一种适用于兔病毒性出血症蜂胶灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种适用于兔病毒性出血症蜂胶灭活疫苗的制备方法，属于生物制药领域。
发明背景
[0002]兔病毒性出血症又称兔瘟，是由兔病毒性出血症病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，以呼吸系统出血、肝脏坏死、实质脏器水肿、瘀血、出血和高死亡率为特性。本病于1984年首次发现于我国江苏省，迅速蔓延至全国，之后世界各地均有发生。本病常爆发性流行，发病率及死亡率极高，给兔业养殖带来了巨大危害，是目前规模化兔场的主要传染病之一。兔病毒性出血症病毒属杯状病毒科。本病毒仅能凝集人的“O”型红细胞，而不凝集马、牛、羊、犬、猪、鸡、鸭、兔、大鼠、豚鼠和仓鼠的红细胞，这种凝集特性比较稳定，在一定范围内不受温度、PH值、有机溶剂及某些无机离子的影响，但可以被RHDV抗血清特异性抑制。该病毒只有一种血清型。该病毒在病兔的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中存在，尤其以肝、脾、肾、肺以及血液中含量最高。目前该病毒尚不能在各种原代或传代细胞中繁殖。且该病毒能够抵抗多种极端环境，包括低PH、高温和反复冻融，使其能够在自然环境中保持稳定。
[0003]1984年，南京农业大学教研组提出了使用组织灭能苗加入氢氧化铝或弗氏不完全佐剂紧急预防接种以控制疫情的方法，并收到了较好效果。同年，江苏农学院利用兔瘟华西系强毒HC-84毒株接种易感兔，取病死兔的肝、脾、肾作为制苗材料，将材料无菌捣碎，用生理盐水1:10稀释后过滤，加福尔马林溶液充分混匀、灭能，制得“兔瘟”疫苗。该疫苗免疫期为6个月。目前最好预防措施就是采取上述脏器灭活疫苗进行免疫。
[0004]蜂胶以其免疫防御、免疫自稳、免疫监视等方面的优势功能迅速成为当前佐剂开发热潮中的一支新军。而其在畜禽用疫苗领域的应用昭示其存在巨大的市场前景。蜂胶含有大量的类黄酮(黄酮、黄酮醇和黄烷酮)、芳香酸、脂族酸及其酯，以及萜烯类物质，是一种具有广谱生物学活性和免疫增强作用的天然物质，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫功能和促进组织再生等作用，这些特性使得蜂胶作为佐剂能快速、高效、持久的增强疫苗免疫效果，为疫苗提供绿色、环保、安全的佐剂功效。由于蜂胶具有良好的防腐抑菌效果，在制备兔病毒性出血症灭活疫苗的过程中严格各项操作，疫苗中未添加硫柳汞等防腐剂，减少疫苗中外源物质的引入，增加疫苗的安全性。蜂胶疫苗的特殊超微结构使得其结构稳定，耐热抗冷，提前中和抗体的产生，延长免疫保护期等一系列优点。张君等人在实验室内用蜂胶佐剂制备的灭活疫苗与用其他佐剂制备的灭活疫苗同时免疫家兔，并进行了攻毒试验，结果表明，加入蜂胶的疫苗家兔全部健活，而后组全部死亡，体现较好的生理作用。
[0005]综上，本发明的目的在于分离及培育一种毒力稳定的强毒毒株，并加入优质蜂胶与之混合来制备灭活疫苗。
【发明内容】
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[0006]本发明提供一种兔病毒性出血症蜂胶灭活疫苗，该疫苗副作用小，免疫效果可达90%以上，具有较好的免疫安全性。
[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]—种兔病毒性出血症灭活疫苗，包括抗原和佐剂，所述抗原为兔病毒性出血症CVCCAV272菌株，所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8-15mg，还包括l-3mg的黄芪多糖。
[0009]根据本发明，所述疫苗中不含有硫柳汞。
[0010]—种如上述任一项所述的兔病毒出血症蜂胶灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0011]1.兔病毒性出血症强毒毒株CVCC AV272菌株的选育；
[0012](I)无菌采集免病毒性出血症病死兔肝脏，置无菌的玻璃研磨器中，边研磨，边按质量比10%加入无菌生理盐水制备成匀浆，用5号筛过滤。冻融3次后，加入青链霉素各1000IU/mL，3000r/min离心20min，吸取上清液，分装入无菌小玻璃瓶，低温冰箱(_20°C )中保存。
[0013](2)将制备的兔肝组织病毒悬液用无菌生理盐水在96孔“V”型板上连续倍比稀释进行血凝价的测定，以红细胞100%凝集的最高稀释度作为判定终点
[0014](3)将分尚的兔病毒性出血症各毒株，用生理盐水分别稀释为4个血凝单位的病毒悬液，各病毒分尚株分别与等量的抗兔病毒性出血症病毒特异性血清充分混勾，37°C作用30min，期间振摇2?3次，同时设阳性对照组和阴性对照组。中和完毕后，将以上各组各加入一排96孔“V”型板上，每孔25 μ L，然后于每孔中再加入25 μ L人“O”型红细胞，充分振荡后37°C作用30min，观察结果。
[0015](4)将各毒株分别作10 \10 2、10 3、10 4、10 5倍稀释，分别接种50?55日龄健康易感兔5只，颈部皮下注射1.0mL/只，连续观察10天，记录攻毒试验兔发病及死亡情况。
[0016](5)选取兔病毒性出血症病毒分离株中毒力较强毒株，制备灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取50?55日龄健康易感兔10只，颈部皮下注射灭活疫苗1.0mL/只，14天后，连同条件相同的对照兔5只，各颈部皮下注射1: 10稀释的兔病毒性出血症病毒分尚株病毒液
1.0mL/只，观察10天，记录对照组及免疫组试验兔免疫保护及发病死亡情况。
[0017]根据上述实验筛选出HA血凝效价高、兔病毒性出血症病毒毒力最强及免疫原性好的纯净毒株CVCC AV272菌株，用该毒株制备的灭活组织疫苗。
[0018]2.将选育的毒株CVCC AV272菌株接种易感兔，剖取肝脏组织，加入优选的蜂胶乙醇浸出液，按照常规方法进行灭活疫苗的制备，具体步骤如下:按每毫升疫苗中含兔病毒性出血症病理组织多0.05g，蜂胶干物质含量为8?15mg，黄芪多糖l_3mg的标准，根据预配苗的总量、兔病毒性出血症病理组织量以及蜂胶乙醇浸出液的浓度，分别计算出所需兔病毒性出血症病理组织悬液、蜂胶乙醇浸出液及注射用水的量。先将所需量的注射用水置配苗乳化罐中，然后加入所需量的兔病毒性出血症病理组织悬液低速(2000rpm)搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，2000rpm搅拌15?20分钟，使其充分混合乳化。
[0019]本发明中的兔病毒性出血症病毒CVCC AV272菌株是发明人自全国各地区养殖场疑似兔病毒性出血症的病死兔中分离的自然感染毒，从血凝价、特异性、毒力、免疫原性、纯净性方面进行鉴定，筛选出的毒力强、免疫原性好、血凝价高的菌株。
[0020]优选地，每晕升兔病毒性出血症灭活疫苗中含有0.05g兔病毒性出血症肝脏病理组织(HA彡1:256)，蜂胶干物质8-15mg，黄芪多糖l_3mg。
[0021]优选地，在制造疫苗时，将兔病毒性出血症病毒CVCC AV272菌株用生理盐水作10倍稀释，接种50-55日龄健康易感家兔，每只颈部皮下注射1.0mL/只，无菌采集接种后12-72小时以内死亡时间在I小时内家兔的具有典型病理变化的肝脏组织，剔除肝脏周围的结缔组织。
[0022]优选地，在无菌采集接种后12-72小时以内死亡时间在I小时内家兔的具有典型病理变化的肝脏，并剔除肝脏周围的结缔组织。
[0023]优选地，家兔选自50-55日龄的兔病毒出血症抗体为阴性的兔种。
[0024]优选地，将剔除结缔组织的死亡家兔的肝脏组织用灭菌生理盐水捣碎，研磨、过滤后配成组织悬液，兔病毒性出血症病理组织与灭菌生理盐水的比例为1:9 (W/V)，低温冰箱(-2