专利名称：小鼠抗人ck19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及以原核表达的CK19蛋白免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株11F5，属于生物工程技术领域。
背景技术：
CK即细胞角蛋白(Cytokeratin)，是细胞骨架蛋白之一中间丝多基因家族中的一种，为上皮细胞主要的结构蛋白和分化的早期标志物。细胞角蛋白由30种不同的基因编码，这些基因可以转录成分子量不同的20种多肽，分别命名为CKl CK20。细胞角蛋白又可根据等电点的不同分为酸性(I类)蛋白，包括CK9 CK20;及碱性(II类)蛋白，包括CKl CK8。一般而言，相对分子质量小的细胞角蛋白总是与大的细胞角蛋白配对，而酸性细胞角蛋白总是与碱性细胞角蛋白配对。细胞分化的不同阶段及不同类型上皮细胞表达不同的细胞角蛋白。CK19属于酸性(I类)细胞角蛋白，分子量约40kDa，是相对分子质量最小的细胞角蛋白，存在于正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，特别是单层上皮细胞和间皮；在肝细胞和角膜为阴性表达，在子宫上皮、羊膜的上皮和间质中呈阳性表达。CK19在肝细胞中不表达但存在于胆管上皮和胆管癌，由于这一特性，CK19是目前诊断肝内胆管细胞癌(ICC)的主要免疫组化标志物。作为上皮源性细胞特异性标志基因，CK19也是早期癌症微转移研究中运用最多的分子标志之一，主要用于腺癌的诊断以及转移性腺癌和肝癌的鉴别诊断。目前，国内外已经获得了多种CK19的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好， 稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的CK19的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达的小鼠抗人CK19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:(I)根据CK19的基因序列(BC002539.2)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CK19基因，构建重组表达载体PET28a-CK19，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备CK19单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)通过免疫组织化学分析CK19单克隆抗体染色人甲状腺乳头状癌、结肠腺癌和肝脏胆管组织石蜡切片。
(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CK19重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体CK19的重链和轻链可变区序列。本发明提供的以原核表达的CK19蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为11F5，分类命名为小鼠抗人CK19杂交瘤细胞系，该细胞株11F5已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCN0.6913。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株11F5，CGMCC N0.6913产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO =IO0本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本发明的优点和有益效果:本发明应用重组人的CK19蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗CK19的杂交瘤细胞株，命名为11F5，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对CK19单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上。人甲状腺乳头状癌、结肠腺癌和肝脏胆管组织石蜡切片经抗CK19抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内出现呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的CK19单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的CK19蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达。
图1SDS-PAGE分析纯化后的CK19单克隆抗体。图2ELISA法测定CK19单克隆抗体滴度。图3是免疫组织化学检测分析CK19单克隆抗体染色人甲状腺乳头状癌石蜡切片。图4是免疫组织化学检测分析CK19单克隆抗体染色人结肠腺癌石蜡切片。图5是免疫组织化学检测分析CK19单克隆抗体染色人肝脏胆管组织石蜡切片。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1:杂交瘤细胞株11F5及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备(I)获得目的基因在该实施例中， 根据CK19的基因序列(BC002539.2)的编码框，设计I对特异引物:
引物1:5' -GGATCCATGACTTCCTACAGCTATCGCC-3' (SEQ ID NO:1)引物2:5' -CTCGAGTCAGAGGACCTTGGAGGCAG-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CK19基因。(2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-CK19。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(4)诱导表达和蛋白纯化将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，370C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化CK19蛋白。2、单抗的制备和纯化(I)、免疫动物—般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白CK19 (用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100 μ g/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白CK19(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白CK19 (用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融
口 ο(2)、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤 细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的CK19蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100 μ 1,4°C包板过夜。甩掉包被液,加入200 μ 15%的脱脂奶粉,37°C封闭Ih后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清IOOy I (阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50 μ I，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗CK19杂交瘤细胞株，命名为11F5，亚型鉴定为IgGl。将选出的阳性杂交瘤细胞株11F5克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人CK19杂交瘤细胞系11F5，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6913。(3)单克隆抗体的大量制备与纯化将步骤⑵获得的细胞株11F5接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体CK19的纯化:采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗CK19的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度以纯化的CK19蛋白(10μ g/ml)包被酶标板，每孔100μ 1，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200 μ 15%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 进行稀释，以每孔 100 μ I 加入酶标板中(阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μ 1，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上(参见图2)。实施例2:单克隆抗体应用免疫组化应用检测用CK19单抗，按常规法作病理切片，对人甲状腺乳头状癌、结肠腺癌及肝脏胆管组织石蜡切片进行免疫组化染色。具体方法为:(I)脱蜡切片依次置于二甲苯1、I1、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇1、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。(2)抗原修复将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)，高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。(3)阻断
3 % H2O2中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。(4)滴加一抗甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的CK19单克隆抗体，稀释度为1: 1500。放置在孵育盒内4°C冰箱中过夜孵育约12小时。(5)滴加二抗将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37°C恒温箱中孵育30分钟。(6)显色、衬染、封片取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3 5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5 10分钟，苏木素染液复染I分钟，0.5 %盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5 10分钟，脱水、透明、封片、镜检。 结果判定:按照国外学者对组织中CK19的判定标准，CK19蛋白阳性反应为黄到棕黄色细小颗粒，定位于胞浆。人甲状腺乳头状癌(参见图3)、结肠腺癌(参见图4)及肝脏胆管组织(参见图5)经抗CK19抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内出现呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此CK19小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。实施例3:单克隆抗体可变区测序根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:zh085/ -GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (SEQID NO:3)zhrll5/ -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQID NO:4)zl025/ -GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3' (SEQIDNO:5)zlr055/ -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQID NO:6)Trizol Reagent试剂分别提取5X IO6杂交瘤细胞3G7的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhrll为引物进行PCR扩增单克隆抗体β-Tubulin重链可变区，用zlOl和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体β -Tubulin轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94°C 5分钟；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30个循环；72°C 7分钟。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp，重链长度420bp)。克隆到PGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序,确定了单克隆抗体β -Tubulin的重链和轻链可变区序列。单克隆抗体β -Tubulin可变区的DNA序列和氨基酸序列:单克隆抗体β-Tubul in 重链可变区 DNA 序列(5' —3' , 336bp) (SEQ ID NO:7)；单克隆抗体β-Tubulin 的轻链可变区 DNA 序列(5' —3'，387bp) (SEQ ID NO:
8)；
单克隆抗体β -Tubulin重链可变区的推断氨基酸序列(I 12氨基酸)(SEQ ID NO:
9)；单克隆抗体β -Tubulin轻链可变区的推断氨基酸序列(128氨基酸)(SEQ10IDNO:10)。`
权利要求
1.一种以原核表达的CK19蛋白免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株11F5，保藏编号为 CGMCC N0.6913。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株11F5产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10o
4.一种DNA分子SEQ ID NO:7，它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一种DNA分子SEQ ID NO:8，它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQID NO :10o
全文摘要
一种小鼠抗人CK19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为11F5，保藏编号为CGMCC No.6913。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株11F5产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ IDNO9；一种DNA分子SEQ ID NO8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达。
文档编号C12N5/20GK103173416SQ20131004130
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者张林刚, 郗日沫, 尹芝南 申请人:天津三箭生物技术有限公司