专利名称：芽孢杆菌gzt及其在降解溴代阻燃剂三溴苯酚中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌GZT及其在环保领域特别是生物降解溴代阻燃剂(BFR) 2,4,6-三溴苯酚中的应用。
背景技术：
随着近年来电子信息工业的迅速发展，溴代阻燃剂(BFR)被广泛应用于生活和工业生产，而其亲脂性、环境稳定性、难降解性和生物放大作用等特性使之成为被关注的具有潜在健康危害的一类有机污染物。2，4，6_三溴苯酚(2，4，6-TBP)作为一种BFR的中间产物被广泛应用在电子制造等领域，2001年的全球产量已达9500吨/年。据报道，TBP是一种具有急性毒性的溴代酚类化合物，在1998年已被美国环保局(EPA，USA)列为危险废物 (hazardous wastes)。Boyle等从河口沉积物中筛选出一株厌氧脱硫弧菌(Desulfovibrio sp.)在以乳酸盐为电子供体的条件下可将TBP还原脱溴。Takashi等筛选出一株苍白杆菌 (Ochrobactrum sp.)TB01用于TBP的降解，发现该生物降解是先还原脱溴再氧化的过程。 Ronen等利用一株营养缺陷型皮氏无色杆菌(AchromcAacterpiechaudii)TBPZ降解土壤中的TBP，发现营养源酵母浸出物对不同生长阶段的细胞生长和活性有显著影响。但是目前为止，利用芽孢杆菌降解2，4，6-TBP的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种芽孢杆菌GZT。本发明的另一目的在于提供所述芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，特别是在生物降解2，4，6-三溴苯酚中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZT，于 2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M20103460所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZT具有如下的形态和生理生化特性A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，为革兰氏阳性杆状细菌，菌体(1. 58 1. 48) μ mX (4. 96 1. 58) μ m,无鞭毛；B、主要的生理生化特征专性好氧，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。所述芽孢杆菌GZT的16S rDNA序列如SEQ ID =No. 3所示。 所述芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，特别优选所述芽孢杆菌GZT应用于生物降解2，4，6-三溴苯酚； 所述芽孢杆菌GZT应用于生物降解2，4，6_三溴苯酚优选包含以下步骤将含有 2,4,6-三溴苯酚的物质的pH值调为6. 5 8. 5，然后将OD600值为0. 7 0. 9 (对数增长期) 的芽孢杆菌GZT按体积百分比10 30%的接种量添加，于20 40°C进行反应；
所述含有2，4，6-三溴苯酚的物质中2，4，6-三溴苯酚的浓度优选为2 10mg/L ；所述的反应优选为振荡反应条件，振荡速度优选为100 200rpm ；所述反应的时间优选为96 148h。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明首次从广东省贵屿地区土壤中筛选到具有降解2，4，6_三溴苯酚的芽孢杆菌GZT。(2)本发明的芽孢杆菌GZT降解2，4，6_三溴苯酚的能力强，降解率可达96. 2%， 脱溴率可达88. 4 %，矿化率可达29. O %。
图1是本发明的芽孢杆菌GZT在透射电镜下的形态图(X 10000)。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1本发明所述的具有降解2，4，6_三溴苯酚能力的芽孢杆菌GZT从广东省贵屿镇电子垃圾高风险区的淤泥中进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下所用的驯化培养基为无机盐培养基(g/L) (K2HPO4 4. 35，KH2PO4 1. 7，NH4NO3 2. 1，MgSO4 0. 2，MnSO4 0. 05， FeSO4 · 7H20 0. 01，CaCl2 · 2H20 0. 03，ρΗ7· 0)。首先将 3g 污泥加入 IOOml 含 2，4，6-三溴苯酚10mg/L的无机盐培养基，37°C驯化60天后，以体积百分比10 %接种量移入含2，4， 6-三溴苯酚15mg/L的无机盐培养基接着驯化一周，以此类推逐步提高2，4，6_三溴苯酚的浓度进行驯化，？^力-三溴苯酚的使用浓度分别为〗。!^/!、〗。!^/^。!^/!。驯化结束后将驯化液涂布于琼脂平板(牛肉膏3. Og/L，蛋白胨10. Og/L, NaCl 5. Og/L,琼脂粉20. 0g/L, pH7. 4 7. 6)上37°C培养48h，挑选单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3. 0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7. 4 7. 6)进行富集培养，进行降解率的测定，选择降解率最高的菌种进行纯化。降解率的测定在2，4，6_三溴苯酚生物降解的过程中定时取样通过高效液相色谱法测定降解率。降解率=(初始浓度_终浓度)/初始浓度。高效液相色谱法用以测定2，4，6-三溴苯酚的浓度液相色谱条件为80% ν/ν甲醇、18% ν/ν水、2% ν/ν乙酸，流速为lml/min，2，4，6-三溴苯酚的检测波长为280nm。通过气相色谱法来测定矿化产物CO2的生成量以测定BPA的矿化率。将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下(1)菌体的形态特性A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，为革兰氏阳性杆状细菌，菌体(1. 58 1. 48) μ mX (4. 96 1. 58) μ m,无鞭毛；B、主要的生理生化特征专性好氧，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。(2)采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16S rDNA通用引物[上游引物 F27 (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，下游引物 Rl522 (5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，) ]扩增其16S rDNA基因。 PCR 扩增体系总体积为 50 μ L 超纯水 37. 5 μ L, 10XPCR Buffer 5 μ L，2. 5mmol/ L dNTP 4口1^，1(^11101/1上游引物？271口1^，1(^11101/1下游引物1 1522 1 μ L, 5U/ μ L Taq DNA Polymerase 0.5 μ L0另用超纯水代替模板DNA进行空白试验。PCR反应30个循环， 94. 0°C变性4min后进入循环94°C变性60s，55°C退火60s，72°C延伸1. 5min。30个循环后延伸IOmin0 PCR产物直接测序，结果如下(SEQ ID =No. 3)CATGGCGGGATGCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGC GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAA CATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTA GTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTC GTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCT TGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCC GGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGT CATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATG GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTT AACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGAT AGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTAC AAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCT ACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGAAGCCAGCCGCCTAAGGTGGAACAA ATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGAAGCCGTATCGAACGGTGCGGCTGACTCCCCCTCCTTAATACACGCTTGGT TCAGTGCGACTGTAGTTCTATCTGTAGAACCGCCATCTCTCGCACGTGTAACTGCCACATCGCTTGTAGCGATGATC TGCGTCTCTGTACGATGATGAGATTAGCAGTAG由以上得到的长为1641bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对后用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，可知该菌株与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)系统位置最接近。根据16S rRNA同源性分析可以判断该菌种为芽孢杆菌属(Bacillussp.)的一个变种。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，且为该属的一个变种，命名为芽孢杆菌(Bacillussp.) GZT，于2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2010346。实施例2 将芽孢杆菌GZT单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养15h的培养物(OD6tltl = 0. 8)以体积百分比10%的接种量接入含有ang/L 2，4，6-三溴苯酚的无机盐培养基中，其中无机盐的PH值为7. 5，在35°C 200rpm的摇床反应120h，定时取样通过高效液相色谱法测定降解率和脱溴率以及通过气相色谱法测定2，4，6-三溴苯酚矿化率。降解率的测定同实施例1 ；脱溴率的测定为测定溴离子浓度，采用溴酚红法利用分光光度计测定，脱溴率=生成溴离子浓度/底物溴浓度；2，4，6-三溴苯酚矿化率的检测如下通过矿化产物 CO2的生成量取样检测2，4，6-三溴苯酚矿化率，CO2生成量采用气相色谱法测定释放到空气中的浓度，由亨利定律计算出液体中的含量，两项加和后即为实际生成量，检测条件进样口温度180°C，检测器温度230°C，柱温150°C ；空气流速300ml/min，H2流速30ml/ min，N2流速:120ml/min。测得降解率为96. 2%，脱溴率为88. 4%，2，4，6-三溴苯酚的矿化率为29. 0%。实施例3将芽孢杆菌GZT单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养1 的培养物以体积百分比30 %的接种量接入含有:3mg/L 2,4,6-三溴苯酚的无机盐培养基中，其中无机盐的PH值为6. 5，在20°C 200rpm的摇床反应96h，定时取样测定降解率、脱溴率、矿化率，测定方法同上。测得降解率为93. 4%，脱溴率为87. 9%，2，4，6-三溴苯酚的矿化率为22. 2%。实施例4将芽孢杆菌GZT单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养1 的培养物以体积百分比20 %的接种量接入含有:3mg/L 2,4,6-三溴苯酚的无机盐培养基中，其中无机盐的PH值为8. 5，在40°C 200rpm的摇床反应148h，定时取样测定降解率、脱溴率、矿化率，测定方法同上。测得降解率为92. 1 %，脱溴率为85. 8%，2，4，6-三溴苯酚的矿化率为20. 8%。实施例5将芽孢杆菌GZT单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养1 的培养物以体积百分比15%的接种量接入含有10mg/L 2，4，6-三溴苯酚的无机盐培养基中，其中无机盐的PH值为7. 5，在40°C 150rpm的摇床反应100h，定时取样测定降解率、脱溴率、矿化率，测定方法同上。测得降解率为65. 3%，脱溴率为60. 5%，2，4，6-三溴苯酚的矿化率为15. 3%。实施例6将芽孢杆菌GZT单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养1 的培养物以体积百分比10%的接种量接入含有5mg/L 2，4，6-三溴苯酚的无机盐培养基中，其中无机盐的PH值为7. 5，在40°C IOOrpm的摇床反应148h，定时取样测定降解率、脱溴率、矿化率，测定方法同上。测得降解率为90. 8%，脱溴率为84. 2%，2，4，6-三溴苯酚的矿化率为19. 4%。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZT，于2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010346。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用。
3.根据权利要求2所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，其特征在于所述芽孢杆菌GZT应用于生物降解2，4，6-三溴苯酚。
4.根据权利要求3所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，其特征在于包含以下步骤将含有2，4，6-三溴苯酚的物质的pH值调为6. 5 8. 5，然后将OD6tltl值为0. 7 0. 9的芽孢杆菌GZT按体积百分比10 30%的接种量添加，于20 40°C进行反应。
5.根据权利要求4所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，其特征在于所述含有 2，4，6-三溴苯酚的物质中2，4，6-三溴苯酚的浓度为2 10mg/L。
6.根据权利要求4所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，其特征在于所述的反应为振荡反应。
7.根据权利要求6所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，其特征在于所述的振荡反应的振荡速度为100 200rpm。
8.根据权利要求4所述的芽孢杆菌GZT在环保领域中的应用，其特征在于的时间为 96 1她。
全文摘要
本发明公开了一种芽孢杆菌GZT及其在环保领域特别是生物降解2，4，6-三溴苯酚中的应用。本发明所述的芽孢杆菌GZT是从电子垃圾高风险区的淤泥中进行分离、纯化而得，于2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2010346。该芽孢杆菌GZT降解2，4，6-三溴苯酚的能力强，降解率可达96.2％，脱溴率可达88.4％，矿化率可达29.0％，可将其应用于环保领域中，用于对2，4，6-三溴苯酚进行降解。
文档编号C12N1/20GK102154174SQ20111002551
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者安太成, 李桂英, 祖蕾 申请人:中国科学院广州地球化学研究所