专利名称：一种PolyHb-rPA复合体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种PolyHb-rPA复合体及其制备方法和应用,通过戊二醛交联牛血红蛋白与瑞替普酶生成PolyHb-rPA复合体，以制备一种具有治疗意义的溶栓药物的方法。
背景技术：
瑞替普酶(Reteplase, r-ΡΑ)是治疗急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的首选药物，r-PA是人类组织型纤溶酶原激活物(t_PA)的一部份，与其他溶栓药物相比，r-PA具有疗效显著，起效迅速，使用方便(可静脉推注)，不良反应小等优点。但目前t-PA价格较高，而且由于其体内半衰期较短(11-19分钟，重组t-PA约为5分钟)，为维持有效浓度首次静脉推注后，必须要间隔30分钟再次注射，给药方式不当会造成存在出血的危险性，从而限制了 r-PA在临床上的广泛使用。发明内容
本发明的目的就是针对上述缺陷而提供一种PolyHb-rPA复合体及其制备方法和应用，将瑞替普酶(r-PA)与高纯度的牛血红蛋白(Hb)用戊二醛交联起来，形成PolyHb-rPA 复合体。从而有效提高了静脉推注后r-PA体内的稳定性和半衰期。
本发明的一种PolyHb-rPA复合体及其制备方法和应用技术方案为一种 PolyHb-rPA复合体,该复合体是通过戍二醒交联血红蛋白与瑞替普酶生成。
所述的血红蛋白为牛血红蛋白。
所述的PolyHb-rPA复合体的制备方法，包括如下操作步骤(1)无基质血红蛋白的制备新鲜牛血红细胞离心分离去除血浆和中层白细胞，于磷酸钾缓冲液中裂解，溶血液中脂类基质通过甲苯萃取两次去除，离子交换层析，超滤得到纯化的无基质血红蛋白溶液；(2)血红蛋白与瑞替普酶交联的多聚PolyHb-r-PA复合体的制备向纯化的血红蛋白溶液中加入r-PA，血红蛋白与瑞替普酶的比例(mg/IU)为5(Γ500:1的比例；交联前将赖氨酸血红蛋白以摩尔比10 1加入1. 3 M赖氨酸振荡I小时，然后将戊二醛血红蛋白以摩尔比17 :1加入0. 5 M戊二醛，交联10-24小时，以HPLC监测分子交联程度，当达到所需交联程度后，向溶液中加入2 M赖氨酸溶液终止交联反应；Lactate Ringer溶液过夜透析后， 通过Sephadex G_25色谱柱脱除过量的修饰剂和其他的小分子物质；操作过程在4°C，通氮气保护环境下进行。
步骤(2)中向纯化的血红蛋白溶液中加入瑞替普酶，血红蛋白与瑞替普酶的比例 (mg/IU)为 50:1、100:1、200:1、300:1、400:1 或 500:1。
步骤(2)中向纯化的血红蛋白溶液中加入瑞替普酶，血红蛋白与瑞替普酶的比例 (mg/IU)为 100:1。
一种上述的PolyHb-rPA复合体作为一种溶栓药物的应用。
本发明的有益效果为本发明将瑞替普酶(r-PA)与高纯度的牛血红蛋白(Hb)用戊二醛交联起来，形成PolyHb-rPA复合体。从而有效提高了静脉推注后r-ΡΑ体内的稳定性和半衰期交联后分子量增大的血红蛋白可在血红蛋白浓度较高时仍保持低渗透压，而且保持了较好的运输氧的功能，牛血红蛋白免疫原性低，而且比人血红蛋白更稳定，并且不需要2，3- 二磷酸甘油酸(2，3-DPG)来调节载氧能力，聚合后其P5tl值接近天然血红蛋白。交联复合物PolyHb-rPA比血液中的红细胞体积小上百倍，PolyHb-rPA中的血红蛋白可通过血栓形成初期变得狭窄的毛细血管，给栓塞后的缺血组织供氧。r-PA与血红蛋白交联后半衰期延长，增加了降低用药剂量的可能性，从而降低了出血的风险。
图1所示为用双功能试剂戊二醛交联r-PA与血红蛋白(Hb)后对r_PA的酶活性的影响；图2所示为大鼠静脉推注与血红蛋白(Hb)交联的r-PA以及未与血红蛋白(Hb)交联的r-PA的体内半衰期比较。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
在下述实施例中所给出的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。其中所用试剂均有市售。
实施例1 :PolyHb-rPA复合体的制备一、无基质血红蛋白(Hb)的制备无基质血红蛋白是通过低渗溶牛血红细胞，并通过甲苯抽提、高速离心净化、离子交换层析来制得。最终溶液含有O. 1-0. 15 g/mL血红蛋白。为了减少高铁血红蛋白的形成，操作过程在4°C，通氮气环境下进行，血红蛋白溶液的pH值为7. 4。
(I)、牛血红细胞的分离取新鲜牛血分装入数个无菌处理过的离心管中，4000|离心10分钟。取出后，吸出上层血浆和中层白细胞，下层红细胞以O. 9%生理盐水混匀，4000呀·离心10分钟。弃上清液， 下层红细胞再以生理盐水洗涤，重复三次，获得红细胞。
(2)、红细胞的裂解和离心去基质将所获洗涤红细胞与12. 5 mM、pH 7. 4的磷酸钾缓冲液以体积比1:2充分混匀，静置 30分钟裂解红细胞，得到红细胞溶血液。溶血液中脂类基质通过加入1/2体积冰冷的甲苯萃取两次去除。再将溶血液倒入高速离心容器中，15000|离心2小时去除细胞碎片，取上清血红蛋白溶液作进一步处理。
(3)、血红蛋白的纯化上清血红蛋白溶液以50 mM、pH 7. 4的磷酸钾缓冲液平衡后进行离子交换层析，洗脱收集后进行超滤处理，滤出限30KDa，最后得到纯化的无基质血红蛋白溶液。
二、血红蛋白与瑞替普酶(r-PA)交联的多聚PolyHb-r-PA复合体的制备瑞替普酶(r-PA)为德国宝灵曼公司产品，商品名Retevase，使用时先用注射用水溶解稀释，稀释时用专用溶媒。溶媒组成1 mmol/LPB (p H 6. 5),鹿糖50 mg/mL, Tween-80O.005%。
以Hb/r-PA为100:1的比例向纯化的血红蛋白溶液中加入r_PA。交联前以摩尔比 (赖氨酸血红蛋白)10 :1加入1. 3 M赖氨酸振荡I小时，然后以摩尔比17 :1 (戊二醛血红蛋白)加入O. 5 M戊二醒，交联10-24小时，以HPLC监测分子交联程度，当达到所需交联程度后，向溶液中加入2 M赖氨酸溶液终止交联反应。Lactate Ringer溶液过夜透析后，通过Sephadex G_25色谱柱脱除过量的修饰剂和其他的小分子物质。操作过程在4°C,通氮气保护环境下进行。
实施例2 :瑞替普酶(r-PA)的活性检测及大鼠体内半衰期测定一、瑞替普酶(r-PA)的活性检测称取125 mg琼脂糖，加入23 mL生理盐水溶液，煮沸溶解，60°C水浴平衡；加凝血酶 5 mL (100 u/mL),纤溶酶原100 μ L (O. 5 mg/mL),边加边摇勻；加I mL人纤维蛋白原(5 mg/mL),不停地摇匀；混浊后立即倒平皿(直径8 cm)，水平放置充分凝固后4°C放置至少30 min待用。对照品用生理盐水稀释不同稀释度。同时用溶媒作空白对照。在形成的纤维蛋白平皿内打孔(直径2 mm)，每孔点样10 mL，每个待检样品和标准品各点2个孔，37°C湿盒水平放置24 h。纵横2次量取溶圈直径，以各稀释度活性的对数为横坐标Cr)，以溶圈直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标00，按生物统计学方法分析结果，求得= a + b z中的a和b及线性回归系数r值，根据待检样品的溶圈直径求得待检样品的活性。
二、瑞替普酶(r-PA)静脉推注大鼠体内半衰期测定将体重为220-250g的健康雄性Wistar大鼠(山东大学实验动物中心)用戊巴比妥钠 (药物浓度为50mg/mL)按O. 2mL/kg体重腹腔注射麻醉后，股静脉分离后插入聚乙烯套管， 静脉推注后间隔取血样，IOOO^离心IOmin得血浆，检测r-ΡΑ浓度。
三、结果与分析结果如说明书附1、图2所示，与血红蛋白(Hb)交联的r-PA的活性降低至初始活性的30%-55% ;而其在大鼠体内的半衰期则从9. 6分钟延长至15. 9分钟。表明PolyHb-rPA 复合体相对于r-PA的溶栓作用更为持久，也降低了 r-PA导致出血的可能性。
实施例3 PolyHb-rPA复合体对体内诱发形成血栓的快速溶栓作用一、 PolyHb-rPA胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成的的保护 清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18 20g(山东大学实验动物中心)，将胶原蛋白用生理盐水充分浸泡、匀衆，浓度为1. O mg/mL,然后加入肾上腺素40 μ g/mL混匀，即为诱导剂； 将受试药用诱导剂配成不同浓度等体积的溶液，小鼠尾静脉注射，给药体积O.1 mL/10g(体重)。注射给药后立即观察5 min之内小鼠死亡数和15 min内小鼠偏瘫的恢复数。计算药物对小鼠脑血栓的保护率，确切概率法统计分析。结果如下表。表I PolyHb-rPA对小鼠体内血检形成的保4户
权利要求
1.一种PolyHb-rPA复合体,其特征在于,该复合体是通过戍二醒交联血红蛋白与瑞替普酶生成。
2.根据权利要求1所述的一种PolyHb-rPA复合体，其特征在于，所述的血红蛋白为牛血红蛋白。
3.—种如权利要求1或2所述的PolyHb-rPA复合体的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤 (1)无基质血红蛋白的制备新鲜牛血红细胞离心分离去除血浆和中层白细胞，于磷酸钾缓冲液中裂解，溶血液中脂类基质通过甲苯萃取两次去除，离子交换层析，超滤得到纯化的无基质血红蛋白溶液； (2)血红蛋白与瑞替普酶交联的多聚PolyHb-r-PA复合体的制备向纯化的血红蛋白溶液中加入瑞替普酶，血红蛋白与瑞替普酶的比例(mg/IU)为5(Γ500:1 ;交联前将赖氨酸血红蛋白以摩尔比10 1加入1. 3 M赖氨酸振荡I小时，然后将戊二醛血红蛋白以摩尔比17 :1加入O. 5 M戊二醛，交联10-24小时，以HPLC监测分子交联程度，当达到所需交联程度后，向溶液中加入2 M赖氨酸溶液终止交联反应；Lactate Ringer溶液过夜透析后,通过Sephadex G_25色谱柱脱除过量的修饰剂和其他的小分子物质；操作过程在4°C，通氮气保护环境下进行。
4.根据权利要求3所述的PolyHb-rPA复合体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中向纯化的血红蛋白溶液中加入瑞替普酶，血红蛋白与瑞替普酶的比例(mg/IU)为50:1、100:1、200:1、300:1、400:1 或 500:1。
5.根据权利要求3所述的PolyHb-rPA复合体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中向纯化的血红蛋白溶液中加入瑞替普酶，血红蛋白与瑞替普酶的比例(mg/IU)为100:1。
6.一种如权利要求1或2所述的PolyHb-rPA复合体作为一种溶栓药物的应用。
全文摘要
一种PolyHb-rPA复合体及其制备方法和应用，将瑞替普酶(r-PA)与高纯度的牛血红蛋白(Hb)用戊二醛交联起来，形成PolyHb-rPA复合体。从而有效提高了静脉推注后r-PA体内的稳定性和半衰期。交联复合物PolyHb-rPA比血液中的红细胞体积小上百倍，PolyHb-rPA中的血红蛋白可通过血栓形成初期变得狭窄的毛细血管，给栓塞后的缺血组织供氧。r-PA与血红蛋白交联后半衰期延长，活性下降，作用更加稳定持久，从而降低了出血的风险。
文档编号C12N9/96GK103045576SQ20121052704
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者谷劲松, 王革 申请人:谷劲松, 王革