专利名称：一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种环糊精糖基转移酶及制备方法，特别是一种麦芽糊精底物特异性提闻的环糊精糖基转移酶及其制备方法。
背景技术：
L-抗坏血酸(L-AA，维生素C)是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗坏血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α -1, 4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _环糊精或β _环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体(如麦芽糊精)将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)对麦芽糊精的底物特异性(转化率)较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对麦芽糊精的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或其组合。所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以Genbank AF047363.1公布的基因为出发基因，将第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或将其组合进行双突变或三突变。产所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下I)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；2)将步骤I)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21得到基因工程菌。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100 μ g/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30°C摇床培养至0D_=0. 6，加入O. OlmM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25°C摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4°C、IOOOOrpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。软化类芽孢杆菌(Peanibacillusmacerans) JFB05-01 (CCTCC NO :M208063)，已在中国专利CN101294149公开，
公开日2008年10月29日。来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGTase)的三种突变体酶Y195S，Y260R及Q265K，它们相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G时，产量分别提高23%，44%和40%。Peanibacillus macerans JFB05_01CGTase 的三种双突变体酶 Y195S/Y260R, Y195S/Q265K和Y260R/Q265K，相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量分别提高了 57%，49%和55%。
Peanibacillus macerans JFB05_01CGTase 的一种三点突变体酶 Y195S/Y260R/Q265K，其特征是将双突变体酶Y195S/Y260R基因中第265位的谷氨酰胺Gln突变成了精氨酸赖氨酸Lys，命名为Y195S/Y260R/Q265K。相比于野生型CGTase利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量提高了 59%。本发明的有益效果本发明构建了 7个有意义的突变体，均实现了环糊精糖基转移酶对麦芽糊精的底物特异性的提高，以此为糖基供体所产AA-2G产量均高于野生型CGTase，更利于AA-2G工业化生产。
图1不同反应时间下野生型CGTase和突变型酶生成AA-2G的产量。■:野生型 CGTase ；· Y260R ；▲ Q265K ；^:Y195S ;〇Y260R/Q265K ；Δ Y260R/Y195S ； :Q265K/Y195S; O :Y260R/Q265K/Y195S。
具体实施例方式实施例1:底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶本发明的环糊精糖基转移酶是在GenBankAF047363.1公布的基因序列基础上，对其3个位点进行氨基酸进行单突变或组合突变获得，具体获得了 7种突变体，分别为Y260R ；Q265K ；Y195S；Y260R/Q265K ；Y260R/Y195S ；Q265K/Y195S ;Y260R/Q265K/Y195S。可以通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的3个位点进行氨基酸的取代。实施例2 :底物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法本例以PCR方法为例进行说明，但被发明的保护并不限于仅通过PCR方法获得突变的方法。突变体酶 Y195S，Y260R, Q265K, Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和Y195S/Y260R/Q265K的制备方法如下I)定点突变单突变体酶Y195S，Y260R及Q265K的定点突变，利用快速突变试剂盒MutanBEST kit,以表达载体 cgt/pET_20b (+)1 (1. Li, Ζ·，B. Li, Z. Gu, G. Du, J. ffu, andJ. Chen.2010.Extracellular expression and biochemical characterization of
alpha-cyclodextrin glycosyltransferasefrom Paenibacillus macerans. CarbohydrRes345:886-892.)为模板，引入Y195S密码子的顶点突变引物为正向引物5’-TACAAGAACCTCTCTGACCTGGC-3’，下划线为突变碱基；反向引物5’-AATACCGTCTTCAATCGTGGAAAAATC-3’；引入Y260R密码子的顶点突变引物为正向引物5’-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3’，下划线为突变碱基；反向引物5’-GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3’；引入Q265K密码子的顶点突变引物为正向引物5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3'，下划线为突变碱基；反向引物5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’。双突变体酶Y195S/Y260R，Y195S/Q265K及Y260R/Q265K的定点突变利用快速突变试剂盒MutanBEST kit，分别以单突变体酶Y195S基因为模板，引入Y260R密码子的定点突变引物为正向引物5’-GGGGAATGGCGTCTTGGCGCGG-3’，下划线为突变碱基；反向引物5’-GAACGTAAATACCGGATGATCGCC-3'；引入Q265K密码子的定点突变引物为正向引物5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3，，下划线为突变碱基；反向引物5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’；以单突变体酶Y260R基因为模板，引入Q265K密码子的定点突变引物为正向引物5’ -CGCGGATAAAACCGACGGAGA-3，，下划线为突变碱基；反向引物5’-CCAAGATACCATTCCCCGAACG-3’。PCR 反应体系均为5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 5 μ L, 2. 5mMdNTPs4 μ L, 10 μ M 正向引物 I μ L，10 μ M 反向引物 I μ L，模板 DNAl μ L，2. 5U/ μ LPrimeSTARTaq HS0. 5 μ L，加入双蒸水至50 μ L ;PCR产物扩增条件均为98 V预变性3min ;随后进行98 V IOs, 62 V 15s，72°C 6min30个循环；最后72°C保温IOmin ；PCR产物经MutanBEST kit处理，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21 (DE3)感受:态细胞，所有质粒均测序正确；2)突变体表达与纯化挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养生长8 10h，按4%接种量将种子发酵液接到含100 μ g/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30°C摇床培养至0D_=0. 6，加入O. OlmM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25°C摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4°C、IOOOOrpm离心20min除菌体，收集上清液。上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4°C、IOOOOrpm离心20min,取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、O. 5M氯化钠、20mM咪唑、pH7. 4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过O. 22 μ m膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速lmL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM··磷酸钠缓冲液(pH=6)中透析过夜后，分别得到纯化突变体酶Y195S，Y260R, Q265K，Y195S/Y260R, Y195S/Q265K, Y260R/Q265K 和 Y195S/Y260R/Q265K。实施例3 :本实施例说明酶活分析及AA-2G的合成及检测。I)酶活测定方法甲基橙法测定α-环化活力的方法取适当稀释的酶液O. lmL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH6. 5)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40°C下反应IOmin后，加入1. OmLl. OM的盐酸停止反应，再加入1. OmL用50mM磷酸缓冲液配制的O.1mM甲基橙，在16°C下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成I μ mol α -环糊精所需酶量。淀粉水解活力测定方法将适量的酶液加入到含1%可溶性淀粉的50mM磷酸缓冲液中(pH6. 5)，50°C反应lOmin，然后用DNS法测定还原糖浓度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成I μ mol还原糖所需酶量。歧化反应活力测定方法将含有6mM供体底物4-硝基苯基-a-D-麦芽庚糖-4-6-0-亚乙基(EPS)和IOmM受体底物麦芽糖的IOmM柠檬酸缓冲液(pH6. O)在50°C保温 IOmin
权利要求
1.一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，以GenbankAF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶为出发序列，其特征在于第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第 260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或其组合。
2.权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶，其特征在于环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽抱杆菌(Peanibacillus macerans)。
3.一种获得权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于以Genbank AF047363.1公布的基因为出发基因，将第195位的酪氨酸突变成丝氨酸Y195S，第260位的酪氨酸突变成精氨酸Y260R，第265位的谷氨酰胺突变成精氨酸赖氨酸Q265K或将其组合进行双突变或三突变。
4.产权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系。
5.权利要求4所述产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；2)将步骤I)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到基因工程菌。
6.权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pET-20b(+)。
7.应用权利要求4所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于以产环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100 μ g/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30°C摇床培养至 OD600=O. 6，加入O. OlmM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25°C摇床继续培养发酵90h后， 将发酵液于4°C、IOOOOrpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
全文摘要
本发明公开了一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明通过对P.macerans strain JFB05-01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的195位的酪氨酸(Tyr)替换为丝氨酸(Ser),260位的酪氨酸(Tyr)替换为精氨酸(Arg),265位的谷氨酰胺(Gln)替换为赖氨酸(Lys)，使AA-2G产量分别提高了23%，44%和40%。对以上突变株组合突变，获得双突变体Y195S/Y260R,Y195S/Q265K和Y260R/Q265K以及三点突变体Y195S/Y260R/Q265K。它们利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G产量分别提高了57%，49%，55%和59%。这些突变株比野生型CGTase更利于利用麦芽糊精为糖基供体生产AA-2G。
文档编号C12N5/10GK102994468SQ201210527869
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日 公开号201210527869.发明者陈坚, 堵国成, 刘龙, 李江华, 韩瑞枝 申请人:江南大学