专利名称：一种新型人白细胞介素-11的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型人白细胞介素-Ii及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
白细胞介素-ll(interleukin-llIL-ll)由骨髓基质细胞产生的细胞因子。1990 年Paul首先克隆人的IL-llcDNA成功。IL-Il能与多种细胞因子协同支持造血前体细胞长期生长，对淋巴样细胞系、髓样细胞系、红细胞系和巨核细胞系都有促生长作用。但其最重要的功能是协同IL-3刺激巨核细胞系增殖，增加外周血血小板数目。动物实验表明，IL-Il 体内注射能增加正常小鼠和脾切除小鼠外周血中的血小板.在体内单独或联合应用IL-Il 均可促进外周血血小板数目的增多，并缩短放疗、化疗、或骨髓移植动物的外周血血小板恢复至正常水平的时间。因此，临床上主要应用IL-Il治疗各种原因引起的血小板减少症。近年来研究发现IL-Il在造血系统之外的其他组织也有作用，如参与气道重构、诱导孕期子宫内膜蜕膜化、诱导破骨细胞形成、抑制糖尿病发生发展以及抗炎方面等，被证实是一种多功能的细胞因子。成熟IL-Il有178个氨基酸残基，没有二硫键和糖基化位点。由于其N端富含脯氨酸，对IL-Il原核表达的水平及其稳定性、以及包涵体复性时产物的正确折叠都造成一定的影响。目前国内主要采用GST等融合蛋白的形式制备IL-11，其产物必须用肠激酶去除多余部分，大大增加了生产成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是研制一种新型的人白介素-11，并在大肠杆菌中单独
稳定表达。本发明采用下述技术方案鉴于人IL-IlN端富含脯氨酸，对其原核表达的稳定性和包涵体复性时产物的正确折叠都造成一定的影响；而我们的研究发现，除去N末端8个氨基酸并不影响人IL-Il的生物学活性。因此，本发明研制出了 N末端缺失了 8个氨基酸(即Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro)的新型人 IL-11 (hIL-11 Δ )。将所述的编码该新型人IL-Il的多核苷酸序列，通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明重组蛋白的工程菌；所述的原核表达载是 pET21a,大肠杆菌为 BL21 (DE3)。本发明重组新型人IL-Il蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得生物活性与野生型人IL-Il相当的新型人 IL-Il 重组蛋白(hrIL-ΙΙΔ)。
图1是pET21a-hrIL_ll Δ重组质粒的结构图。
图2是PET21a-hrIL-llA重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准，2 是工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是包涵体，5是纯化后。图3是用IL-6依赖细胞株T1165、MTT法对复性后的hrIL_ll Δ进行生物活性测定的结果，以PR0SPEC公司生产的hIL-11为阳性对照。其中+表示本发明重组蛋白，
表示阳性对照。
具体实施例方式下述实施例和实验所用的材料及设备如下细胞株、菌株与质粒T1165(小鼠浆细胞瘤细胞株)；DH^^PBL21(DE;3)；原核表达质粒 pET21a(AMPr，Novagen)。主要生化试剂及材料=DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒Oliagen)、 寡核苷酸的合成(Sigma)、Trizol、Superscript II 逆转录酶、Platinum Pfx DNA 聚合酶和T4DNA连接酶(Invitrogen)、IL-6和IL-11标准品(PR0SPEC)、琼脂糖和 SDS-PAGE(Biorad), Ni-NTA(Qiagen)填料、抗 IL-11 单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)。DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点
(Sambrook J,et al. Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在上海英骏公司的DNA测序服务中心完成。例1重组蛋白pET21a-hrIL_ll Δ的制备1、制备hr IL-11 Δ cDNA 用DNeasy组织试剂盒从人外周血细胞中抽提出基因组 DNA，然后用其作为模板，通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR制备hrIL_ll Δ cDNA。引物5’-GGATTACCATATGCGAGTTTCTCCA G_3’ (26n t)禾口 5’ -C G CCTCGAGCAGCCGAGTCTTCAGC Α-3' (26η t)反应条件变性94°C，5min,循环(94°C，60s — 55°C，60s - 72V, 60s) 30 个循环， 最后 72°C, IOmin02、pET21a-hrIL-ll Δ重组质粒的构建制备IL-11 Δ cDNA(两端分别含 NdeI-I和B10 I限制性内切酶位点)，将IL-11基因片段克隆于pET_21a载体中，获得 PET21a-hrIL-llA重组表达质粒(图1)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。3、构建 BL-21/pET21a/hrIL_ll Δ 工程菌重组表达质粒转化BL21(DE!3)感受态细胞后，用含氨苄霉素的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有氨苄霉素(50yg/ml)的LB培养基中。经37°C摇床培养扩增至吸光度A_为0. 4 0. 5时，加入终浓度为lmmol/L的IPTG，37°C诱导表达4h，离心 (12000gX 15min)收获菌体，将细胞破碎后用12%的SDS-PAGE检测分析重组蛋白的表达情况(图2)。4、hrIL_llA重组蛋白的表达该重组蛋白在菌体中主要以包涵体的形式存在，分子量为19KD，其表达量达20 30%。
5、hrIL_llA重组蛋白的制备a.制备包涵体按 1 10 应用菌体裂解液(50mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl)重悬菌体，4°C搅动30min，冰浴中超声，400w，每次5s,间隔5s，共2个99 次。超声破碎后，4°C，12，000\8离心3011^11，收集沉淀。20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/LEDTA, 0.5M NaCl，pH 8.0，洗涤 30min。4°C 条件下 12000g 离心 15min 收集沉淀，溶于 20mmol/ LTris-HCl 缓冲液，8mol/L 尿素(pH 8.0)中，12000g 离心 15min，取上清液。b. Ni-NTA柱层析将步骤a得到的上清液用0. 22um滤器过滤后上样于Ni-NTA柱 O. 6X5cm)，用平衡液QOmmol/L Tris-HCl缓冲液，6mol/L尿素，10mmol/L咪唑)冲洗至样品A280恢复至基线，然后依次应用30、50、100mmol/L咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱峰，12% SDS-PAGE分析纯化效果。c.透析复性将hrIL-11 Δ重组蛋白的浓度调整至50 100ug/mL，在大于20倍体积的如下透析液中4°C透析复性A(20mmol/L Tris-HCL, 3mol/L尿素，lmmol/LEDTA，)， B(20mmol/LTris-HCL, Imo 1/L 尿素，lmmol/LEDTA)，C(20mmol/L Tris-HCL, lmmol/LEDTA)， 每1 换液1次，最终换用磷酸盐缓冲液(1XPBS，pH 7.4)透析12小时，12，OOOg离心 15min除去不溶物，收集上清，即为复性后的hrIL-ΙΙΔ重组蛋白。6、用Tl 165细胞株，MTT法对人IL-11的生物活性进行测定，测得的hrIL_ll Δ的比活性为IX 106U/mg (图3)。
权利要求
1.一种新型人白细胞介素-11，该蛋白为N末端缺失了 8个氨基酸残基(即Pro Gly Pro ProPro Gly Pro Pro)的人白细胞介素-11。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白，其特征在于与天然人白细胞介素-11相比，N 端缺失8个氨基酸残基。
3.根据权利要求2所述的一种重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ.NO 1。
4.一种基因，该基因编码权利要求1的新型人白细胞介素-11。
5.一种表达载体，该表达载体含有权利要求4所述的基因。
6.一种工程菌，该工程菌被转化了权利要求5所述的表达载体。
全文摘要
本发明研制出了一种N端缺失8个氨基酸残基(即Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro)的新型人白细胞介素-11；该重组蛋白能在大肠杆菌中单独高效稳定表达，其生物活性与野生型人IL-11相当(比活性为1×106U/mg)。
文档编号C12R1/19GK102161700SQ20111002627
公开日2011年8月24日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者唐佳, 许晓玲, 高基民 申请人:温州医学院