专利名称：：一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法
技术领域：
：本发明属于对甲状腺激素1\干扰活性的检测领域，特别涉及一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法。
背景技术：
：溴系阻燃剂目前被认为是普遍存在的持久性有机污染物，在它的生产、使用和废物处置阶段都会不同程度地释放到环境中。溴系阻燃剂主要可分为多溴联苯醚(PBDEs)，多溴联苯(PBBs)，四溴双酚A(TBBPA)和六溴环十二烷(HBCD)等四大类。溴系阻燃剂的阻燃效率高，热稳定性好，添加量少，对材料性能影响小，价格便宜，因而作为一种添加型阻燃剂被广泛地应用于家用电器、室内装璜中的泡沫塑料、地毯和布料之中；同时，含溴系阻燃剂的塑料也大量用于与电源、电路、发热体等密切相关的电子电器设备，轿车、公共汽车、火车和飞机等，与人们的生活息息相关。溴系阻燃剂及其代谢产物与甲状腺激素转运蛋白有很高的结合活性，表明溴系阻燃剂可能会与体内的L甲状腺激素竞争结合转运蛋白，通过干扰甲状腺激素的转运过程，干扰体内甲状腺激素的动态平衡。它对甲状腺激素的干扰体现在多个方面，比如直接损伤甲状腺，造成甲状腺肥大；改变甲状腺激素水平，加速甲状腺激素清除；或者与甲状腺激素竞争结合转运蛋白等等。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，该方法步骤简单，快速，高效率且灵敏性高，该方法在很低浓度的条件下也能测试化合物的TTR结合活性，并得到了各化学品较理想的抑制曲线。本发明的一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，包括(1)加样样品组在反应管中依次加入0.1MTris-HCl缓冲液140145uL、30nM转运蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL、15uL浓度为8X10—5mol/L8X10—6mol/L的竞争剂，以及09uL的二甲亚砜或二氯甲烷使竞争结合反应液最终体积为200uL;对照组在反应管中依次加入0.1MTris-HCl缓冲液140145uL、30nM转运蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL以及510uL的二甲亚砜或二氯甲烷，使反应液最终体积为200uL;(2)孵育将上述两组反应液分别在fC下孵育1224h，以达到竞争结合平衡；(3)分离孵育结束后，除去未与转运蛋白TTR结合的游离125I_T4;(4)测量用Y计数仪测量收集到的离心液体放射性，单位为cpm(每分钟放射性计数)；(5)计算由每管每分钟放射性计数cpm，求出样品组与对照组每分钟放射性计数cpm的比值，即为125I-T4和待测化合物与转运蛋白TTR孵育竞争结合的能力。所述步骤(1)中的0.1MTris-HCl缓冲液的组分浓度为0.1MTris-HC1，0.1MNaCl和0.ImMEDTA，pH=8.0;具体配制步骤如下称量12.llgTris，5.856gNaCI和0.0370gEDTA，加入780800mL的去离子水，充分搅拌溶解，再加入34ml浓盐酸调节pH值至8.O，定容至1L;所述步骤(1)中的竞争剂为含溴阻燃剂类污染物，具体为四溴双酚A(TBBPA)、六溴环十二烷HBCD、2，2'，4，4'_四溴联苯醚(BDE-47)或环境样本萃取液，环境样本萃取液利用PUF大气被动采样装置采集室内空气，以二氯甲烷为萃取剂用索氏抽提法抽提48小时得到。所述步骤(3)中的分离是指用0.1MTris-HCl缓冲液预先平衡lml的S印hadexG25葡聚糖凝胶离心柱，以3000rpm离心2min，弃离心出的液体；取100uL竞争结合反应液加到S印hadexG25葡聚糖凝胶离心柱上，再3000rpm离心2min，并收集离心出的液体。本发明通过单浓度实验确定化学品的竞争结合浓度梯度每管加入浓度为8X10—5mol/L的5uL抑制剂，同时准备两个对照组，一组无竞争剂，一组无TTR，其它溶液组成不变。检测无竞争剂，有竞争剂和无TTR时的甲状腺激素(T4)与甲状腺运载蛋白(TTR)的结合率，再根据结合率来判断该浓度下各化学品有无抑制性，有无跟TTR结合。如果该浓度下化学品能抑制T4与TTR的竞争结合，根据该浓度由高浓度到低浓度确定化学品的浓度梯度为8X10—5mol/L8X10—6mol/L。有益效果本发明的TTR结合活性测试方法步骤简单，快速，高效率而且灵敏性很高，该方法在很低浓度的条件下(8X10—5mol/L8X10—6mol/L)也能测试化合物的TTR结合活性，并得到了各化学品较理想的抑制曲线。图1是TBBPA的TTR抑制曲线；图2是BDE-47的TTR抑制曲线；图3是HBCD的TTR抑制曲线;图4是环境样本萃取液的TTR抑制曲线。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例(1)0.1MTris-HCl缓冲液的配制称量12.llgTris，5.856gNaCl和0.0370gEDTA，加入780800mL的去离子水，充分搅拌溶解，再加入34ml浓盐酸调节pH值至8.O，定容至1L;(2)加样样品组在反应管中依次加入0.1MTris-HCl缓冲液140145uL、30nM转运蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL、l5uL浓度为8X10—5mol/L8X10—6mol/L的竞争剂(TBBPA、HBCD、BDE-47或环境样本萃取液)以及09uL的二甲亚砜或二氯甲烷使竞争结合反应液最终体积为200uL;对照组在反应管中依次加入0.1MTris-HCl缓冲液140145uL、30nM转运蛋白TTR25uL、55nM125I-T44550uL以及510uL的二甲亚砜或二氯甲烷，使反应液最终体积为200uL;(3)孵育将上述两组反应液在fC下孵育1224h，以达到竞争结合平衡；(4)分离:孵育结束后，用0.1MTris-HCl缓冲液预先平衡lml的S印hadexG25葡聚糖凝胶离心柱，以3000rpm离心2min，弃离心出的液体；取100uL竞争结合反应液加到S印hadexG25葡聚糖凝胶离心柱上，再3000rpm离心2min，并收集离心出的液体，以除去未与转运蛋白TTR结合的游离125I_T4;(5)测量用Y计数仪测量收集到的离心液体放射性，单位为cpm(每分钟放射性计数)；(6)计算由每管每分钟放射性计数cpm，求出125I_T4和待测化合物与转运蛋白TTR孵育竞争结合的能力。以上具体加样和操作程序见下表1:No.加样或操作总放管零结合管非特异管竞争管TBoNB(uL)(uL)(uL)(uL)1缓冲液/1431451432竞争剂///3DMSO/5/4125I-T450505050TTR蛋白/2ug/2uL/2ug/2uL6温育4'C放置过夜7离心3000rpm，4。C离心2min8测量测量洗出放射性计数(cpm)9计算求出B与Bo每分钟放射性计数cpm的比值实施例1TBBPA化合物TTR结合活性分析表2:TBBPA化合物的抑制率(B/Bo表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通过表2的实验数据得到了TBBPA的TTR抑制曲线(图1)。当竞争结合反应液中没有添加TBBPA(无抑制剂即竞争剂)时T4与TTR的结合率为100%，无干扰。当竞争结合反应液中加了不同浓度的TBBPA(加抑制剂)后，随着反应液中TBBPA浓度的增加，T4与TTR的竞争结合率不断降低。当TBBPA的浓度增加到了最高浓度8X10—5时，TBBPA会显著地抑制T4与TTR的结合，这时T4与TTR的竞争结合率为14.17%。在浓度为8X10—5mol/L8X10—6mol/L时，T4与TTR的结合率在14.17%85.64%。这说明随着TBBPA浓度的增加，它的抑制性越强，跟TTR的竞争结合能力越高，通过TTR的甲状腺激素干扰活性也越实施例2PBDE化合物TTR结合活性分析表3:PBDE化合物的抑制率(B/Bo表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通过表3的实验数据得到了BDE-47的TTR抑制曲线(图2)。当竞争结合反应液中没有添加BDE-47(无抑制剂)时T4与TTR的结合率为100%，无干扰。当竞争结合反应液中加了不同浓度的BDE-47(加抑制剂)后，随着反应液中BDE-47浓度的增加，T4与TTR的竞争结合率不断降低。当BDE-47的浓度增加到了最高浓度8X10—5mol/L时，1\与TTR的竞争结合率为64.42%。在BDE-47浓度为8X10—5mol/L8X10—6mol/L时，丁4与TTR的结合率在64.42%91.29%。这说明随着TBBPA浓度的增加，它的抑制性越强，跟TTR的竞争结合越多，通过TTR的甲状腺激素干扰活性也越高。实施例3HBCD化合物TTR结合活性分析表4:HBCD化合物的抑制率(B/Bo表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通过表4的实验数据得到了HBCD的TTR抑制曲线(图3)。当竞争结合反应液中没有添加HBCD(无抑制剂)时T4与TTR的结合率为100%，无干扰。当竞争结合反应液中加了不同浓度的HBCD(加抑制剂)后，随着反应液中HBCD浓度的增加，T4与TTR的竞争结合率不断降低。当HBCD的浓度增加到了最高浓度8X10—5时，T4与TTR的竞争结合率为73.14%。在HBCD浓度为8X10—5mol/L8X10—6mol/L时，T4与TTR的结合率在73.14%94.91%。这说明随着TBBPA浓度的增加，它的抑制性越强，跟TTR的竞争结合越多，通过TTR的甲状腺激素干扰活性也越高。实施例4环境样本萃取液TTR结合活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通过表5的实验数据得到了环境样本萃取液的TTR抑制曲线(图4)。当竞争结合反应液中没有添加萃取液时T4与TTR的结合率为100%，无干扰。当竞争结合反应液中加了不同量的萃取液后，随着反应液中萃取液的量的增加，T4与TTR的竞争结合率不断降低。当萃取液的量增加到了4uL时，T4与TTR的竞争结合率甚至下降到20%左右，抑制效果非常明显。这说明随着环境样本萃取液浓度的增加，它的抑制性越强，跟TTR的竞争结合越多，通过TTR的甲状腺激素干扰活性也越高。权利要求一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，包括(1)加样样品组在反应管中依次加入0.1MTris-HCl缓冲液140～145uL、30nM转运蛋白TTR2～5uL、55nM125I-T445～50uL、1～5uL浓度为8×10-5mol/L～8×10-6mol/L的竞争剂，以及0～9uL的二甲亚砜或二氯甲烷使竞争结合反应液最终体积为200uL；对照组在反应管中依次加入0.1MTris-HCl缓冲液140～145uL、30nM转运蛋白TTR2～5uL、55nM125I-T445～50uL以及5～10uL的二甲亚砜或二氯甲烷，使反应液最终体积为200uL；(2)孵育将上述两组反应液分别在4℃下孵育12～24h；(3)分离孵育结束后，除去未与转运蛋白TTR结合的游离125I-T4；(4)测量用γ计数仪测量收集到的离心液体放射性，单位为cpm；(5)计算由每管每分钟放射性计数，求出样品组与对照组每分钟放射性计数的比值，即为125I-T4和待测化合物与转运蛋白TTR孵育竞争结合的能力。2.根据权利要求1所述的一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，其特征在于所述步骤(1)中的0.1MTris-HCl缓冲液的组分浓度为1MTris-HCl，O.1MNaCl和0.ImMEDTA，pH=8.0。3.根据权利要求2所述的一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，其特征在于所述步骤的0.1MTris-HCl缓冲液具体配制步骤如下称量12.llgTris，5.856gNaCl和0.0370gEDTA，加入780800mL的去离子水，充分搅拌溶解，再加入34ml浓盐酸调节pH值至8.0，定容至1L。4.根据权利要求1所述的一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，其特征在于所述步骤(1)中的竞争剂为含溴阻燃剂类污染物，具体为四溴双酚A、六溴环十二烷、2，2'，4，4'_四溴联苯醚或环境样本萃取液。5.根据权利要求1所述的一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，其特征在于所述步骤(3)中的分离是指用0.1MTris-HCl缓冲液预先平衡1ml的S印hadexG25葡聚糖凝胶离心柱，以3000rpm离心2min，弃离心出的液体；取lOOuL竞争结合反应液加到S印hadexG25葡聚糖凝胶离心柱上，再3000rpm离心2min，并收集离心出的液体。全文摘要本发明涉及一种测定含溴阻燃剂类污染物的甲状腺干扰活性的方法，包括在反应管中依次加入Tris-HCl缓冲液、TTR、125I-T4以及竞争剂；同时另取一组反应管替换竞争剂为相应溶剂作为对照组；在4℃下孵育12～24h；孵育结束后，除去未与转运蛋白TTR结合的游离125I-T4；用γ计数仪测量收集到的离心液体放射性，由每管每分钟放射性计数cpm，求出125I-T4和待测化合物与转运蛋白TTR孵育竞争结合的能力。该方法步骤简单，快速，高效率且灵敏性高，该方法在很低浓度的条件下也能测试化合物的TTR结合活性，并得到了各化学品较理想的抑制曲线。文档编号G01N23/02GK101738404SQ200910198538公开日2010年6月16日申请日期2009年11月10日优先权日2009年11月10日发明者冀秀玲,刘洋申请人:东华大学