专利名称：一种检测mthfr基因多态性的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及焦磷酸测序技术在基因多态性检测方面的应用，具体涉及一种检测MTHFR基因多态性的方法，还涉及一种MTHFR基因的扩增引物、检测MTHFR基因多态性的测序引物及含有它们的试剂盒。
背景技术：
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3 X IO6个。目前，SNP成为第三代遗传标志，其在疾病的早期风险性评估、早期诊断、预防和治疗等各方面具有重要功能和应用价值。 MTHFR (亚甲基四氧叶酸还原酶)基因可编码亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白，该酶的主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接地为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个比较低的水平。MTHFR基因存在多态性，可影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和热稳定性。MTHFR基因677位点的多态性可引起该酶的热不稳定性增加，酶活性下降，导致血液中同型半胱氨酸浓度升高。目前国内外有关SNP检测的技术研究已经非常广泛，用于SNP检测的主要方法如下(I) SSCP 技术即单链构象多态性检测技术，是将经PCR扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA，可以因其顺序或单个碱基差异，所形成的空间构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异。(2) RFLP 技术即限制性片段长度多态性分析技术，该方法的原理是碱基的变异可导致已有酶切位点的消失或新的酶切位点的出现，从而引起不同个体在用同一限制性内切酶酶切时，DNA片段长度出现差异。(3) TaqMan 探针技术TaqMan探针技术是在常规PCR反应体系中加入一个突光标记探针,该探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，若探针可以与模板完整退火，那么Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。(4)基因芯片技术
基因芯片技术的原理是将具有特定喊基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列。(5) Sanger 测序技术Sanger测序技术原理是利用DNA聚合酶能够以单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链。该酶能够用2’，3’ 一双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3’末端，从而终止其延伸反应。在含有模板、引物，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP反应管中，DNA聚合酶合成出一系列以ddNTP为3’末端的不同长度的新链，经电泳和放射自显影后，能迅速地读出DNA序列。其检测过程包括质粒提取或PCR产物纯化、模板质量鉴定、模板定量以及DNA测序反应。(6)焦磷酸测序技术随着科技的发展，焦磷酸测序技术的应用为SNP的研究和临床检测提供了新的技`术平台。焦磷酸测序技术是一项全新的DNA测序技术，该技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。该技术的原理是第I步测序引物与单链PCR产物模板结合，然后加入酶混合物(包括4种酶，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)和底物混合物(包括腺苷_5’ -磷酰硫酸(APS)和荧光素)；第2步向反应体系中加入dNTPs (每次只添加一种dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP或dGTP)，如果该dNTP刚好能与模板碱基配对，则其会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出等分子量的焦磷酸(PPi)。第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP ;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD摄像机即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低与合成的核苷酸碱基数成正比。第4步反应体系中未结合的dNTPs和产生的ATP在双磷酸酶的作用下发生降解。当降解完成时，另一种dNTP才会被添加到反应体系中。第5步dNTPs的添加是按照次序进行的。由于α-硫代脱氧三磷酸腺苷(dATPaS)能有效的被DNA聚合酶使用并且不会被荧光素酶识别，所以该系统中用dATPaS替代天然的dATP。随着程序的持续进行，合成出互补的DNA链并且根据获得的峰值图即可确定DNA核苷酸序列。焦磷酸测序技术操作简单快速、特异性好、灵敏度高、准确性高、通量高、检测成本低，为单核苷酸多态性研究和临床检测提供了理想的技术平台。本发明提供了一种利用焦磷酸测序技术进行MTHFR基因C677T多态性检测的方法，并设计了特异性扩增引物和焦磷酸测序引物，该扩增引物能从基因组DNA中扩增MTHFR基因核酸片段。本发明的方法利用焦磷酸测序技术，对生物样本中的MTHFR基因多态性进行检测。
发明内容
本发明的第一方面提供一种检测MTHFR基因多态性的方法，其包括以下步骤使用SEQ ID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的扩增引物扩增MTHFR基因的扩增步骤。优选地，所述的引物对可以被生物素标记；进一步优选地，SEQ ID NO. I所示的引物被生物素标记。正向引物F :5，-TGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCC-3’ (SEQ IDNO. I)；反向引物R :5’-GATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATG-3’ (SEQ ID NO. 2)。本发明的检测MTHFR基因多态性的方法，其进一步地可包括以下步骤(I)使用SEQ ID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的扩增引物扩增MTHFR基因的扩增步骤；(2)将步骤(I)获得的扩增产物变为单链DNA模板的步骤；(3)使用SEQ ID NO. 3所示的测序引物对步骤(2)获得的单链DNA模板进行焦磷酸测序的步骤。`测序引物P :5’-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG-3’ (SEQ ID NO. 3)在本发明的一个优选的实施方案中，所述的检测MTHFR基因多态性的方法，其中所述的扩增条件为95°C预变性15min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共45个循环；72°C延伸IOmin。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述的检测MTHFR基因多态性的方法，其中，步骤(2)是将步骤(I)得到的扩增产物加入结合缓冲溶液和链霉亲和素包被的磁珠，在室温下孵育一定时间，优选15秒；与磁珠结合后的PCR产物在乙醇溶液(优选为70%乙醇溶液)中洗涤一定时间(优选洗涤5秒)、变性液(QIAGEN，货号979007)中孵育一定时间(优选5秒)、洗脱液(QIAGEN，货号979008)中孵育一定时间(优选10秒)，得到单链DNA模板；优选地，权利要求2的方法，其中，步骤(3)还包括以下步骤，将步骤(2)获得的单链DNA模板转入含有SEQ ID NO. 3所示的测序引物的退火缓冲液(QIAGEN，货号979009)中，在合适的温度条件下(例如80°C)孵育一定时间(例如2分钟)，冷却至室温，得到单链测序模板；优选地，步骤(3)中进行焦磷酸测序时，按照以下碱基分配顺序进行焦磷酸测序反应TAGACTCTGCACGTA。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明所述的检测MTHFR基因多态性的方法，用于检测MTHFR基因C677T的多态性；优选地，所述的MTHFR基因来源于人全血或人口腔上皮细胞。本发明的第二方面提供一种用于MTHFR基因扩增的引物对，其序列如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示，优选地，所述的引物对可以被生物素标记。本发明的第三方面提供一种用于检测MTHFR基因多态性的测序引物，其序列如SEQ ID NO. 3 所示。SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的扩增引物、SEQ ID NO. 3所示的测序引物均可根据本领域的常规合成方法制备。本发明的实施例中用到上述引物由Invitrogen公司合成。本发明的第四方面提供一种基因扩增试剂盒，其中含有本发明第二方面所述的引物对。本发明的第五方面提供一种检测试剂盒，其含有本发明第二方面所述的引物对，和本发明第三方面所述的测序引物，和任选的测序反应所需的其他试剂，优选的其他试剂为焦磷酸测序反应所需的试剂，例如焦磷酸测序反应所用的酶混合物(包括4种酶，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)、底物混合物(包括腺苷_5’ -磷酰硫酸(APS)和荧光素)等。本发明的第六方面提供本发明第二方面所述的引物对、或第三方面所述的测序引物、或第四方面所述的基因扩增试剂盒、或第五方面所述的检测试剂盒的用途，在检测MTHFR基因多态性中的用途；优选用于检测MTHFR基因C677T的多态性；优选地，所述的MTHFR基因来源于人全血或人口腔上皮细胞。本发明的一个具体的实施方案中，所述的检测MTHFR基因多态性的方法，其包括以下步骤a)采用常规方法提取基因组DNA，获得基因组DNA提取液；
b) PCR扩增反应在PCR扩增反应体系中加入步骤a )中得到的基因组DNA提取液2uL进行PCR扩增，扩增体系包含特异性引物对SEQ ID No. I和SEQID No. 2 (Invitrogen公司合成)的反应浓度时 O. 2uM, 2 X PyroMark PCRMaster Mix 12. 5uL, IOXCoralLoad Concentrate 2. 5uL(Pyromark PCRKit，QIAGEN，货号978703)，剩余加水补足至25uL。PCR扩增条件为95°C预变性 15min，45 个循环(94°C变性 30s，60°C退火 30s，72。。延伸 30s)，72。。延伸 IOmin0c )单链测序模板制备将步骤b)中得到的扩增产物(15uL)加入结合缓冲溶液(40uL，购自QIAGEN，货号979006)和链霉亲和素包被的磁珠(3uL，购自GE Healthcare，货号17-5113-01)，在室温下孵育15秒；与磁珠结合后的PCR产物在70%乙醇溶液(IlOmL)中洗涤5秒、变性液(90mL，购自QIAGEN，货号979007)中孵育5秒、洗脱液(llOmL，购自QIAGEN，货号979008)中孵育10秒，上述扩增产物变为单链DNA模板。再将所述单链DNA模板转入含有特异性的核苷酸测序引物(SEQID NO. 3所示的测序引物，O. 4uM)的退火缓冲液(40uL，购自QIAGEN，货号979009)中，在80°C下孵育2分钟，冷却至室温得到单链测序模板。d)确定碱基分配顺序为TAGACTCTGCACGTA。e)焦磷酸测序反应准备好焦磷酸测序反应所用的酶混合物、底物混合物及dNTPs(上述所用到的试剂均来自于试剂盒-Pyromark Gold Q96Reagents，QIAGEN公司，货号972804)，加入试剂舱，将步骤c)中所得到的分离纯化后的单链DNA模板放入焦磷酸测序仪，按照步骤d)中设计的碱基分配顺序进行焦磷酸测序反应。f)测序结果的分析确定仪器自动对测序数据进行分析，根据测序结果分析确定MTHFR基因677位点多态性类型。发明的有益效果本发明利用PCR扩增以及焦磷酸测序技术，对生物样本中的MTHFR基因多态性进行检测。本发明设计了特异性扩增引物和焦磷酸测序引物，该扩增引物能特异性地从基因组DNA中扩增MTHFR基因核酸片段，应用本发明设计的焦磷酸测序引物能够使MTHFR基因多态性检测更简单快速。本发明的方法操作简单快速，特异性好、灵敏度高、准确性高、通量高、检测成本低，具有广阔的应用前景。
图1-1、图1-2和图1-3是实施例I中MTHFR基因质粒扩增产物的毛细管电泳检测图，其中图1-1为野生型质粒扩增产物检测结果；图1-2为突变型质粒扩增产物检测结果；图1-3为野生型和突变型等比例混合质粒为模板的扩增产物检测结果。图1-4、图1-5和图1-6是实施例I中MTHFR基因质粒扩增产物的焦磷酸测序图，其中图1-4为野生型质粒焦磷酸测序图；图1-5为突变型质粒焦磷酸测序图；图1-6为野生型和突变型等比例混合质粒的焦磷酸测序图。 图2-1、图2-2和图2-3是实施例2中对全血样本进行检测的焦磷酸测序图。图3-1、图3-2和图3-3是实施例3中对口腔上皮细胞样本进行检测的焦磷酸测序图。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例IMTHFR基因质粒序列的测定步骤a)质粒的构建质粒构建工作由TAKARA公司完成，所用载体为pMD18_T载体(购自TAKARA，货号 D101A)。该质粒插入序列为 MTHFR 基因(NCBIReference Sequence:NC_000001. 10)从9601 -10000位点的序列片段。其中野生型质粒含MTHFR基因677C序列，突变型质粒含MTHFR基因677T序列。步骤b)质粒提取采用QIAGEN Plasmid Mini Kit (购自 QIAGEN，货号 12123)进行质粒 DNA 的提取，具体操作步骤参照厂家说明书。步骤c)基因片段扩增采用PyroMark PCR Kit (购自 QIAGEN，货号 978703)在 GeiieAmp PCRSystem 9700 (AB)上进行基因片段的扩增。扩增体系如下特异性扩增引物F (SEQ IDNo. I)和 R (SEQ ID No. 2)的工作浓度为 O. 2uM，2XPyroMark PCR Master Mix 12. 5uL,10 X CoralLoadConcentrate 2. 5uL,取上述步骤b)提取的质粒2uL作为模板,加ddH20补足至总体积25uL。扩增程序如下95°C预变性15min，45个循环(94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 30s)，72°C延伸 IOmin0所述特异性扩增弓I物的碱基序列为正向引物F :5’-TGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCC-3’ (SEQ IDNo. I)；
反向引物R :5’ -GATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATG-3’ (SEQ ID No. 2)，其中SEQ ID No. I为生物素标记的引物，生物素标记于引物的5’端。上述SEQ ID No. I和SEQID No. 2所示的引物委托Invitrogen公司合成。经过上述扩增得到PCR扩增产物，将得到的PCR扩增产物使用QIAxcel System(QIAGEN)和 QIAxcel DNA High Resolution Kit (购自 QIAGEN，货号 929002)进行毛细管电泳检测，野生型质粒的扩增产物电泳检测结果如图1-1所示；突变型质粒的扩增产物电泳检测结果如图1-2所示；野生型和突变型等比例混合质粒为模板的扩增产物电泳检测结果如图1-3所示。从图1-1、图1-2和图1-3可以看出(其中A\B\C所示位置分别为目的条带所在位置)，野生型质粒、突变型质粒以及野生型和突变型等比例混合质粒为模板的三个扩增体系中均可得到单一目的条带，且无非特异性扩增产物，满足焦磷酸测序要求。步骤d)单链模板的制备单链模板制备使用PyroMark Q96 Vaccum Station (购自QIAGEN)完成,具体操作按照说明书进行，所有试剂的用量按说明书的推荐用量，即将步骤c)扩增所得PCR扩增产·物(15uL)，加入结合缓冲溶液(40uL，购自QIAGEN，货号979006)和链霉亲和素包被的磁珠(3uL，购自GE Healthcare，货号17-5113-01)，在室温下孵育15秒；PCR扩增产物通过标记的生物素与链霉亲和素包被的磁珠结合，与磁珠结合后的PCR产物在70%乙醇溶液(IlOmL)中洗涤5秒、变性液(90mL，购自QIAGEN，货号979007)中孵育5秒、洗脱液(IlOmL,购自QIAGEN,货号979008)中孵育10秒，上述扩增产物变为单链DNA模板。再将所述单链DNA模板转入含有测序引物(工作浓度为O. 4uM)的退火缓冲液(40uL，购自QIAGEN，货号979009)中，在80°C下孵育2分钟，冷却至室温得到单链DNA模板。其中所述的测序引物的碱基序列为P :5’-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG-3’ (SEQID No. 3),委托 Invitrogen 公司合成。步骤e )碱基分配顺序打开PYROMARK ID软件，点击Simple Entries,将引物设计软件中所保存的本实验的引物目录引入，程序即可自动生成一个Dispensation Order和预期的焦磷酸序列图(Pyrogram)0确定碱基分配顺序为TAGACTCTGCACGTA。步骤f)焦磷酸测序反应测序反应在PYROMARK Q96ID (QIAGEN)仪器的SNP模式下进行。测序所用到的试剂均来自于试剂盒-Pyromark Gold Q96Reagents，购自QIAGEN公司，货号972804。将焦磷酸测序反应所用的酶混合物、底物混合物及dNTPs，加入试剂舱，将步骤d)中所得到的单链DNA模板放入焦磷酸测序仪，按照步骤e)中设计的碱基分配顺序进行焦磷酸测序反应。引物链随着不同dNTPs的加入而延伸，伴随酶促反应的进行，CCD摄像机检测到发出的荧光信号，焦磷酸测序图谱见图1-4、图1-5和图1-6。步骤g)测序结果的分析确定野生型质粒的焦磷酸测序结果如图1-4所示，其测得的序列为GCTCCC(反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为CC，与该野生型质粒的预期测序结果一致；突变型质粒的焦磷酸测序结果如图1-5所示，其测得的序列为ACTCCC(反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为TT，与该突变型质粒的预期测序结果一致；野生型和突变型等比例混合质粒的焦磷酸测序结果如图1-6所示，其测得的序列为[A/G] CTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为CT，与该混合质粒的预期测序结果一致。实施例2全血样本的检测采用DNeasy Blood&Tissue Kit (购自QIAGEN，货号69504)进行全血样本(全血样本1、2和3均来自临床采集的样本)的基因组DNA提取，具体操作步骤参照厂家说明书，获得DNA提取液。MTHFR基因片段的扩增、单链模板的制备、碱基分配顺序、焦磷酸测序反应以及测序结果的分析确定同实施例I中的各步骤。样本I的焦磷酸测序结果如图2-1所示，测得序列为GCTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为CC (纯和野生型)；
样本2的焦磷酸测序结果如图2-2所示，测得序列为ACTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为TT (纯和突变型)；样本3的焦磷酸测序结果如图2-3所示，测得序列为[A/G]CTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为CT (杂合突变型)。实施例3 口腔上皮细胞样本的检测用C,.丨IiIfgeSw丨tch gDNA Normalized Buccal Cell Kit (购自 Invitrogen,货号CSl 1020)进行口腔上皮细胞样本(口腔上皮细胞样本样本4、5和6均来自临床采集的样本)基因组DNA提取，具体操作参照厂家说明书，获得DNA提取液。MTHFR基因片段的扩增、单链模板的制备、碱基分配顺序、焦磷酸测序反应以及测序结果的分析确定同实施例I中的各步骤。样本4的焦磷酸测序结果如图3-1所示，测得序列为GCTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为CC (纯和野生型)；样本5的焦磷酸测序结果如图3-2所示，测得序列为ACTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为TT (纯和突变型)；样本6的焦磷酸测序结果如图3-3所示，测得序列为[A/G]CTCCC (反向)，仪器根据峰图判定其MTHFR基因677位点基因型为CT (杂合突变型)。
权利要求
1.一种检测MTHFR基因多态性的方法，其包括以下步骤 使用SEQ ID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的扩增引物扩增MTHFR基因的扩增步骤，优选地，所述的引物对可以被生物素标记。
2.一种检测MTHFR基因多态性的方法，其包括以下步骤 (1)使用SEQID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的扩增引物扩增MTHFR基因的扩增步骤； (2)将步骤(I)获得的扩增产物变为单链DNA模板的步骤； (3)使用SEQID NO. 3所示的测序引物对步骤(2)获得的单链DNA模板进行焦磷酸测序的步骤。
3.权利要求I或2的方法，其中所述的扩增条件为95°C预变性15min;94°C变性30s，60°C退火30s，72。。延伸30s，共45个循环；72°C延伸IOmin0
4.权利要求I或2的方法，该方法用于检测MTHFR基因C677T的多态性；优选地，所述的MTHFR基因来源于人全血或人口腔上皮细胞。
5.权利要求2的方法，其中，步骤(2)是将步骤(I)得到的扩增产物加入结合缓冲溶液和链霉亲和素包被的磁珠，在室温下孵育一定时间，优选15秒；与磁珠结合后的PCR产物在乙醇溶液(优选为70%乙醇溶液)中洗涤一定时间(优选洗涤5秒)、变性液中孵育一定时间(优选5秒)、洗脱液中孵育一定时间(优选10秒)，得到单链DNA模板； 优选地，权利要求2的方法，其中，步骤(3)还包括以下步骤， 将步骤(2)获得的单链DNA模板转入含有SEQ ID NO. 3所示的测序引物的退火缓冲液中，在合适的温度条件下(例如80°C)孵育一定时间(例如2分钟)，冷却至室温，得到单链测序模板； 优选地，步骤(3)中进行焦磷酸测序时，按照以下碱基分配顺序进行焦磷酸测序反应TAGACTCTGCACGTA。
6.用于MTHFR基因扩增的引物对，其序列如SEQID NO. I和SEQID NO. 2所示;优选地，所述的引物对可以被生物素标记；进一步优选地，SEQ ID NO. I所示的引物被生物素标记。
7.用于检测MTHFR基因多态性的测序引物，其序列如SEQIDNO. 3所示。
8.—种基因扩增试剂盒，其中含有权利要求7的引物对，和任选的扩增所需的其他试剂。
9.一种检测试剂盒,其含有权利要求7的引物对，和权利要求8所述的测序引物，和任选的测序反应所需的其他试剂，优选的其他试剂为焦磷酸测序反应所需的试剂。
10.权利要求6的引物对、或权利要求7的测序引物、或权利要求8的基因扩增试剂盒、或权利要求9的检测试剂盒的用途，在检测MTHFR基因多态性中的用途；优选用于检测MTHFR基因C677T的多态性；优选地，所述的MTHFR基因来源于人全血或人口腔上皮细胞。
全文摘要
本发明涉及焦磷酸测序技术在基因多态性检测方面的应用，具体涉及一种检测MTHFR基因多态性的方法，还涉及一种MTHFR基因的扩增引物、检测MTHFR基因多态性的测序引物及含有它们的试剂盒。本发明提供的方法操作简单快速，特异性好、灵敏度高、准确性高、通量高、检测成本低，具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102943120SQ20121052770
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者刘建云 申请人:北京明谛生物医药科技有限公司