专利名称：溶藻弧菌选择性鉴别培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物选择性鉴别培养基，属于食品卫生微生物安全检测领域。
背景技术：
由于摄入不安全食物而引起的食源性疾病，在发达国家和发展中国家都是一个普 遍和日益严重的公共卫生问题。致病性弧菌是最重要的食源性病原菌之一，是污染水产品 的主要致病菌，特别是在炎热夏秋季节的沿海地区，是食物中毒的首要致病菌，并可引起水 产生物疾病，危害和损失都非常巨大。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)系革兰氏阴性弧菌，具有单鞭毛，有动力，广泛 分布于地面饮用水、海水和水产品中，且数量居海洋弧菌之首，在水产品中的污染比例比副 溶血性弧菌、霍乱弧菌高出近百倍，是重要的十二种致病性弧菌之一，可引起人类的腹泻、 中耳炎、外伤感染和水生生物的弧菌病，常引起鳃、石斑鱼、草虾、斑节虾、大黄鱼等经济鱼 类的严重弧菌病，使海水养殖业蒙受巨大的经济损失；还可以通过水产动物或水产品感染 人类，引发肠道传染病或食物中毒，引起中耳炎、外耳炎、结膜炎及败血症，也常引起人类外 伤化脓性感染、急性腹泻及食物中毒。溶藻弧菌引起的疾病近年在我国沿海比较常见，且有 扩大的趋势。作为最常被检出的致病菌，其危害已经引起各方面的重视，不少国家已经把溶 藻弧菌作为必检项目。因此，开展水产品中溶藻弧菌的污染情况调查，研究快速分离和检测 溶藻弧菌的方法，加强对溶藻弧菌引起疾病防治的研究具有重要意义。目前，溶藻弧菌的检测尚无标准方法，被认可的有传统的微生物学检测方法和快 速筛检方法。常用的选择性培养基主要有嗜盐菌选择性琼脂、硫代硫酸钠-柠檬酸钠-胆 盐-蔗糖琼脂培养基(TCBQ，但这些培养基都只能将嗜盐菌与非嗜盐菌分离开，或将弧菌 属与其它菌属细菌分离开并将弧菌属依其对蔗糖的利用能力分成两大类，都不能测定某一 种弧菌，更不能特异性的快速检测溶藻弧菌，且目前国内外尚无特定的快速检测溶藻弧菌 的专有培养基。溶藻弧菌的快速筛检方法有PCR、API 20E和VITEK等方法，这些方法各有 其优点，但这些方法所需的仪器和试剂耗材都比较昂贵，或有较高的技术要求，给检测部门 和企业的普及应用带来一定的困难。选择性鉴别培养基作为致病性微生物快速筛检技术的重要组成部分，具有低成 本、特异性强、灵敏度高、操作简便和易于直观辨别检测结果等优点，被广泛应用于各级检 验检疫机构和企业，目前国内外已有较多商品化的选择性鉴别培养基，如副溶血性弧菌、大 肠杆菌0157H7、沙门氏菌等多种专用选择性鉴别培养基被广泛应用于致病微生物的快速筛 检，但尚无专门用于溶藻弧菌快速筛检的选择性鉴别培养基，因此急需对其进行研究和开 发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种可对溶藻弧菌进 行快速检测的专用选择性鉴别培养基。
溶藻弧菌选择性鉴别培养基(Vibrioalginolyticus Distinguish Medium, VaDM)，其特征在于所述培养基的配方为亮氨酸10 20g，酵母浸出粉1 5g，氯化钠5 10g，硫代硫酸钠8. 5 llg，胆酸钠1 5g，牛胆粉2 7g，柠檬酸铁1 3g，氯化钙1 3g，琼脂12 20g，溴麝香草酚兰0. 04g,麝香草酚兰0. 04g,蒸馏水1000mL。进一步地，所述培养基的配方为亮氨酸15g，酵母浸出粉3g，氯化钠10g，硫代硫 酸钠10g，胆酸钠3g，牛胆粉5g，柠檬酸铁lg，氯化钙lg，琼脂20g，溴麝香草酚蓝0. 04g,麝 香草酚蓝0. 04g,蒸馏水1000mL。所述培养基的pH值优选为7. 6 9. 0，最优为8. 0 士 0. 2。本发明的选择性鉴别培养基可用以下方法配制按上述培养基组成称取各组份， 亮氨酸溶解于IOOmL蒸馏水中，滤菌膜过滤除菌；酵母膏粉、氯化钠、胆酸钠、牛胆粉、硫代 硫酸钠、氯化钙、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、蒸馏水900mL，琼脂20g，分装三角瓶，121°C 下灭菌20min，冷却至60 70°C，加入除菌的亮氨酸溶液，lmol/L NaOH灭菌溶液调至 PH8. 0士0. 2，摇均，倾注灭菌平皿，待凝固后备用。检测时，取待检菌的新鲜纯培养物划线接种于平板上，对海产品中的溶藻弧菌进 行检测，36士 1°C培养16 18h，溶藻弧菌菌落在该培养基上呈光滑、凸起、直径1 3mm、边 缘整齐的黄色菌落。溶藻弧菌选择性鉴别培养基的设计是该研究的最关键环节和创新所在，决定其能 否更明显的区分与其他菌种，特别是对营养代谢相似且处于同一生态环境中的常伴菌。本 研究依据溶藻弧菌的基础营养需求、特殊生态环境、特殊生化反应即酶系统和代谢规律及 对特定抑菌物质的耐受性等方面的特点，设计了能够明显区别于其它细菌，特别是其它弧 菌和其它常见食品致病菌的溶藻弧菌鉴别培养基。①营养需求和特殊生态环境由于弧菌属微生物对营养要求不高，但有一定的嗜 盐性；因此溶藻弧菌选择性鉴别培养基的酵母膏粉、亮氨酸与NaCl已能满足其营养需求， 但通过添加适量的Ca2+能更好的促进弧菌的生长。②特殊生化反应即酶系统和代谢规律及其指示系统经过大量试验研究，发明人 发现溶藻弧菌能分解利用亮氨酸，在此培养基中产生的代谢产物与指示剂作用，菌落呈黄 色；而其它弧菌不具有此酶系统，在此培养基上这些菌的菌落表现为不生长或者菌落呈绿 色；若一些其它杂菌在溶藻弧菌选择性鉴别培养基上生长，则可以利用柠檬酸铁指示硫化 氢的产生，使菌落中心呈黑色。③特定抑菌物质的耐受性胆酸钠、牛胆粉对革兰氏阳性菌有强大的抑制作用，对 革兰氏阴性菌仅有轻度的抑制作用，与枸橼酸钠和硫代硫酸钠合用时，对大肠杆菌群的生 长与菌体蛋白质的合成都有抑制作用；④其他因素=NaCl可促进行溶藻弧菌的生长，同时也起到了抑制非嗜盐菌的生 长；硫代硫酸钠和柠檬酸铁均为还原刘，可以使细菌所产兰的硫化氖避免氧化而使一些菌 株代谢产硫化氢气体与柠檬酸铁作用，使菌落中心呈黑色，从而排除这些杂菌；海水中的正 常PH值稳定在7. 9 8. 4左右，溶藻弧菌选择性鉴别培养基的pH在8. 0左右，这样既可以 促进行弧菌的生长又可以抑制其它菌的生长。本发明在大量筛选溶藻弧菌特异性生化反应、抵抗力的基础上，以亮氨酸为培养 基中唯一可利用碳源，添加适量的溶藻弧菌的生长因子Ca2+等以促进溶藻弧菌的生长；并根据溶藻弧菌嗜盐性和特殊培养条件，调整培养基的盐度和PH值；加入混合抑菌物质，保 障溶藻弧菌良好生长的同时可有效抑制其他杂菌的干扰；添加适量的混合指示剂，使溶 藻弧菌在培养基中生长后，呈现特征性的颜色；优化上述条件，相互结合，共同作用，合成 一种以筛选溶藻弧菌为唯一目标菌的选择性鉴别培养基——溶藻弧菌选择性鉴别培养基 (VaDM)。本发明通过筛选溶藻弧菌特异性酶及显色底物，利用溶藻弧菌对胆酸钠、牛胆粉 的抗性，以及对碳源利用能力的不同，开发溶藻弧菌专用的选择性鉴别培养基，可有效将溶 藻弧菌从拟态弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、辛辛那提弧菌、河流弧菌、梅氏弧 菌、弗尼斯弧菌、海鱼弧菌、鲨鱼弧菌、霍利斯弧菌中区分出来；溶藻弧菌选择性鉴别培养基 与常规方法TCBS分离培养基相比，溶藻弧菌选择性鉴别培养基比TCBS具有更高的检测效 率，溶藻弧菌选择性鉴别培养基检测溶藻弧菌省去了 TCBS分离培养后的生化试验，缩短检 测时间，降低检测成本，减少工作量，克服了传统培养基选择性差等缺点；从而方便快速地 对海产品中的溶藻弧菌进行检测，可直接用于对溶藻弧菌进行分离鉴定。
图1是溶藻弧菌在本发明培养基上的生长图。图2是创伤弧菌在本发明培养基上的生长图。图3是副溶血性弧菌在本发明培养基上的生长图。图4是梅氏弧菌在本发明培养基上的生长图。图5是鲨鱼弧菌在本发明培养基上的生长图。图6是辛辛那提弧菌在本发明培养基上的生长图。
具体实施例方式实施例1 溶藻弧菌选择性鉴别培养基特异性的验证1.溶藻弧菌选择性鉴别培养基的配制取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸馏水中，滤 菌膜过滤除菌；取酵母浸出粉3g，氯化钠10g，牛胆粉5g，胆酸钠3g，柠檬酸铁lg，硫代硫酸 钠10g，氯化钙lg，溴麝香草酚蓝0. 04g,麝香草酚蓝0. 04g,琼脂20g，蒸馏水900mL，分装三 角瓶，121 °C下灭菌20min，冷却至60 70°C，加入除菌的亮氨酸溶液，Imol/LNaOH灭菌溶液 调至pH 8.0士0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15°C培养箱中备用。2.接种溶藻弧菌、拟态弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、非01型霍乱弧菌、辛辛那 提弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、弗尼斯弧菌、海鱼弧菌、鲨鱼弧菌、霍利斯弧菌复苏采用碱性 蛋白胨水(APW)；埃希氏大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌0157、蜡样芽孢杆 菌、金黄色葡萄球菌复苏采用营养肉汤；当复苏他 他后，用接种环(直径3mm)挑取1 环，分别划线接种在溶藻弧菌选择性鉴别培养基平板上，36士 1°C培养1 Mh，观察各个 菌株在选择性鉴别培养基上的生长情况。3.结果及分析如图1所示，溶藻弧菌在显色平板上，出现黄色菌落；其它弧菌菌 落呈绿色或不生长。图2-图6分别为创伤弧菌、副溶血性弧菌、梅氏弧菌、鲨鱼弧菌、辛辛 那提弧菌在上述显色平板上的生长图。埃希氏大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、志贺氏菌、大肠 杆菌0157、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的显色平板上均无生长现象；说明选择性鉴别培养基对溶藻弧菌具有较好的选择性和特异性。实施例2 溶藻弧菌选择性鉴别培养基平板效率的验证1.溶藻弧菌选择性鉴别培养基的配制取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸馏水中，滤 菌膜过滤除菌；取酵母浸出粉3g，氯化钠10g，牛胆粉5g，胆酸钠3g，柠檬酸铁lg，硫代硫酸 钠10g，氯化钙lg，溴麝香草酚蓝0. 04g,麝香草酚蓝0. 04g,琼脂20g，蒸馏水900mL，分装三 角瓶，121 °C下灭菌20min，冷却至60 70°C，加入除菌的亮氨酸溶液，Imol/LNaOH灭菌溶液 调至pH 8. 0士0. 2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15°C培养箱中备用。2.接种将溶藻弧菌标准菌株在3. 5% NaCl营养琼脂复苏24h后，接种环挑取1 环，加入到IOmL 0.85%生理盐水中配成菌悬液原液，然后进行10倍梯度稀释，稀释8个梯 度，用移液管吸取各浓度菌液lmL，分别涂布TCBS培养基、溶藻弧菌选择性鉴别培养基和嗜 盐琼脂平板(含3% NaCl)平板，每个平板设10次重复；溶藻弧菌选择性鉴别培养基平板、 TCBS琼脂培养基和嗜盐琼脂平板(含3% NaCl)在36士 1°C培养，24h与4 后，菌落记数 (取30至300之间菌落数的梯度)，计算各种选择培养基的出菌率。3.出菌率的计算与数据处理方法出菌率(平板效率)指在选择性培养基上生长的菌落个数与在非选择性培养基 上生长的菌落个数的比值。
屮贿。/、选择培养基上菌落个数im —°)=非选择培养基上菌落个数—运用SPSS软件配对样品T检验(Paired-Samples T Test)方法进行显著性分析。4.结果及分析溶藻弧菌选择性鉴别培养基平板经过IMi 4 培养后观察记数，其细菌菌落数 并没有发生变化。对30 300之间的菌落数进行记数，与嗜盐琼脂平板记数结果进行对比， 计算出菌率，结果见表1。由于菌液涂布的差异造成同种培养基的出菌率的呈一定的偏差。 对两种培养基出菌率进行配对样品T检验，结果表明溶藻弧菌选择性鉴别培养基、TCBS平 板上生长的菌落数无显著差异(P > 0. 05)，2种培养基可以达到相同的检测限，培养基的灵 敏度相当。表1不同培养基对溶藻弧菌的出菌率
出菌效率培养基类型各个平板出菌效率(％)平均出菌效率(均值±SD)TCBS 93.496.2 90.7 89.5 91.8 95.1 98.3 100.194.39±3.72VaDM 95.596.4 90.2 92.2 92.8 96.6 99.7 100.595.49士 3.60实施例3 溶藻弧菌选择性鉴别培养基精确度及灵敏度的验证1.溶藻弧菌选择性鉴别培养基的配制取亮氨酸IOg溶解于IOOmL蒸馏水中，滤 菌膜过滤除菌；取酵母浸出粉2g，氯化钠8g，牛胆粉3g，胆酸钠5g，柠檬酸铁3g，硫代硫酸 钠10g，氯化钙3g，溴麝香草酚蓝0. 04g,麝香草酚蓝0. 04g,琼脂18g，蒸馏水900mL，分装三 角瓶，121 °C下灭菌20min，冷却至60 70°C，加入除菌的亮氨酸溶液，Imol/LNaOH灭菌溶液
6调至pH 8.0士0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15°C培养箱中备用。2.接种(1)纯菌污染样品将溶藻弧菌ZJGSMC1A0803在3. 5% NaCl营养琼脂上复苏后， 进行10倍梯度稀释，用移液管吸取10_4 10_6各浓度菌液ImL分别加到25g鱼肉中，均勻 混合后，按照国标GB/T 4789. 7-2008检验程序，在碱性蛋白胨水(APW)中增菌培养18h， 取1环增菌液划线接种溶藻弧菌选择性鉴别培养基和TCBS平板，36 士 1°C培养1 Mh， 观察溶藻弧菌的检出情况。同时吸取10_4 10_6各浓度菌液ImL涂布嗜盐琼脂平板对溶藻 弧菌进行计数。(2)混合菌液污染样品将溶藻弧菌复苏后，进行10倍梯度稀释，用移液管吸取 10_3 10_4各浓度菌液ImL分别加到25g鱼肉中，同时将非01霍乱弧菌(约IO3 IO4Cfu/ mL)、拟态弧菌(约IO3 104Cfu/mL)、创伤弧菌(约IO3 104cfu/mL)、副溶血性弧菌(约 IO3 104cfu/mL)、河流弧菌(约IO3 104cfu/mL)、梅氏弧菌(约IO3 104cfu/mL)、辛辛 那提弧菌(约IO3 104CfU/mL)、弗尼斯弧菌(约IO3 IO4CfVmL)、海鱼弧菌(约IO3 104Cfu/mL)、鲨鱼弧菌(约IO3 104Cfu/mL)、霍利斯弧菌(约IO3 104cfu/mL)加到每份 鱼肉样品中，均勻混合池后，按照国标GB/T 4789. 7-2008检验程序，首先在碱性蛋白胨水 (APff)中增菌培养18h，然后取1环增菌液划线接种溶藻弧菌选择性鉴别培养基和TCBS平 板，36士 1°C培养IMi Mh，观察溶藻弧菌的检出情况。疑似菌落采用法国梅里埃细菌鉴定系统API 20E试剂条，结合传统生化方法弧菌 鉴定生化管进行鉴定，鉴别典型菌落菌株类型。3.结果及分析溶藻弧菌ZJGSMC 1A0803纯菌液涂布嗜盐琼脂的计数结果约为 5. 7X 107cfu/mL，将溶藻弧菌ZJGSMC 1A0803稀释度为10_4 10_7的纯菌液污染鱼肉后，增 菌检测结果表明，浓度为IO1CfuAiL 103Cfu/mL (稀释度10_4 10_6)在VaDM和TCBS平板 上都可以检出，2种平板可以达到相同的检测限lOkfu/mL，即当样品中带有IO1CfuAiL浓度 的目标菌时，经过前增菌培养，在2种培养基上都可以检出。溶藻弧菌ZJGSMC 1A0803 浓度为 102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL(稀释度 1(Γ3、 10_4、IO-5)的纯菌液混合其他杂菌污染样品后，经过APW增菌，在VaDM可以检出溶藻弧菌， 溶藻弧菌菌落为黄色，其它各种弧菌菌落呈绿色或不生长；在TCBS也可以检测出溶藻弧 菌，溶藻弧菌呈黄色菌落，但黄色菌落中混有非O1霍乱弧菌、弗尼斯弧菌、鲨鱼弧菌、梅氏弧 菌、河流弧菌等其他弧菌，还需要进行多项生化试验才能检出是否污染了溶藻弧菌，并且当 溶藻弧菌含量低时容易受其它优势菌株的干扰而无法检出。溶藻弧菌选择性鉴别培养基与TCBS两种培养基相比，溶藻弧菌选择性鉴别培养 基比TCBS具有更高的检测效率，溶藻弧菌选择性鉴别培养基检测溶藻弧菌省去了 TCBS分 离培养后的生化试验，缩短检测时间，降低检测成本，减少工作量，可直接用于对溶藻弧菌 进行分离鉴定。实施例4 溶藻弧菌选择性鉴别培养基检测实际样品中应用1.溶藻弧菌选择性鉴别培养基的配制取亮氨酸15g溶解于IOOmL蒸馏水中，滤 菌膜过滤除菌；取酵母浸出粉3g，氯化钠10g，牛胆粉5g，胆酸钠3g，柠檬酸铁lg，硫代硫酸 钠10g，氯化钙lg，溴麝香草酚蓝0. 04g,麝香草酚蓝0. 04g,琼脂20g，蒸馏水900mL，分装三 角瓶，121 °C下灭菌20min，冷却至60 70°C，加入除菌的亮氨酸溶液，Imol/LNaOH灭菌溶液
7调至pH 8.0士0.2，将培养基倒入平板中，冷却后倒置放入15°C培养箱中备用。2.增菌采集样品鱼类71份和虾79份，先将样品表面进行酒精消毒，然后用剪刀 取每份样品25g加入225mL碱性蛋白胨水(APW)增菌液中增菌培养18h。3.接种培养接种环取1环增菌液划线接种溶藻弧菌选择性鉴别培养基平板， 36士 1°C培养16h Mh，观察记录菌落颜色和形态。4.结果及分析经鉴定，采集的150份实际样品中，共检出溶藻弧菌沈株；溶藻弧 菌菌落在溶藻弧菌选择性鉴别培养基培养基上呈光滑、凸起、直径1 3mm、边缘整齐的黄 色菌落。
权利要求
1.溶藻弧菌选择性鉴别培养基，其特征在于所述培养基的配方为亮氨酸l(T20g，酵 母浸出粉广5 g，氯化钠5 10 g，硫代硫酸钠8. 5 11 g，胆酸钠1 5 g，牛胆粉2 7 g，柠檬酸铁1 3 g，氯化钙1 3 g，琼脂12 20 g，溴麝香草酚蓝0.04 g，麝香草酚蓝 0.04 g，蒸馏水 1000 mL。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基的配方为亮氨酸15g，酵母 浸出粉3 g，氯化钠10 g，硫代硫酸钠10 g，胆酸钠3 g，牛胆粉5 g，柠檬酸铁1 g，氯化钙 1 g，琼脂20 g，溴麝香草酚蓝0.04 g，麝香草酚蓝0. 04 g，蒸馏水1000mL。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于所述培养基的pH值为7.6 9. 0。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于所述培养基的pH值为8.0 ±0. 2。
全文摘要
本发明公开了一种以快速筛检溶藻弧菌为唯一目标菌的选择性鉴别培养基——溶藻弧菌选择性鉴别培养基(VaDM)，由亮氨酸、酵母浸出粉、氯化钠、硫代硫酸钠、胆酸钠、牛胆粉、柠檬酸铁、氯化钙、琼脂、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝、蒸馏水配制而成。本发明依据溶藻弧菌所特有的亮氨酸酶系统、基础及特殊营养要求、嗜盐性和对某些抑菌剂的抵抗性，优化组合了VaDM的各种成分，在保障该菌良好生长的同时可有效抑制其它多数杂菌的生长，并使目的菌呈现出特殊的菌落颜色，达到了与其它菌很好的选择和鉴别的效果。通过出菌率、准确性、精确性和灵敏度试验，并比较常规检测方法对实际样品进行检测，验证了VaDM对溶藻弧菌的快速筛检具有理想效果。
文档编号C12Q1/04GK102146429SQ201110025969
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者王文华, 赵广英, 陈春艳, 陈洁 申请人:浙江工商大学