专利名称：一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种检测荧光定量RT-PCR试剂盒，具体涉及一种一步法检测人杯状病毒的三重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。
背景技术：
人杯状病毒(Human calicivirus, HuCVs)是引起儿童和成人非菌性急性腹湾的主要病原之一，仅次于轮状病毒。它传染性强，在世界各地广泛传播，尤其是对婴幼儿健康影响较大。最早发现的人杯状病毒是由美国学者Kapikin于1972年采用免疫电镜方法从俄亥俄州诺瓦克地区一所学校暴发的胃肠炎病人粪便标本中检出，并以发现地将其命名为诺瓦克病毒。此后，人杯状病毒在世界各地不断被发现，根据病毒形态结构、抗原特性、宿主范围和所致疾病的临床症状，以及病毒基因组序列和和遗传进化分析的结果进行病毒分类，2002年8月第八次ICTV确定人杯状病毒包括两个属诺如病毒属(Norovirus，NV)和札如病毒属(sapovirus, SV)。诺如病毒毒株间具有很大核苷酸序列多样性，依据基因结构ORFl和0RF2之间的差异，诺如病毒分为5个基因组(G1-GV)，其中GI (以nonvalk-like virus为代表)和GII (以Snow Mountain virus为代表)是感染人类的两个最常见的基因组。札如病毒即札幌病毒，为单股正链RNA病毒，其原型毒株最早为1977年日本学者Chiba等从札幌某托儿所一系列的腹泻爆发研究中所证实。此类病毒所致疾病主要与人和动物的胃肠炎有关，不同年龄段人群都可感染，引起腹泻，主要以婴幼儿最为易感。札如病毒主要经粪-口途径传播，在有些地区，札如病毒逐渐成为仅次于诺如病毒引起病毒性腹泻的主要病因。由于人杯状病毒不 能进行细胞和组织培养，其检测方法的发展受到了很大限制。传统的杯状病毒检测方法主要有电镜、放射免疫试验、酶免疫试验等，但这些方法均不够敏感。随着基因组测序技术的进展，据此建立的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人杯状病毒，使得检测灵敏度大大提高。目前的方法学检测中，RT-PCR方法已成为检测人杯状病毒最敏感、也是应用最广泛的方法。实时荧光定量PCR技术具有全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。但是单管实时荧光定量RT-PCR检测一种病原，不仅耗时耗力，也浪费试剂耗材，因而建立可同时检测多种病原的多重实时荧光定量RT-PCR诊断方法与诊断试剂尤其重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、阴性对照品管、三个标准品管、三个阳性对照品管和盒体组成。其中定量RT-PCR反应液管包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液管包含三种病毒的特异性引物和相应的三种不同荧光标记的探针。阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的阳性质粒样品。引物探针混合液管需为棕色管。三重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下
上游引物 NVG1-F: 5’ - ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
下游引物 NVG1-R :5’ - TCCTTAGACGCCATCATCAITTAC-3’
特异性探针 NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
上游引物 NVGI1-F: 5，-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3，
下游引物 NVGI1-R: 5’ -CGACGCCATCTTCAITCACA-3’
特异性探针 NVGI1-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’
上游引物 SV-F: 5 ’ - CAGGCTCTCGCCACCTACA-3，
下游引物 SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTAIT-3’
特异性探针 SV-P: 5’-ROX- CTTGGITYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’
上述标准品包括GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒标准品，其保守区基因序列如下
GI型诺如病毒病毒标准品序列为
ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA CAGGAGATCGCAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAAGII型诺如病毒病毒标准品序列为
ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG AGCACGTGGGAGGGCGATCG CMTCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA札如病毒标准品序列为
AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG TGGTACAGTACCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG TGTTTGAGAT GGAGGGCAATGGCTCCAACT CAGA。本发明提供的荧光定量试剂盒需保存于-20°c，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件下保存。
本发明的另一个目的是提供上述的一步法三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒在检测GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒中的应用。本发明试剂盒的使用方法在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用高温高压灭菌的DEPC水稀释为IX IO3-1X 108copies/ml。粪便或肛拭子样本核酸的提取取0.2g或200 ml粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置lOmin，以8000r/min离心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，进行核酸提取；肛拭子标本要在标本运输(保存)液中充分搅动(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，可以直接吸取200ul上清加到EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acidextraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNA Stool Mini Kit,按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。核酸的检测取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25 ml，其中定量RT-PCR反应液12. 5 ml，酶混合液I ml，引物探针混合液(20 y mol/L，包含三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光探针)共4. 5ml，模板5ml，加水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪(或者其他三色荧光以上的PCR仪)上进行检测，反应参数为反转录50°C，30min ;95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行三重荧光检测，共进行40个循环。突光定量结果报告①GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒检测的各自CT值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。②检测样本Ct值< 35时报告为相应病毒阳性。③检测样本Ct值> 35且小于40的样本,建议复检，复检结果Ct值< 37者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本各种病毒的量(copies/ml)。本发明的有益之处是运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒高度特异的引物和荧光标记探针，开发研制用于GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从粪便或肛拭子标本中同时检测出是否有GI型诺如病毒、GII型诺如病毒或札如病毒存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更便捷迅速。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，对临床上病毒性腹泻的患者，提供早期明确诊断，区分病毒感染的种类及滴度，为临床治疗方案的制定提供参考依据；同时还可应用于病毒性腹泻中杯状病毒分子流行病学的研究。在同一个反应管内同时检测急性腹泻患者粪便或者肛拭子标本中包括GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒三种主要杯状病毒核酸检测方法，可应用于GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒引起暴发疫情的实验室应急诊断和临床诊断以及病毒性腹泻中杯状病毒分子流行病学的研究。本发明采用的单管一步法三重实时荧光定量RT-PCR，能够一管内一次反应同时检测出GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒，相比传统的单管单病原实时荧光定量RT-PCR方法，不仅大大的节省了试剂耗材、检测时间，而且同样具备较高的特异性和灵敏度。
图1为本试剂盒结构示意图。图2为本试剂盒同时检测三种病毒阳性的实例，其中I为GI型诺如病毒、2为GII型诺如病毒、3为札如病毒。
图3为本试剂盒检测GI型诺如病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107, 106,
105、104、103copies/ml。图4为本试剂盒GI型诺如病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图,其中Lane 1-6分别为GI型诺如病毒标准品(108copies/ml)十倍梯度稀释后实时突光定量 RT-PCR 产物，Lane 7 为阴性对照，Lane M 为 DL2000 Marker。图5为本试剂盒GI型诺如病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。图6为本试剂盒检测GII型诺如病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107、
106、105、104、103copies/ml。
图7为本试剂盒GII型诺如病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图,其中Lane 1_6分别为GII型诺如病毒标准品(108copies/ml)十倍梯度稀释后实时突光定量 RT-PCR 产物，Lane 7 为阴性对照，Lane M 为 DL2000 Marker。图8为本试剂盒GII型诺如病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。图9为本试剂盒检测札如病毒的灵敏度，从左到右(1-6)依次为108、107、106、105、104>IO3 copies/ml。图10为本试剂盒札如病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane 1-6分别为GI型诺如病毒标准品(108COpieS/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR 产物，Lane 7 为阴性对照，Lane M 为 DL2000 Marker。图11为本试剂盒札如病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施例方式本发明结合下面具体实施例和附图作进一步说明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。实施例1
参见图1，一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管1、酶混合液管2、引物探针混合液管3、阴性对照品管4、三个标准品管5、三个阳性对照品管6和盒体7`组成。其中定量RT-PCR反应液管I包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；酶混合物管2包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液管3包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光标记的探针；三个标准品管5分别放置GI型诺如病毒标准品、GII型诺如病毒标准品、札如病毒标准品；三个阳性对照品管6分别放置GI型诺如病毒阳性对照品、GII型诺如病毒阳性对照品、札如病毒阳性对照品。阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的阳性质粒样品。本试剂盒需保存于-20°C，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件下保存。引物探针混合液管3为棕色管。三重荧光定量PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下 上游引物 NVG1-F: 5’ - ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
下游引物 NVG1-R :5’ - TCCTTAGACGCCATCATCAITTAC-3’
特异性探针 NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
上游引物 NVGI1-F: 5，-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3，
下游引物 NVGI1-R: 5’ -CGACGCCATCTTCAITCACA-3’
特异性探针 NVGI1-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’
上游引物 SV-F: 5 ’ - CAGGCTCTCGCCACCTACA-3，
下游引物 SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTAIT-3’
特异性探针 SV-P: 5’-ROX- CTTGGITYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’
所述的二种标准品基因序列如下GI型诺如病毒病毒标准品序列为
ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA CAGGAGATCGCAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA GGACGCCCCT CAAAGCGCTG ATGGCGCAAGII型诺如病毒病毒标准品序列为
ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG AGCACGTGGGAGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA TGGCGTCGAA TGACGCCACT CCATCTAA札如病毒标准品序列为
AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG TGGTACAGTACCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG TGTTTGAGAT GGAGGGCAATGGCTCCAACT CAGA 。实施例2
I材料与方法1.1临床标本与病毒核酸
GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院以及浙江省内其他几家医院腹泻患者的粪便或肛拭子标本，样本采集后运送到实验室。阳性核酸均通过基因测序确认。1. 2引物与探针
从美国的NCBI基因库上下载了涵盖国内外GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的多条基因序列。利用DNAman软 件对其进行了同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3. 0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针，弓丨物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。引物和探针序列如下，
上游引物 NVG1-F: 5’ - ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’
下游引物 NVG1-R :5’ - TCCTTAGACGCCATCATCAITTAC-3’
特异性探针 NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’
上游引物 NVGI1-F: 5，-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3，
下游引物 NVGI1-R: 5’ -CGACGCCATCTTCAITCACA-3’
特异性探针 NVGI1-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’
上游引物 SV-F: 5 ’ - CAGGCTCTCGCCACCTACA-3，
下游引物 SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTAIT-3’
特异性探针 SV-P: 5’-ROX- CTTGGITYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’
以上引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成。1. 3病毒核酸的提取与标准品定量标准
取0. 2g或200 ml粪便样本加到EP管中，加入1. 5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置lOmin，以8000r/min离心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，采用 Geneaid 公司的 Viral Nucleic Acid extraction KitII 或 QIAGEN 公司的 QIAamp DNAStool Mini KU，按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。合成各病毒基因标准品片段，将其连接到质粒载体PMDTM19-T Simple Vector (TaKaRa公司)上。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA,利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。1. 4三重实时荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化
反应总体积为25 ml，其中定量RT-PCR反应液12. 5 ml，酶混合液I ml，引物探针混合液(20 iimol/1，包含四种病毒的特异性引物和相应的三种种荧光探针)共4. 5ml，模板5ml，DEPC水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为反转录500C , 30min ；95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行三重荧光检测，共进行40个循环。结果判断选择荧光检测模式FAM、HEX、R0X荧光基线调整取3_15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从I 20 ii M，探针浓度从I 20 ii M，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ARn)选择最佳引物和探针浓度。1. 5三重实时荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
选择GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的阳性核酸(均通过基因测序鉴定)和近期来源于浙江省多家医院的临床样本提取核酸，用GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三重实时荧光定量RT-PCR方法验证方法的特异性；利用传染病诊治国家重点实验室分离保存的轮状病毒、星状病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、CoxB病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等毒株，提取核酸后用本试剂盒检测，验证其是否存在交叉反应。对已标定拷贝数(copies/ml)的GI型诺如病毒(108copies/ml)、GII型诺如病毒(108copies/ml)和札如病毒(108COpieS/ml)分别稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度，并据此建立检测的标准曲线。此外，对每一个指定浓度的阳性核酸稀释液作6次重复检测，得到的Ct值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。2.结果
2.1三重实时荧光定量RT-PCR反应体系及条件
该方法的反应总体积为25 ml，其中其中定量RT-PCR反应液12. 5 ml，酶混合液I ml，引物探针混合液(20i!mOl/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的四种种荧光探针)共
4.5ml，模板5ml，DEPC水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为反转录50°C，30min ;95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行三重荧光检测，共进行40个循环。可获得最低Ct值和最高荧光强度。2. 2特异性试验
本发明建立的一步法三重荧光定量RT-PCR方法对GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒具有较好的特异性，近期采集的临床标本也检测出阳性反应。GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒引物探针与其他病毒如轮状病毒、星状病毒、腺病毒、EV71、CoxA16、CoxB病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均无交叉反应。该方法同时检测三种病毒阳性的结果参见图2，其中I为GI型诺如病毒，2为GII型诺如病毒，3为札如病毒。2.3敏感性试验。
对GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒敏感性检测试验，将已标定拷贝数(copies/ml)的GI型诺如病毒(108copies/ml)、GII型诺如病毒(108copies/ml)和札如病毒(108COpieS/ml)分别十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测，结果该方法检测敏感性分别达到103、103、103和103copies/ml。结果参见图3、图6、图9。取实时荧光定量RT-PCR产物5ml，120V电压电泳20min，凝胶成像系统拍照。结果参见图4、图7、图10。其中Lane 1-6分别为各组病毒(108copies/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照,Lane M为DL2000 Marker。根据其检测灵敏度，建立各病毒检测的标准曲线。其中图5为检测GI型诺如病毒的标准曲线(斜率=-3. 745，R2=O. 998)，图8为检测GII型诺如病毒的标准曲线(斜率=-4. 306, R2=O. 999)、图11为检测札如病毒的标准曲线(斜率=_3. 717，R2=O. 998)。2. 4重复性试验
分别取GI型诺如病毒(终浓度为106copies/ml)、GII型诺如病毒(106copies/ml)、札如病毒(106copies/ml)，按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作6个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0. 155 0. 363之间，变异系数均低于1. 275%，具有较好的重复性(结果参见表I)。
权利要求
1.一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管(I)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、三个标准品管(5 )、三个阳性对照品管(6 )和盒体(7 )组成，其中定量RT-PCR反应液管(I)包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物管(2)包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液管(3)包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光标记的探针；三个标准品管(5)分别放置GI型诺如病毒标准品、GII型诺如病毒标准品、札如病毒标准品；三个阳性对照品管(6)分别放置GI型诺如病毒阳性对照品、GII型诺如病毒阳性对照品、札如病毒阳性对照品；阴性对照管(4)包含高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，三个阳性对照品分别为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品； 检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下 上游引物 NVG1-F: 5’ - ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’下游引物 NVG1-R :5’ - TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’ 特异性探针 NVG1-P: 5’ -FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’ 上游引物 NVGI1-F: 5，-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3， 下游引物 NVGI1-R: 5’ -CGACGCCATCTTCATTCACA-3’ 特异性探针 NVGI1-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA-BHQ1-3’上游引物 SV-F: 5 ’ - CAGGCTCTCGCCACCTACA-3， 下游引物 SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3’ 特异性探针 SV-P: 5’-ROX- CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’ 所述的二种标准品基因序列如下 GI型诺如病毒病毒标准品序列为 ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA CAGGAGATCGCAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA GGACGCCCCT CAAAGCGCTGATGGCGCAA GII型诺如病毒病毒标准品序列为 ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG AGCACGTGGGAGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA TGGCGTCGAA TGACGCCACTCCATCTAA 札如病毒标准品序列为 AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG TGGTACAGTACCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG TGTTTGAGAT GGAGGGCAATGGCTCCAACT CAGA 。
2.根据权利要求1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，引物探针混合液管(3 )为棕色管。
3.根据权利I所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，其特异性的荧光探针5’端为包括FAM、HEX、R0X、CY5或CY3的荧光报告基团，3’端为包括BHQ1、BHQ2或BHQ3的荧光淬灭基团。
4.根据权利I所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，其阴性对照为高温高压灭菌的DEPC焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品。
5.根据权利I所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒保存于_20°C。
6.根据权利要求1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒在检测GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒中的应用。
全文摘要
本发明提供一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、阴性对照品管、三个标准品管、三个阳性对照品管和盒体组成。标准品为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒标准品。对照品为阳性和阴性对照品。本发明试剂盒根据GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法三重实时荧光定量RT-PCR技术，可以从标本中准确检测出GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒。试剂盒设计合理，操作简便、快速和准确。
文档编号C12Q1/70GK103031386SQ20121052681
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者陈瑜, 李兰娟, 谢国良, 崔大伟 申请人:浙江大学