专利名称：特异性结合西布曲明及去甲基西布曲明的单克隆抗体的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一种去甲基西布曲明人工抗原的制备方 法，并制备能够特异性结合西布曲明及去甲基西布曲明的单克隆抗体。
背景技术：
西布曲明(sibutramine)是Knoll公司于1997年上巿的5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄 取抑制剂其化学名为(± ) N-{1- 〔l-(4-氯苯基)环丁基〕-3-甲基丁基}-^^二甲胺。
西布曲明体内代谢产物的主要作用机制是抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再 摄取，增加突触间隙去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的浓度，作用于中枢神经，加 快新陈代谢和抑制食欲、增加饱感，促进体内的能量消耗，降低血脂水平和胆固醇水 平，临床上用于肥胖症的治疗。
美国食品药品监督管理局(US-FDA)于1997年11月正式批准该药作为治疗肥胖症 的专用药物，并规定须在医生指导下使用。中国食品药品监督管理局(SFDA)于2000 年7月将其作为二类新药批准上巿后，同样规定按处方药管理。没有在医生指导下服 用西布曲明，会产生一系列不良反应和副作用，主要有消化系统、心血管系统、神经 精神系统的不良反应。
另外，服用西布曲明还会产生一些少见的不良反应，主要有肾损害、对性功能的 影响、皮瘆、脱发等等。临床医生在应用西布曲明时，应特别注意对其不良反应的观 察，减少合并用药，禁止在未成年和老年人群中应用，以保证用药者的安全。
但是，有些中药减肥保健品的生产厂家却在产品中非法掺入西药盐酸西布曲明。 为有效地打击这种制假掺伪的不法行为，保障人民群众的用药安全，很有必要建立可 靠的针对非法掺入西药盐酸西布曲明的检测方法。目前，西布曲明以及去甲基西布曲 明的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等等， 但是这些方法设备昂贵、运行费用高、搡作过程复杂，不适用于在基层部门广泛开展。 而且，对于西布曲明药物的结构类似物，其在色谱柱上的运行规律与已知药物大不相 同，容易导致漏检。
发明内容
本发明的目的是使用单克隆抗体技术，制备特异性结合西布曲明及去甲基西布曲 明的单克隆抗体。
本发明具体涉及一种使西布曲明药效必须基团被完整保留并暴露在载体蛋白外部 的西布曲明人工抗原制备方法，以及以此人工免疫抗原、检测抗原为基础，使用杂交 瘤技术筛选、鉴定得到特异性识别西布曲明药效必须基团的单克隆抗体。
要使用杂交瘤技术筛选、鉴定得到特异性识别西布曲明药效必须基团的单克隆抗 体，必须以西布曲明药效基团被完整保留并暴露在载体蛋白外部的人工免疫抗原、检 测抗原为基础。所以，在合成人工抗原的过程中，必须选用西布曲明药效必须基团以外的位点进行化学连接。把小分子药物连接到载体蛋白上，通常要利用小分子药物上 的氨基、羧基、巯基等基团。但是，西布曲明药效必须基团以外的结构中，并不存在 这些基团。选择合适的连接位点，满足合成符合条件的人工抗原的要求。 本发明是通过以下技术方案实现的。
1、 去甲基西布曲明人工免疫抗原的合成。
① 糖基化BSA的制备按照葡萄糖和乳糖与牛血清白蛋白的摩尔比例都为 20-25: 1混合,调节pH到9.0-9.5，在40-42'C摇床反应2小时，还原糖全部通过形成 Schieve键结合到氨基上，完成对载体蛋白的修饰。
② 把修饰化牛血清白蛋白、戊二醛、去甲基西布曲明以1: (25-30): (80-90)的 摩尔比例混合，调节pH到9.0-9.5， 40-42。C反应6-8小时，使去甲基西布曲明通过双 功能试剂连接到载体蛋白上。然后在0.01MPBS(pH7.2-7.4)溶液中4'C充分透析。完成 去甲基西布曲明人工免疫抗原的制备。
2、 去甲基西布曲明人工检测抗原的合成。
把卵清蛋白(OVA)、戊二醛、甲基西布曲明西布曲明以1: ( 15-20): (60-75 )的 摩尔比例混合，调节pH到9.0-9.5, 40-42。C反应6-8小时，使甲基西布曲明通过双功 能试剂连接到载体蛋白上。然后在0.01MPBS(pH7.2-7.4)溶液中4"C充分透析。完成去 甲基西布曲明人工检测抗原的制备。
3、 按照相关文献报道的现有技术，使用西布曲明人工免疫抗原免疫小鼠。
4、 按照相关文献报道的现有技术，用细胞融合杂交瘤技术筛选抗西布曲明单克隆 抗体。
5、 单克隆抗体的结构特异性鉴定
① 使用西布曲明结构类似物去甲基西布曲明，以竞争抑制ELISA方法对每一株 特异性结合西布曲明单克隆抗体进行交叉反应检测；
② 鉴别交叉反应率大的单克隆抗体，就是能够特异性结合西布曲明及其结构类似 物的单克隆抗体。
本发明所述的去甲基西布曲明按现有技术合成。
本发明灵敏度高、特异性强、方便快捷、搡作简单、成本低廉，无需借助昂贵的 设备，很适合在我国广大基层检测部门推广。
附图1为去甲基西布曲明合成路线图。
附图2为去甲基西布曲明人工免疫抗原和人工检测抗原合成路线图。
具体实施例方式
本发明将通过以下实施例作进一步地说明。
具体实施方式
一。去甲基西布曲明合成方法。
①l-(4-氯苯基)环丁腈的制备:将65g4-氯苯乙腈和85gl,3-二溴丙烷溶于120mL 乙醚中，于20 。C充分搅拌下将此溶液慢慢滴入含95g氢氧化钾(细粉)的300mL二甲亚砜悬浮液中。搅拌lh ,将反应物冷却到15 °C，滴加冰水200mL，同时保持温度 不超过20'C。向反应混合物中加250 mL乙醚，用沙芯漏斗过滤。用乙醚洗涤滤渣， 合并滤液和洗涤液，用分液漏斗分出水层，用250m乙醚萃取三次，合并醚层并蒸干。 残余物减压蒸馏得无色油状物。②1- 〔l-(4-氯苯基)环丁基〕-3-甲基丁胺(去甲基 西布曲明)制备将50g 1-(4-氯苯基)环丁腈溶于180mL干燥甲苯中，将此溶液滴入 异丁基溴化镁溶液中，乙醚通过蒸馏除去。混合物在9(TC搅拌18h。稍冷却，将反应 物加到30g热硼氢化钠/ 1000mL异丙醇的悬浮液中，得到的混合物加热回流6h,室 温放置18 h后蒸干溶剂。残余物加1000 mL水混匀，放置30 min,用300mL乙酸乙 酯提取3次。分出酯层用pH4.0盐酸水溶液萃取，分出水层用碳酸钠调节pH到8.0， 用200mL乙酸乙酯提取2次，合并酯层蒸干就得到1- 〔l-(4-氯苯基)环丁基〕-3-甲 基丁胺(去甲基西布曲明)。
具体实施方式
二去甲基西布曲明人工免疫抗原的合成。
① 糖基化BSA的制备按照葡萄糖和乳糖与牛血清白蛋白的摩尔比例都为20: l混合，用O.lM碳酸钠溶液调节pH到9.0,在42。C摇床反应2小时，还原糖全部通 过形成Schieve键结合到氨基上，完成对载体蛋白的修饰。
② 通过戊二醛一步法制备去甲基西布曲明人工免疫抗原把修饰化牛血清白蛋 白、戊二醛、去甲基西布曲明以1: 25: 80的摩尔比例混合，用0.1M碳酸钠溶液调 节pH到9.0, 4(TC反应6小时，使去甲基西布曲明通过双功能试剂连接到载体蛋白上。 然后对0.05MPBS(pH7.2)溶液在4'C透析3天，期间换液10次。完成去甲基西布曲明 人工免疫抗原的制备。
具体实施方式
三去甲基西布曲明人工检测抗原的合成。
把卵清蛋白(OVA)、戊二醛、甲基西布曲明西布曲明以1: 15: 60的摩尔比例混 合，用O.lM碳酸钠溶液调节pH到9.0， 4(TC反应6小时，使甲基西布曲明通过双功 能试剂连接到载体蛋白上。然后对0.05M 880)117.2)溶液在4°(:透析3天，期间换液 10次。完成去甲基西布曲明人工检测抗原的制备。
具体实施方式
五使用西布曲明人工免疫抗原免疫小鼠。
①以西布曲明人工免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射 (100^/0.2mL'只)方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；②初免4周 后，取西布曲明人工免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，对小鼠采用皮下注射加强 免疫(100昭/只)；以后每三周加强免疫l次；③融合前三天，釆用尾静脉注射西布曲 明人工免疫抗原水溶液(50Mg/只)。准备进行细胞融合实验；
具体实施方式
六用细胞融合杂交瘤技术筛选抗西布曲明单克隆抗体。 ①将l x 1()S脾细胞与2x 1(^骨髓瘤细胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM 培养基至30mL。 1000rpm离心7min，将上清尽量吸净；②在手掌上轻击融合管底部， 使沉淀细胞松散均匀，置40。C水洛中预热。用lmL吸管在1分钟内加预热至40。C的 50%PEG (pH8.0) lmL,边加边轻轻摇动混匀。用5mL吸管在90秒内加25mL预热至37。C的不完全DMEM培养基，室温静置10min。 800rpm离心7分钟，弃上清；③ 加入5mLHAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培 养基至卯mL。分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100pL; 培养板置37'C 5%<:02培养箱内培养；④培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内 1/2HAT培养液。培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液； 每天观察杂 交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体 检测；用竟争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗西布曲明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
具体实施方式
七。单克隆抗体的结构特异性鉴别。
① 使用西布曲明结构类似物去甲基西布曲名，以竟争抑制ELISA方法对每一株 特异性结合西布曲明单克隆抗体进行交叉反应检测；
② 鉴别交叉反应率大的单克隆抗体，就是能够特异性结合西布曲明及其结构类似 物的单克隆抗体。
权利要求
1、特异性结合西布曲明及去甲基西布曲明的单克隆抗体的制备，包括人工免疫抗原的合成、人工检测抗原的合成、免疫小鼠、单克隆抗体的筛选、单克隆抗体的结构特异性鉴定，其特征是人工免疫抗原的合成为①糖基化BSA的制备按照葡萄糖和乳糖与牛血清白蛋白的摩尔比例都为20-25∶1混合，调节pH到9.0-9.5，在40-42℃摇床反应2小时；②把修饰化牛血清白蛋白、戊二醛、去甲基西布曲明以1∶(25-30)∶(80-90)的摩尔比例混合，调节pH到9.0-9.5，40-42℃反应6-8小时，然后在pH7.2-7.4、0.01M PBS溶液中4℃充分透析；人工检测抗原的合成为把卵清蛋白、戊二醛、甲基西布曲明西布曲明以1∶(15-20)∶(60-75)的摩尔比例混合，调节pH到9.0-9.5，40-42℃反应6-8小时，然后在pH7.2-7.4，0.01M PBS溶液中4℃充分透析。
全文摘要
特异性结合西布曲明及去甲基西布曲明的单克隆抗体的制备，包括免疫抗原合成、检测抗原合成、免疫小鼠、单克隆抗体筛选、单克隆抗体结构特异性鉴定，免疫抗原合成为①按照葡萄糖和乳糖与牛血清白蛋白的摩尔比都为20-25∶1混合，pH调至9.0-9.5，40-42℃摇床反应2小时；②修饰化牛血清白蛋白、戊二醛、去甲基西布曲明以1∶(25-30)∶(80-90)的摩尔比混合，pH调至9.0-9.5，40-42℃反应6-8小时，pH7.2-7.4、0.01M PBS溶液中4℃充分透析；检测抗原合成为卵清蛋白、戊二醛、甲基西布曲明西布曲明以1∶(15-20)∶(60-75)的摩尔比例混合，pH调至9.0-9.5，40-42℃反应6-8小时，pH7.2-7.4、0.01M PBS溶液中4℃充分透析，本发明灵敏度高、特异性强、方便快捷、操作简单、成本低廉，无需借助昂贵的设备。
文档编号C07K14/435GK101643506SQ20091011582
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者何庆华, 李燕萍, 杨 许, 郭杰标, 黄志兵 申请人:南昌大学