照组植株死亡(参考文献Kalamaki M S， Alexandrou D， Lazari D， Merkouropoulos G， Fotopoulos V， Pateraki I， Aggelis A，Carrillo-Lo ‘ pez A，Rubio-Cabetas M D，Kanellis A K. Over-expression of a tomatoN-acetyl-L-glutamate synthase gene (S/NAGS1)in Arabidopsis thaliana results in high ornithinelevels and increased tolerance in salt and d rought stresses. Journal of Experimental Botany· 2009，8 :1_13)。bar 基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinithricin acetlyltransferase，PAT)，对抗草丁膦有很高的专一性。将除草剂抗性基因导入作物，便有可能获得抗除草剂的作物品种。目前，对除草剂草丁膦的抗性bar基因已经导入水稻(参考文献Toki S， Takamatsu S,Nojiri C,Ooba S,AnzaiH,lwata M,Christensen A H,Quail P H,Uchimiya H.Expression of a maize ubiquitin genepromoter-bar chimeric gene in transgenic rice plants. Plant Physiology. 1992，100 :1503-1507)、玉米(参考文献Palmer K Ε, Thomson J A, Rybicki E P.Generation of maize cell lines containingautonomosly replicating maize streak virus-based gene vectors. Archives of Virology. 1999, 144 :1345-1360)、番茄(参考文献Knapp S, Larondelle Y，Ros β berg Μ, Fu rtek D, Theres K. Transgenictomato lines containing Ds elements at defined genomic positions as tools for ta rgeted transposontagging. Molecular and General Genetics. 1994,243 :666-673)等作物。
发明内容
本发明的目的是为提高农作物耐旱性提供一个新的南瓜耐旱基因CmNAGS。本发明的另一目的是提供该耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制耐旱和抗除草剂新种质，可用于农作物品种改良。本发明的技术问题可通过如下技术方案解决南瓜耐旱基因CmNAGS(N-乙酰谷氨酸合成酶基因CmNAGS)，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体，由本发明所述的南瓜耐旱基因 CmNAGS与植物表达载体构成。其中，所述的植物表达载体通过分别用EcoR I/Hind III双酶切植物表达载体 PCAMBIA3301和全序列合成的T800 DNA片段，回收lU89bp的pCAMBIA3301大片段和849bp 的T800 DNA小片段，连接所述两个片段得到的中间载体pCAMBIA3301-T800。所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体构建方法如下1)南瓜耐旱基因CmNAGS的克隆以提取的南瓜幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA ；以所述的反转录的 cDNA为模板，设计上游引物YWNMBs2 :SEQ ID NO. 5，下游引物YWNM&i2 :SEQ ID NO. 6，用高保真酶PCR扩增上游和下游分别引入Mc I和)(ba I酶切位点的CmNAGS基因，产物连接到 PMD19-T克隆载体，转化DH5ci感受态细胞，进行序列测定，得到序列为SEQ ID N0. 7所示的上下游分别引入Me I和Xba I酶切位点的CmNAGS基因；2)中间载体 pCAMBIAMOl-TOOO 的改造全序列合成含有CaMV35S启动子、多克隆位点、Nos终止子的T800片段SEQ ID N0. 2，其中，启动子的上游和终止子的下游分别引入了 EcoR I和Hind III酶切位点；EcoR I和HindIII双酶切pCAMBIA3301 (含bar基因)和所述的T800片段，回收lU89bp的 PCAMBIA3301大片段(含bar基因)和849bp的T800DNA小片段，连接所述两个片段得到中间载体pCAMBIA3301-T800 (含bar基因)，产物转化DH5 α感受态细胞，提取质粒，进行酶切验证；
3)植物表达载体 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS 的构建分别用Me I和Xba I双酶切步骤1)得到的插入CmNAGS基因的pMD19_T和 PCAMBIA3301-T800 质粒，回收 CmNAGS 基因片段(1854bp)和质粒 pCAMBIA3301_T800 大片段 (12138bp)，连接所述两片段，连接产物转化DH5 α感受态细胞，提取质粒，进行酶切验证， 得到所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体pCAM BIA3301-T800_CmNAGS。有益效果1.本发明提供的南瓜耐旱基因CmNAGS是一个新的耐旱基因，该基因转化作物，可提高农作物的耐旱性。2.本发明将南瓜N-乙酰谷氨酸合成酶基因CmNAGS克隆至含有抗除草剂基因 (bar基因)的中间载体pCAMBIA3301-T800中，CmNAGS基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成参与精氨酸生物合成途径第一步反应的N-乙酰谷氨酸合成酶，使植物体内精氨酸及中间产物鸟氨酸和瓜氨酸含量提高，提高植物耐旱性。同时，bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinithricin acetlyltransferase, PAT)，可使转基因作物对抗以膦丝菌素(Phosphinothricin，PPT)为有效成分的Basta、Liberty等除草剂。3.本发明构建的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体为首次报道，可使转基因农作物具有抗除草剂和提高耐旱性双重特性，可直接用于农杆菌介导农作物遗传转化，创制耐旱和抗除草剂新种质，对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
图ICmNAGS琼脂糖凝胶电泳分析；1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)；2 : CmNAGS。图2中间载体pCAM BIA3301-T800质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳分析；1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)；2 :pCAM BIA3301_T800/EcoR I/Hind III ；3 :pCAM BIA3301-T800。图3植物表达载体pCAM BIA3301-T800-CmNAGS质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳分析；1:DNA Marker(2Kb/lKb/0. 75Kb/0. 5Kb/0. 25Kb/0. 1Kb)；2,3 :pCAMBIA3301-T800-CmNAGS/Sac I/Xba I。图 4 植物表达载体 pCAM BIA3301-T800-CmNAGS 图谱。
具体实施例方式实施例1. CmNAGS的克隆选用耐旱性良好的杂种南瓜(Cucurbita maximaX C. moschata) ‘帝王新土佐，(为日本砧木品种，购自日本Tokita种苗株式会社)作为材料，幼苗期片真叶)干旱胁迫处理，取幼嫩叶片，参照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒说明书方法，提取叶片总RNA，按照东洋纺(上海)生物技术有限公司cDNA合成试剂盒ReverTra Ace-a- 说明取2 μ g总RNA 反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照番茄耐旱基因CmNAGS序列信息(NCBI登录号FJ543466)，经01igo6. 0软件分析设计引物扩增CmNAGS ；上游引物YWNs:SEQ ID NO. 3，下游引物YWNa SEQ ID NO. 4，以提取的叶片cDNA 为模板，进行PCR反应50μ L反应体系10XPCR Buffer 5. 0 μ L，YWNs、YWNa引物各 1· 0 μ L(20 μ mol · L-1)，dNTP mix 4. 0 μ L(2. 5mmol · L-1)，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L，ddH20 37. 8 μ L ；反应程序95°C 预变性 4min，然后 94°C 解链 30sec,54. 6 °C 退火30seC，72°C延伸2min，反应30个循环，72°C延伸IOmin ；PCR产物用凝胶回收试剂盒 (AXYGEN)回收纯化后琼脂糖凝胶电泳分析(图谱见图1)，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到 PMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5 α感受态细胞(南京天为生物技术有限公司)，进行序列测定，序列为SEQ ID NO. 1。实施例2.植物双价表达载体pCAMBIA3301-T800-CmNAGS的构建1)中间载体 pCAMBIAMOl-TOOO 的改造全序列合成含有CaMV35S启动子、多克隆位点、Nos终止子的T800片段(见SEQ ID N0. 2)，在两端分别引入EcoR I和Hind III酶切位点(北京鼎国昌盛生物科技有限公司)； 取质粒载体pCAMBIA3301 (澳大利亚国际农业分子生物学应用中心)和T800片段各15μ L， 分别用 EcoRI (Promega)和 Hind 111 (Promega)双酶切，50 μ L 酶切体系10 X Buffer E 5 μ L,BSA 0. 5yL，质粒 pCAMBIA3301 或 Τ800 15 μ L,EcoR I 1· 25 μ L，Hind III 1. 25 μ L, ddH20 27 μ L ；37°C酶切反应3h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒 (AXYGEN)回收质粒 pCAMBIA3301 大片段(11289bp)和 T800 小片段(849bp)，按照 1 4 的比例用 T4DNA 酶(TaKafci)连接，连接反应体系 Q5yL):10XT4 ligase Buffer 2. 5 μ L, PCAMBIA3301 大片段 2μ L，T800 小片段 8 μ L，T4DNA 连接酶 1 μ L，ddH20 11. 5μ L ；16°C 过夜反应，取10 μ L连接产物转化DH5 α感受态细胞，涂板37°C过夜培养；挑取单克隆扩大培养后，提取质粒，进行酶切验证(图谱见图2、；pCAM BIA3301-T800中间载体改造完成；2.)植物表达载体 PCAMBIA33Ol-T8OO-CmNAGS 的构建①以南瓜叶片cDNA作为模板，用高保真酶(I^rimeSTAR HS DNA Polymerase, TaKaRa)进行 PCR 反应，50 μ L 反应体系10 X PCR Buffer 5. O μ L, YWNMBs2 (SEQ ID NO. 5), YWNMSa2 (SEQ ID NO. 6)弓 | 物各 1. O μ L (20 μ mol · L-1)，dNTP mix4. O μ L (2. 5mmol · L-1)， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 4μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 6 μ L ；反应程序95°C 预变性^iin,然后98°C解链lOsec，54. 6°C退火15sec，68°C延伸2min，反应30个循环，72°C 延伸lOmin。PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收，连接到pMD19_T克隆载体，转化 DH5a感受态细胞，进行序列测定，序列为SEQ ID N0. 7 ；②取改造好的质粒载体pCAMBIA3301-T800 15 μ L和第①步所得到的插入CmNAGS 基因的 PMD19-T 用 Sac I (Promega)和 Xba I (Promega)双酶切，双酶切体系(50 μ L) IOXBuffer E 5 μ L, BSA 0. 5 μ L，质粒 pCAMBIA3301_T800 或插入 CmNAGS 基因的 pMD19_T 载体 15 μ L，Sac I 1. 25 μ L，Xba I 1. 25 μ L, ddH20 28. 25 μ L ;37°C反应 3h ；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA3301-T800大片段 (12138bp)和 CmNAGS 小片段(1854bp)；③回收的质粒pCAMBIA3301-T800 大片段(12138bp)和 CmNAGS 小片段(1854bp)， 按照1 4的比例，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接，连接反应体系(25 μ L) :10 X T4 ligase Buffer 2. 5 μ L，pCAMBIA3301-T800 大片段 2 μ L, CmNAGS 小片段 8 μ L, T4DNA 连接酶 1 μ L,ddH20 11.5111^;161过夜连接反应，取1(^1^连接产物转化0!15(1感受态细胞。37°C过夜培养，挑取单克隆扩大培养，提取质粒，进行酶切验证(图谱见图幻。植物表达载体 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS(图谱见图4)的构建成功。 综上所述，本发明构建了含有耐旱基因和抗除草剂基因的植物表达载体 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS，其中CmNAGS首次报道。所构建的载体可导入大豆及其他作物中，提高作物的耐旱性。
权利要求
1.南瓜耐旱基因CmNAGS，其特征在于该基因的序列为SEQID NO. 1。
2.南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的南瓜耐旱基因CmNAGS与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体，其特征在于所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体是将南瓜耐旱基因CmNAGS经Mc I和 Xba I双酶切后插入到中间载体pCAMBIA3301-T800的Sac I和Xba I位点得到。
4.权利要求3所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)南瓜耐旱基因CmNAGS的克隆以提取的南瓜幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA ；以所述的反转录的cDNA为模板，设计上游引物YWNMBs2 :SEQ ID NO. 5，下游引物YWNM&i2 :SEQ ID NO. 6，用高保真酶 PCR扩增得到上、下游分别引入Me I和)(ba I酶切位点的CmNAGS基因，所述的PCR产物 CmNAGS基因连接到pMD19-T克隆载体，转化DH5 α感受态细胞，进行序列测定；2)中间载体pCAMBIA3301-T800的改造全序列合成含有CaMV35S启动子、多克隆位点、Nos终止子的T800片段SEQ ID NO. 2， 其中，CaMV35S启动子的上游和Nos终止子的下游分别引入了 EcoR I和Hind III酶切位点； EcoR I 和 Hind III 双酶切 pCAMBIA3301 和所述的 T800 片段，回收 lU89bp 的 pCAMBIA3301 大片段和849bp的T800DNA小片段，连接所述两个片段得到中间载体pCAMBIA3301-T800，产物转化DH5 α感受态细胞，提取质粒，进行酶切验证；3)植物表达载体pCAMBIA3301-T800-CmNAGS的构建分别用Mc I和Xba I双酶切步骤1)得到的插入CmNAGS基因的pMD19_T 和pCAMBIA3301-T800质粒，回收1854bp的CmNAGS基因片段和12138bp的质粒 PCAMBIA3301-T800大片段，连接所述两片段，连接产物转化DH5 α感受态细胞，提取质粒，进行酶切验证，得到所述的南瓜耐旱基因CmNAGS抗除草剂植物表达载体 pCAMBIA3301-T800-CmNAGS。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了南瓜耐旱基因CmNAGS及其抗除草剂植物表达载体。本发明所提供的南瓜耐旱基因CmNAGS序列为SEQ ID NO.1。其抗除草剂植物表达载体由所述的南瓜耐旱基因CmNAGS插入到中间载体pCAMBIA3301-T800的Sac I和Xba I位点得到。本发明含CmNAGS基因的植物表达载体可用于农作物遗传转化，CmNAGS基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，合成催化精氨酸生物合成途径第一步反应的N-乙酰谷氨酸合成酶，可使植物体内精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸含量提高，增强植物耐旱性。同时，bar基因编码膦丝菌素乙酰转移酶，可使转基因作物对抗以膦丝菌素为有效成分的Basta、Liberty等除草剂。
文档编号C12N15/82GK102154331SQ201110025649
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者张功臣, 朱月林, 杨立飞, 盖钧镒, 闫闻 申请人:南京农业大学